一、韭蛆病原菌cyt基因的克隆及工程菌株的构建（论文文献综述）
苟玉萍[1]（2021）在《异硫氰酸烯丙酯及CO2浓度升高对异迟眼蕈蚊的影响》文中研究表明异迟眼蕈蚊Bradysia impatiens Johannsen食性广,在国外因为害凤仙花Impatiens balsamina而被首次记录,我国最早发现于食用菌和药用菌种植大棚。最近的调查发现,异迟眼蕈蚊对设施蔬菜（韭菜Allium tuberosum、葱Allium fistulosum和蒜A.sativum等）,以及设施瓜果和花卉造成严重危害,在高温高湿的温室环境周年发生,世代重叠。农业生产中最常用的防治方法仍然是以化学农药灌根或直接喷药为主,但长期频繁用药,使异迟眼蕈蚊的抗药性显着增强,用药量进一步增加,导致环境污染严重,而且蔬菜、瓜果等产品农药残留量超标,威胁人们身体健康,因此,生产上对新的绿色防控技术需求很大。新近发现的十字花科植物提取物—异硫氰酸烯丙酯（Allyl isothiocyanate,AITC）因绿色、安全、低毒、低残留、易降解,已广泛用于多种仓储害虫的熏蒸防治,对地下害虫、杂草、线虫和病原菌也具有很好的作用活性。二氧化碳（carbon dioxide,CO2）是调节昆虫呼吸作用的重要气体,浓度升高（?10%）会促进昆虫呼吸,使气门保持永久开放。温室大棚设施内生态环境密闭性较好,能为AITC室内熏蒸和土壤熏蒸防控异迟眼蕈蚊提供良好环境。此外,生产中人们常采取措施对设施作物进行CO2富集,以增强光合作用,提高产量和品质。因此,CO2浓度适当升高对设施作物有利,基于高CO2浓度可以使昆虫气孔保持永久开放,我们将AITC与高CO2混用,以期增强异迟眼蕈蚊对AITC的吸收,达到提高防治效果的目的。本论文从毒理学、生态学、转录组学和代谢组学层面研究了异迟眼蕈蚊对AITC的响应机制;测定了AITC熏蒸剂与高CO2联用对异迟眼蕈蚊的作用活性;从生态学和生理学上探讨了异迟眼蕈蚊对CO2浓度升高的响应方式。得出以下主要结果:1.异硫氰酸烯丙酯（AITC）对异迟眼蕈蚊卵、幼虫、蛹、雌虫和雄虫均有良好的熏蒸活性,尤其对雌、雄成虫效果更明显;AITC对3龄幼虫熏蒸法测得的LC50为10.400μL/L,浸叶胃毒法测得的LC50为13.632μL/L;两种生测法亚致死浓度处理异迟眼蕈蚊3龄幼虫后,幼虫期和蛹期延长,化蛹率和羽化率减小,蛹的重量下降,雌虫繁殖力显着受到抑制,且熏蒸亚致死比浸叶胃毒亚致死对繁殖力的抑制作用更显着。2.AITC处理异迟眼蕈蚊转录组测序结果显示,雌虫体内共出现480个差异表达基因,雄虫体内共出现14856个差异表达基因。通过KEGG数据库的通路富集分析发现:（1）异迟眼蕈雌虫差异表达的上调基因在昆虫激素生物合成通路上显着富集,该通路中保幼激素酯酶（hormone esterase,JHE）基因被诱导上调表达;（2）差异表达的上调基因在药物代谢-细胞色素P450通路、细胞色素P450对外源物质代谢通路和谷胱甘肽代谢通路上也显着富集,而且这些通路出现了一个共同上调表达的基因—谷胱甘肽S转移酶（glutathione S-transferase,GST）基因;（3）通过对JHE基因实时荧光定量PCR（real time quantitative polymerase chain reaction,RT-q PCR）验证,得到的值与转录组数据FPKM值保持一致,证明转录组数据可靠。以上结果表明,AITC引起异迟眼蕈蚊激素、产卵和解毒等多种生物学过程的相关基因表达,其中JHE基因是调控AITC抑制异迟眼蕈蚊产卵的关键基因;GST基因在异迟眼蕈蚊对AITC解毒代谢过程中发挥积极的应答作用。3.AITC处理异迟眼蕈蚊后产生了大量的差异代谢物;采用层次聚类法鉴定共筛选出22种表达量显着上升的代谢物;对这些差异代谢物进行KEGG通路富集分析,有15条通路影响较显着;最终鉴定得到的关键代谢产物主要包括:L-丝氨酸、L-蛋氨酸、L-亮氨酸、L-天冬酰胺、DL-丝氨酸和牛磺酸等氨基酸类物质,这些物质可能与AITC对异迟眼蕈蚊的致病或致死机理具有重要作用,为异迟眼蕈蚊的防控提供新思路。4.增加CO2浓度可以提高AITC对异迟眼蕈蚊的熏蒸毒力,致死率显着提高,且随着处理时间的延长,致死率高达100%;高CO2浓度胁迫后,异迟眼蕈蚊体内三种抗氧化酶（超氧化物歧化酶SOD、过氧化氢酶CAT和过氧化物酶POD）活力均被显着诱导;AITC熏蒸处理后,SOD、谷胱甘肽S转移酶（GST）和羧酸酯酶（Car E）活力被显着诱导;AITC与高CO2双重胁迫之后,SOD、GST和Car E活力显着提高。5.CO2浓度升高,异迟眼蕈蚊成虫前期和总产卵前期先缩短后延长,在正常CO2浓度（NC=400 ppm）下分别为19.01和20.43 d,中等CO2浓度（MC=600 ppm）条件下最短（分别为14.48和15.59 d）,高CO2浓度（HC=800 ppm）条件下最长（分别为19.98和21.41 d）;雌成虫寿命随CO2浓度升高而逐渐缩短;产卵量先增加后减少,在NC浓度时为92.50粒,MC浓度增高到99.33粒,但HC浓度时产卵量较低（75.50粒）。异迟眼蕈蚊种群内禀增长率、净增殖率和周限增长率在MC浓度下均最高,而平均世代周期和种群加陪时间均最短;HC浓度时各种群参数值与之相反。6.CO2浓度升高影响寄主植物营养物质含量,进而间接影响异迟眼蕈蚊体内生理生化指标。韭菜叶片中可溶性糖、游离氨基酸含量随CO2浓度升高呈上升趋势,而可溶性蛋白含量则下降,对游离脂肪酸含量无显着影响;异迟眼蕈蚊体内糖原、可溶性糖、游离氨基酸含量均逐渐被诱导增加,可溶性蛋白含量则出现持续下降趋势,海藻糖和总脂肪含量则出现先增高后降低趋势。异迟眼蕈蚊体内生理指标含量与韭菜叶片营养物质含量相关,且这种相关性随CO2浓度升高而发生变化。研究结果为异迟眼蕈蚊的绿色防控提供理论基础和技术支持,为植物源农药AITC的开发和大规模推广应用提供科学依据,也为CO2浓度升高后异迟眼蕈蚊的适生性提供参考依据。
刘智鹏[2]（2020）在《杀鲑气单胞菌的筛选及其细胞毒素的鉴定》文中研究指明杀鲑气单胞菌是多种淡、海水鱼类的主要病原菌之一,不仅给美国、欧洲各国造成了巨大的经济损失,同时也影响了包括中国在内的多个亚洲国家的多种鱼类养殖。筛选杀鲑气单胞菌菌株,鉴定其毒素,研究致病机理对于防治杀鲑气单胞菌具有重要意义。本研究利用稀释涂布平板法从草鱼的肠道内分离纯化出一株革兰氏阴性菌株,结合菌株的形态、生理生化特征与16S r DNA序列分析,鉴定为杀鲑气单胞菌,并命名为DBFF01。本文对DBFF01菌株的菌体形态、生长特性与抗生素敏感性进行了分析。通过对其进行全基因组测序,对样品进行数据统计和质控,包括质粒序列分析、碱基组成分析、Coverage统计、重复序列分析等。然后根据测序结果进行基因结构和功能注释,包含t RNA及r RNA预测、蛋白长度预测、COG功能注释分析、KEGG功能注释分析等。结果显示,过滤后的总数据量为794,967,393 bp,reads条数为59,244,平均reads长度在2,950 bp,GC含量为58.33%。鉴定出10套核糖体r RNA操纵子和129个t RNA,通过分析COG、KEGG等数据库,发现大部分基因主要与碳水化合物代谢、氨基酸代谢、物质转运等相关。对比分析SWiss Prot数据库得到一种与苏云金芽孢杆菌以色列亚种Cyt1Aa毒素具有一定同源性的基因序列,命名为Cyt1Aa-like。对该潜在毒素蛋白进行了克隆、诱导表达以及纯化,将纯化后的蛋白作用于枞色卷蛾中肠细胞CF203/2.5发现,与对照组相比,细胞逐渐皱缩破裂发生聚集,细胞数目不断减少,随着蛋白作用时间的延长和浓度的增加,细胞毒性逐渐增强。结果显示该蛋白对于CF203/2.5细胞具有一定的毒性,具体作用机制有待进一步研究。本文对杀鲑气单胞菌进行了筛选、鉴定与测序,并克隆表达相关毒素蛋白,并研究了其细胞毒性,有利于进一步阐明杀鲑气单胞菌毒素的致病机理,为疖疮病的防治提供理论基础。
韩锐[3]（2020）在《白桦T-DNA插入突变体的鉴定及突变基因BpCOI1功能研究》文中研究指明植物T-DNA插入突变体是遗传学研究中珍贵的实验材料。白桦（Betula platyphylla Suk.）的全基因组测序已经完成,为开展白桦T-DNA插入突变体的研究及后续的基因鉴定提供了可能。本研究以白桦T-DNA插入突变体br为研究对象,鉴定其突变性状,分离T-DNA插入位点的侧翼序列,确定突变基因,并开展突变基因功能的研究。研究结果如下:（1）以白桦br突变体为试材,以野生型白桦WT为对照,以转BpCCR1过表达白桦OE2为转基因对照,从生长特性、株型特征、光合能力、感病能力和内源激素含量等方面展开研究。生长特性及株型观察结果显示,br株系树高、地径显着低于2个对照株系,但表现出侧枝细,二级侧枝多,节间距小,分枝角小的株型特征。相对叶绿素含量、光合参数及叶绿素荧光参数分析显示,与对照株系相比,br的相对叶绿素含量低,非光化学猝灭系数小,但气孔导度和蒸腾速率大。感病性分析显示,br株系比对照株系更易感链格孢菌（Alternaria alternata）。内源激素含量测定结果显示,br主枝茎尖与侧枝茎尖中IAA和Zeatin激素含量相近,但细胞分裂素与生长素含量的比值较大。同时,br侧枝茎尖中茉莉酸含量低,水杨酸含量高。（2）对WT、OE2和br主枝茎尖和侧枝茎尖进行转录组测序,结果表明,与WT和OE2相比,br主枝茎尖中的差异基因有406条,包括149条上调表达基因和257条下调表达基因;br侧枝茎尖中的差异基因有396条,包括125条上调表达基因和271条下调表达基因。这些差异基因影响了花发育、植物育性、植物生长发育、器官形态建成、顶端分生区活性、激素的生物合成和信号转导等生物学进程。（3）以br突变体为试材,采用TAIL-PCR、基因组二代和三代重测序技术鉴定T-DNA插入位点,结果发现br基因组中存在2个T-DNA插入位点,其中,一个位点位于Chr 5（1729009～1729377 bp）上,引起369 bp不纯合缺失,缺失区域包含了BpCOI1（Bpev01.c0817.g0010.m0001）基因的122 bp 5’UTR和 247 by第一段外显子序列。qRT-PCR结果显示,br中BpCOI1基因表达量显着低于WT和OE2,且br突变体对外源MeJA应答能力降低。（4）通过农杆菌介导法将BpCOI1启动子融合GUS的表达载体转入到白桦合子胚中,共得到4个ProBpCOI1::GUS转基因株系。GUS染色和GUS基因表达量分析显示,在转基因白桦的根、茎、叶和芽中均能检测到BpCOI1转录活性,且GUS基因在茎和芽中表达量较高。跟据BpCOI1启动子序列上顺式作用元件预测结果,对ProBpCOI1::GUS转基因株系进行IAA、ABA、GA、SA、MeJA、ET和光周期处理,GUS活性和GUS基因表达量分析显示,BpCOI1启动子对上述激素均有不同程度的应答,且对MeJA的响应最为明显;不同光周期也会影响BpCOI1启动子活性,其中,长光照促进BpCOI1启动子活性,短光照抑制其活性。（5）BpCOI1定位在细胞核上。与基因组序列相比,白桦中BpCOI1基因第150位碱基发生同义突变。对白桦、拟南芥、水稻和毛果杨中的COI1蛋白进行多序列比对,发现不同物种的COI1序列1～40位氨基酸不保守,这段序列包含了部分F-box结构域;酵母双杂交和双分子荧光互补实验显示这种序列不保守性并未影响BpCOI1蛋白与SKP1家族蛋白的相互作用。（6）采用农杆菌介导法获得8个35S::BpCOI1过表达白桦株系;采用RNAi技术干扰了 2个片段,分别位于BpCOI1的第三段外显子上和第一段外显子上（包含了突变体中部分缺失的序列）,各获得了 5个35S-BpCOI1-RNAi抑制表达株系。生长性状观察结果显示,1年生和2年生转基因株系的树高、地径和侧枝数与野生型白桦相比无明显差别。MeJA诱导实验表明高浓度MeJA抑制了野生型和BpCOI1过表达株系的根生长,但对抑制表达株系的根生长抑制作用不明显。感病性分析显示,链格孢菌侵染7d后,BpCOI1抑制表达株系感病率在83.33%以上,病害指数在10.51%～22.95%之间,而BpCOI1过表达及野生型白桦的叶片均未出现病斑。qRT-PCR结果显示,链格孢菌侵染后,与野生型白桦相比,过表达株系中BpCOI1和BpMYC2表达量均上调,而抑制表达株系中BpCOI1和BpMYC2不上调或上调不明显。（7）对野生型白桦及转BpCOI1基因过表达和抑制表达白桦及进行转录组测序,发现与野生型白桦相比,BpCOI1过表达株系中有1385条基因上调表达,1137条下调表达;抑制表达株系中有1446条基因上调表达,921条下调表达。在抑制表达株系中,多数参与萜类化合物和次生代谢产物合成的基因、4条参与JA信号转导的基因下调表达;6条参与SA信号转导的基因、多数参与调控植物与病原菌相互作用和植物衰老进程的基因、WRKY类的基因均上调表达。此外,参与其他植物激素的生物合成及转导、调控植物防御、激素响应、逆境响应、细菌和真菌响应的基因在BpCOI1转基因株系中也差异表达。综上所述,本研究对易感病、多分枝、矮化等多性状变异的T-DNA插入突变体br进行鉴定,确定了突变体中T-DNA插入位点,分离了突变基因,并对突变基因BpCOI1的启动子和基因功能展开研究。研究结果证明,COI1蛋白在JA信号感知方面至关重要,BpCOI1基因低量表达可以导致白桦对JAs信号不敏感,且易感病,研究结果可为白桦抗病性育种提供参考。
李帆[4]（2020）在《奶牛乳房炎中葡萄球菌耐药性检测及多糖连接酶LcpC功能与机制研究》文中进行了进一步梳理我国奶牛养殖业中普遍存在抗生素滥用的问题,抗生素滥用往往会催生多重耐药细菌,对公共卫生安全造成威胁。其中,因感染耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus,MRSA）而导致的奶牛乳房炎,往往给奶牛健康和奶业生产造成严重威胁。治疗MRSA所导致的感染往往有以下两个难点:（1）MRSA可能带有多重耐药基因,对多种抗生素具有耐药性,限制了可治疗药物的选择;（2）金黄色葡萄球菌可粘附并侵入宿主细胞内,从而逃避了宿主击杀和抗生素的作用。为了解陕西地区多重耐药的葡萄球菌流行状况,为指导陕西地区奶牛的健康养殖提供理论依据和参考,本课题组在陕西本地三家不同规模的奶牛养殖场中,选取了53头疑似患有奶牛乳房炎的奶牛,共采集得到了200份牛奶样品,从这些样品中,分离得到了144株葡萄球菌（吴兆韡,2018）。在此基础上,对这144株葡萄球菌进行了4种畜牧生产中常用抗生素（头孢唑林、替考拉宁、环丙沙星和氯霉素）的耐药检测试验。试验结果发现:144株葡萄球菌中,7.6%的菌株对替考拉宁耐药,14.6%的菌株对头孢唑林耐药,50%的菌株对环丙沙星耐药,11.1%的菌株对氯霉素耐药。其中对两种、三种抗生素耐药的菌株分别占总数的12.5%、6.9%。且发现一株对这四种抗生素均耐药的表皮葡萄球菌。接下来,为了探究金黄色葡萄球菌中可能与耐药性有关的基因,本课题组分析了在苯唑西林刺激下BA01611菌株RNA-seq数据（待发表）。基于该RNA-seq数据分析,选择了其中12个表达水平发生显着变化的基因并成功构建其敲除载体。将这些载体转入奶牛乳房炎来源的BA01611菌株后,得到了7株BA01611基因敲除菌株,加上前期已构建的5个未知其确切功能的基因敲除菌株（本课题组乔丹丹构建,具体数据待发表）,最终发现了5个与金黄色葡萄球菌抗性和生物膜形成能力相关的基因。从上述试验所构建的,12株奶牛乳房炎来源的金黄色葡萄球菌BA01611的敲除菌中,发现了对多种抗生素抗性和细胞粘附均有影响的lcp C基因。Lcp C属于Lyt R-Cps A-psr家族蛋白,该家族蛋白参与将磷壁酸和胞外多糖连接至肽聚糖的过程。在4株菌中[2株MRSA,2株对甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌（Methicillin-Sensitive Staphylococcus aureus,MSSA）]敲除lcp C后,MRSA菌株和MSSA菌株对β-内酰胺类、糖肽类抗生素的抗性都显着下降。同时对4种细胞系（A549,MCF7,HCMEC和Ha Ca T）的粘附水平也均有不同程度下降。通过电镜（扫描电镜、透射电镜）观测,我们发现敲除菌细胞壁结构变得粗糙、疏松,细菌表面塌陷。通过构建小鼠脓毒血症治疗模型,我们发现Lcp C的敲除可显着降低MRSA菌株的致病性:感染敲除菌的小鼠生存率提高（由野生组的30%提高至敲除组的70%）,肺部组织中炎症浸润程度降低,肺部和脾脏中的细菌载量下降,外周血液的炎症因子蛋白水平下降。MRSA感染巨噬细胞后,lcp C敲除组的细胞炎症因子水平相较于野生型也显着下降。通过q RT-PCR和双分子荧光互补试验,我们也尝试探寻了与Lcp C可能相互影响的蛋白:敲除lcp C后,与细胞壁合成有关的基因和细胞表面蛋白的m RNA水平显着降低;在HEK 293T细胞中,Lcp C蛋白可与Stk1、Stp1和Lyt S蛋白直接相互作用。综上所述,本课题试验一揭示陕西地区奶牛养殖场中,奶牛乳房炎来源的耐药葡萄球菌分布广泛,存在较多对两类、三类抗生素均耐药的葡萄球菌,甚至发现了一株对四种抗生素均耐药的葡萄球菌。这警示我们,在奶牛饲养管理的过程中,应合理使用抗生素,以防多重耐药的葡萄球菌甚至致病性细菌大规模流行。试验二通过构建金黄色葡萄球菌未知基因的敲除菌株,并分别对其相关表型进行初步研究,发现了5个金葡菌中与苯唑西林抗性有关的基因,1个与苯唑西林抗性和生物膜形成能力均有关的基因,为后续研究因金葡菌感染而造成的奶牛乳房炎构建了资源库。试验三首次证明了Lcp C的敲除可使金黄色葡萄球菌的细胞壁形态发生变化,进而影响金葡菌对抗生素的耐药性和对细胞的粘附作用,这为防治因金黄色葡萄球菌导致的奶牛乳房炎提供了重要的理论依据。
解美霞[5]（2020）在《陆地棉WAK和DUF642基因家族抗黄萎病功能分析》文中进行了进一步梳理黄萎病（Verticillium wilt）是一种通过土壤与种子传播的维管束真菌病害,是当前影响我国棉花产量和纤维品质最重要的病害之一,主要致病菌为大丽轮枝菌（Verticilliumdahliae）。本研究以陆地棉（Gossypium hirsutum）TM-1 基因组为参考,通过生物信息学分析鉴定细胞壁关联激酶（wall-associatedkinase,WAK）和未知功能域642（domain of unknown function 642,DUF642）两个基因家族,包括基因的染色体定位、理化性质、基因结构、亲缘关系。结合转录组数据和实时定量检测技术,分析了这些基因在逆境胁迫下的表达规律。另外,着重对GhWAK26、GhWAK77和GhDUF642-10等3个基因进行了抗黄萎病功能鉴定。主要研究结果包括:1.在陆地棉基因组鉴定到81个WAKs基因（GhWAKs）,分布在18条染色体上,多定位于细胞膜;大部分GhWAKs具有相似的基因结构;按照蛋白结构域可将GhWAKs分为7个亚组。2.12个GhWAKs受黄萎病菌诱导表达;GhWAK77定位在细胞膜上;MeJA和SA喷洒处理棉苗后,Gh WAK26和Gh WAK77在部分时间点显着上调表达,表明它们受这两种激素的诱导。3.利用VIGS技术沉默Gh WAK26和GhWAK77;接种黄萎病菌20d后,沉默组病指显着高于对照组,表明GhWAK26和GhWAK77沉默后植株对黄萎病菌的抗性显着降低。黄萎病菌在棉苗茎秆分离培养结果显示,GhWAK26和GhWAK77沉默使茎秆中黄萎病菌加速扩展,同时结合PCR检测结果表明基因沉默后黄萎病菌在茎秆中含量明显增加。Gh WAK26和Gh WAK77沉默使棉株内H202和NO含量显着降低,POD活性显着升高,木质素含量显着降低。4.陆地棉TM-1基因组中包含23个DUF642基因,分布于14条染色体和1条Scaffold;编码蛋白含有1～2个保守的DUF642结构域,多定位在细胞膜。DUF642家族基因可分成4个亚组,在进化上相对保守。DUF642基因具有较为广泛的组织表达类型,其中根和叶中表达较高。5.通过qRT-PCR技术筛选到6个受黄萎病菌诱导表达的DUF642基因。运用VIGS技术沉默其中的GhDUF642-10,沉默植株叶片较对照组植株黄化、萎蔫程度重,病情指数显着升高,表明该基因在棉花抗黄萎病中发挥重要作用。综上,本研究在陆地棉基因组中鉴定到81个GhWAKs和23个GhDUF642s,它们在棉花中潜在发挥多种生物学功能。GhWAK26、GhWAK77和GhDUF642-10是重要的抗病基因,能够通过影响H2O2、NO含量、POD活性及木质素含量参与棉花对黄萎病的抗性。
高嵩[6]（2020）在《Gb3在蜡样芽孢杆菌感染过程中的作用与机制研究》文中提出蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus,B.cereus）是一种机会致病菌,可引起食源性疾病,主要症状是呕吐和腹泻。除此之外,对于免疫功能低下甚至免疫功能正常的人群,蜡样芽孢杆菌还可引起局部或全身性的非胃肠道感染。这些非胃肠道感染包括菌血症,肺炎,眼内炎,中枢神经系统感染等。在有些情况下,蜡样芽孢杆菌感染甚至会引起患者死亡,特别是对于出现菌血症的患者死亡率会更高。乳糖三糖糖苷脂（Globotriaosylceramide,Gb3）,又被称为CD77,是一种重要的细胞表面分子,可以与多种病原体组分结合,如志贺毒素,大肠杆菌P型菌毛,猪链球菌Fhb,铜绿假单胞菌的凝集素I（Lec A）等,在多种细菌感染过程中发挥重要作用。尽管Gb3在不同病原体感染期间发挥的功能不尽相同,我们推测Gb3可能是多种细菌共用识别受体,但是Gb3在蜡样芽孢杆菌感染过程中是否发挥作用,以及如果发挥作用其作用机制是什么尚不清楚。为了回答以上科学问题,我们利用Gb3缺失小鼠建立蜡样芽孢杆菌小鼠腹腔感染模型,发现Gb3促进了蜡样芽孢杆菌导致的急性感染。之后筛选鉴定出了蜡样芽孢杆菌鞭毛蛋白可以与Gb3结合。粘附实验证明了蜡样芽孢杆菌鞭毛蛋白与Gb3的相互作用有助于蜡样芽孢杆菌粘附。利用蜡样芽孢杆菌鞭毛蛋白敲除株和抗鞭毛蛋白抗体,通过小鼠体内实验发现,在Gb3存在的情况下,鞭毛蛋白参与了蜡样芽孢杆菌感染小鼠的过程,并且抗鞭毛蛋白抗体具有免疫保护作用,最后我们还对鞭毛蛋白与Gb3结合后可能影响的信号通路进行了初步研究。本研究主要实验内容和结果包括以下三部分。一、Gb3促进了蜡样芽孢杆菌导致的急性感染为了探究Gb3在蜡样芽孢杆菌HN001感染小鼠中的作用,我们利用Gb3缺失小鼠建立蜡样芽孢杆菌小鼠腹腔感染模型,结果发现,Gb3缺失小鼠的死亡率、脏器细菌载量和血清内细胞因子IL-1β,IL-6、TNFα均显着低于野生型小鼠,这说明Gb3促进了蜡样芽孢杆菌导致的急性感染。为了研究蜡样芽孢杆菌分泌的毒力因子对蜡样芽孢杆菌感染的影响,我们构建了毒力因子表达受到抑制的蜡样芽孢杆菌菌株HN001-Δplc R。然后再分别用HN001和HN001-Δplc R菌株及其培养菌液上清去感染小鼠,发现蜡样芽孢杆菌分泌的毒力因子是导致小鼠急性死亡的直接原因。然后,我们用HN001培养菌液上清分别注射野生型和Gb3缺失小鼠,两种小鼠均发生急性死亡,但之前实验用HN001感染野生型和Gb3缺失小鼠时Gb3缺失小鼠死亡率较低,这表明分泌型毒力因子介导的小鼠死亡可能并不是直接通过Gb3发挥作用。所以,我们推测蜡样芽孢杆菌某种表面成分与宿主细胞Gb3之间发生了相互作用。之后我们测定了蜡样芽孢杆菌对野生型和Gb3缺失型h CMEC/D3细胞的粘附能力,结果发现蜡样芽孢杆菌可能通过Gb3实现了粘附,这表明可能某种蜡样芽孢杆菌表面成分与宿主细胞Gb3之间发生了相互作用。二、蜡样芽孢杆菌鞭毛蛋白与宿主细胞表面Gb3的相互作用Gb3作为细胞表面分子,可以嵌入细胞膜脂双层结构,但亲水的寡糖链可暴露在细胞膜外侧。Gb3的寡糖链包含Galα1-4Gal（galabiose）二糖结构,是多种病原体成分的结合位点。我们将含有Galα1-4Gal二糖结构的鸽卵类粘蛋白标记到磁珠上来钓取与之结合的蜡样芽孢杆菌表面蛋白,之后利用质谱技术鉴定出了蜡样芽孢杆菌鞭毛蛋白可能是与Gb3结合的配体,并利用生物膜层表面干涉技术测定亲和常数进行了验证。然后利用流式细胞技术证明了蜡样芽孢杆菌鞭毛蛋白可以与细胞表面Gb3结合,并通过扫描电子显微镜和激光扫描共聚焦显微镜观察蜡样芽孢杆菌可通过鞭毛粘附到细胞表面。为了研究蜡样芽孢杆菌鞭毛蛋白与Gb3的相互作用,我们构建了蜡样芽孢杆菌鞭毛蛋白敲除株HN001-Δfla,并且利用Gb3合成抑制剂,鞭毛蛋白,Lec A,二糖Galα-4Gal处理进行粘附实验,结果发现HN001-Δfla组、处理组与对照组相比蜡样芽孢杆菌粘附能力显着降低,这说明鞭毛蛋白与细胞表面Gb3结合有助于蜡样芽孢杆菌的粘附。为了进一步探究鞭毛蛋白与Gb3的相互作用对蜡样芽孢杆菌感染小鼠的影响,我们分别用HN001和HN001-Δfla感染野生型小鼠和Gb3缺失小鼠。结果发现,对于野生型小鼠,HN001-Δfla感染组小鼠的死亡率、脏器细菌载量和血清中IL-1β,IL-6、TNFα水平均显着低于HN001感染组小鼠;而对于Gb3缺失小鼠,HN001-Δfla感染组与HN001感染组小鼠结果没有显着差异。这些结果说明在Gb3存在的情况下,鞭毛蛋白参与了蜡样芽孢杆菌感染小鼠的过程。目前被动抗体治疗已被用于治疗多种细菌感染性疾病,抗体的作用靶标包括细菌分泌的毒力因子和细菌表面分子,抗细菌抗体发挥作用方式之一就是抑制细菌的粘附。在本研究中,我们用蜡样芽孢杆菌鞭毛蛋白免疫新西兰兔,获取抗鞭毛蛋白血清,并纯化出抗鞭毛蛋白抗体。通过蜡样芽孢杆菌小鼠腹腔感染模型,探究抗鞭毛蛋白抗体对小鼠的保护作用,结果显示,抗鞭毛蛋白抗体处理组小鼠死亡率,脏器细菌载量和血清中IL-1β、IL-6和TNFα水平均显着降低,这表明抗蜡样芽孢杆菌鞭毛蛋白抗体可以缓解蜡样芽孢杆菌对小鼠的感染,在蜡样芽孢杆菌感染小鼠过程中起到保护作用。三、蜡样芽孢杆菌鞘磷脂酶作用机制初步研究鉴于已发现蜡样芽孢杆菌鞭毛蛋白可以与Gb3结合,我们对鞭毛蛋白与Gb3结合后可能影响的信号通路进行了初步研究。文献报道大肠杆菌P型菌毛、志贺毒素与细胞表面Gb3结合后会使细胞神经酰胺含量显着升高,进而激活TLR4信号通路;重组表达的蜡样芽孢杆菌鞘磷脂酶Bc-SMase可以水解宿主细胞表面的鞘磷脂从而使神经酰胺含量升高,所以我们推测蜡样芽孢杆菌鞭毛蛋白与Gb3结合后,可能通过其产生的Bc-SMase水解细胞表面鞘磷脂从而产生神经酰胺。因此我们构建了Bc-SMase敲除株HN001-Δsmase,并发现蜡样芽孢杆菌感染细胞时Bc-SMase可以使细胞神经酰胺水平明显升高,并且此过程是依赖于Gb3的存在,这说明其可能是通过Bc-SMase使神经酰胺升高从而激活相关信号通路介导宿主炎症反应,但还有待于进一步研究证实。在本研究中我们发现了Gb3可以促进蜡样芽孢杆菌导致的急性感染,筛选鉴定出了蜡样芽孢杆菌鞭毛蛋白可以与Gb3结合,并且这种相互作用有助于蜡样芽孢杆菌粘附。除此之外还发现鞭毛蛋白与Gb3的相互作用可能还参与了蜡样芽孢杆菌对小鼠的感染过程,抗鞭毛蛋白抗体在蜡样芽孢杆菌感染小鼠过程中能够起到保护作用。最后,我们还对鞭毛蛋白与Gb3结合后可能影响的信号通路进行了初步研究,发现其可能通过Bc-SMase使神经酰胺升高从而激活相关信号通路。总之,本研究除了证明蜡样芽孢杆菌鞭毛蛋白与Gb3的相互作用之外,还为蜡样芽孢杆菌感染的防治提供了有价值的信息。
于爽[7]（2020）在《苏云金芽胞杆菌Vip3Aa39的改造》文中研究说明害虫是影响农林生产力的主要因素之一。随着化学杀虫剂对环境的污染日益严重,生物杀虫剂的应用越来越普遍。苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）能够产生杀虫晶体蛋白（Insecticidal crystal proteins,ICPs）、营养期杀虫蛋白（Vegetative insecticidal proteins,Vips）等不同类型的杀虫蛋白,由于Vips与ICPs的杀虫谱和作用机制存在差异性,Vips一直是研究的热点。自发现Vip3A蛋白以来,虽然有大量的关于Vip3A蛋白的研究,但是其三维结构尚未解析,Vip3A蛋白结构与功能之间的关系知之甚少,而且还存在杀虫活性有待进一步提高等问题。本研究以对鳞翅目害虫具有广谱杀虫活性的Vip3Aa39为对象,通过构建嵌合蛋白和突变体确定了Vip3Aa39关键功能区和关键氨基酸位点。无活性的vip3Ad是本研究新筛选获得,用于与vip3Aa39构建嵌合基因,以期得到关键氨基酸片段。通过对比vip3Aa39和vip3Ad核苷酸序列,利用同源重组技术,采用重叠延伸PCR方法进行了Vip3Aa39与Vip3Ad的氨基酸片段互换,构建10个嵌合基因,诱导表达蛋白对棉铃虫（Helicoverpa armigera）、小菜蛾（Plutella xyllostella）和甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）3种鳞翅目供试昆虫进行生物活性测定,并通过同源建模预测了Vip3Aa39改造蛋白的三维结构信息,对比分析嵌合蛋白的生物活性与结构关系得到Vip3Aa39关键氨基酸片段;为进一步研究Vip3Aa39蛋白杀虫关键氨基酸位点,对本实验室已验证杀虫活性有明显差异的Vip3Aa11与Vip3Aa39的氨基酸同源性进行分析,发现二者仅有39个氨基酸的差异,利用生物信息学方法,确定15个不同靶点,将Vip3Aa39蛋白中的相应氨基酸突变为Vip3Aa11相应的氨基酸,构建15个突变体。诱导表达后以棉铃虫、小菜蛾和甜菜夜蛾为供试昆虫进行生物活性测定,结合预测的Vip3Aa39突变体蛋白三维结构信息,确定影响Vip3Aa39蛋白活性的关键氨基酸位点5个。主要研究结果如下:1.筛选得到嵌合蛋白构建材料无活性的vip3Ad基因。为获得无活性Vip3A蛋白与已有高活性Vip3Aa39蛋白构建嵌合蛋白用以确定关键氨基酸片段,利用温度筛选法和PCR方法从4034份土样中筛选新基因。从菌株BJG810中得到了vip3Ad基因,vip3Ad基因的编码框长2361 bp,与vip3Ad2（CAI43276）核酸序列相似性达到99.36%,序列提交到Gen Bank并获得登录号KP346519。转化BL21（DE3）中,诱导表达,得到～88k Da的蛋白,生物活性测定表明蛋白对3种鳞翅目供试昆虫棉铃虫、小菜蛾和甜菜夜蛾均无杀虫活性,与Vip3Aa39序列比对表明两蛋白的氨基酸同源性为85%,获得了嵌合蛋白构建的基因材料。2.构建嵌合蛋白,获得了Vip3Aa39蛋白的关键氨基酸片段。成功构建以Vip3Ad蛋白N-端起始的Vip3Ad Aa类蛋白4个。将Vip3Aa39的N-端氨基酸片段替换为Vip3Ad蛋白的相应片段得到重组蛋白4个,分别为Vip3Ad Aa-1（氨基酸1-60被Vip3Ad取代）,Vip3Ad Aa-2（氨基酸1-116被Vip3Ad取代）,Vip3Ad Aa-3（氨基酸1-344被Vip3Ad取代）,Vip3Ad Aa-4（氨基酸1-455被Vip3Ad取代）。Vip3Ad Aa-1杀虫活性与Vip3Aa39相比对三种昆虫的LC50值均降低,杀虫活性显着增加,Vip3Ad Aa-1与Vip3Aa39只有3个差异氨基酸（T6,N45,E60）;Vip3Ad Aa-2对棉铃虫和小菜蛾的杀虫活性与Vip3Aa39相比没有显着差异,而显着降低了对甜菜夜蛾的杀虫活性;与Vip3Aa39相比,Vip3Ad Aa-3对棉铃虫的杀虫活性显着提高而降低了对甜菜夜蛾的杀虫活性;与Vip3Aa39相比,Vip3Ad Aa-4对小菜蛾的杀虫活性显着升高。成功构建Vip3Aa39的中间氨基酸片段替换为Vip3Ad相应片段的Vip3Aa Ad Aa类蛋白3个。分别为Vip3Aa Ad Aa-1（氨基酸116-210被Vip3Ad取代）,Vip3Aa Ad Aa-2（氨基酸210-345被Vip3Ad取代）,Vip3Aa Ad Aa-3（氨基酸455-632被Vip3Ad取代）。Vip3Aa Ad Aa-1对甜菜夜蛾杀虫活性的显着降低,几乎丧失了对棉铃虫和小菜蛾的杀虫活性,氨基酸比对发现Vip3Aa Ad Aa-1与Vip3Aa39只有3个差异氨基酸位点（A134V,I176M,S200P）;Vip3Aa Ad Aa-2显着提高对棉铃虫的杀虫活性,降低了对小菜蛾的杀虫活性;Vip3Aa Ad Aa-3对小菜蛾和甜菜夜蛾的杀虫活性均显着降低。成功构建以Vip3Ad蛋白C-端为结尾的Vip3Aa Ad类蛋白3个。分别为Vip3Aa Ad-1（氨基酸345-789被取代）,Vip3Aa Ad-2（氨基酸727-789被取代）;Vip3Aa Ad-3（氨基酸778-789被取代）。蛋白的杀虫活性表明:Vip3Aa Ad-1和Vip3Aa Ad-2对3种昆虫丧失了活性;Vip3Aa Ad-3对3种昆虫均具有杀虫活性,提高了对棉铃虫的杀虫活性而降低了对小菜蛾的杀虫活性。综合以上分析,Vip3Aa39的氨基酸片段61-116、116-210是维持对棉铃虫活性的关键氨基酸片段,可以通过改造Vip3Aa39的氨基酸片段1-60、210-345、778-789提升对棉铃虫的杀虫活性;Vip3Aa39的氨基酸片段61-116、116-210、210-345、455-632、778-789是维持对小菜蛾活性的关键氨基酸片段,可以通过改造Vip3Aa39的氨基酸片段1-60、1-455提升对小菜蛾的杀虫活性;Vip3Aa39的氨基酸片段61-116、116-210、1-344、455-632是维持对甜菜夜蛾活性的关键氨基酸片段;其中Vip3Aa39的氨基酸片段116-210是对这三种昆虫的关键氨基酸片段;可以通过改造Vip3Aa39的1-60提升对三种试虫的生物活性。明确了两个重要氨基酸位点组合,（A134V,I176M,S200P）组合改造后对3种试虫活性丧失,说明是Vip3Aa39的关键氨基酸位点组合;（T6A,N45D,E60D）组合改造后对3种试虫生物活性显着升高,说明可以通过改造此氨基酸位点组合提高对3种试虫的生物活性。3.获得了15个突变体蛋白,确定5个Vip3Aa39杀虫的关键氨基酸位点。成功构建了15个突变体（N9S、A10T、T193S、L194S、S200G、N543S、L544I、G546E、E547D、V681T、I685T、R686S、L780I、K782H和N784Y）。对突变体蛋白进行杀虫活性测定和结构分析,结果表明:与Vip3Aa39相比,突变体蛋白对三种昆虫的杀虫活性均发生了不同程度的变化。L544I、R686S和N784Y突变体蛋白对棉铃虫和小菜蛾的杀虫活性均有显着提高;N9S、S200G、N543S、L544I、E547D、V681T、I685T和K782H突变体蛋白均显着提高了对甜菜夜蛾的杀虫活性。从而确定了L194、N543、L544、K782、N784五个氨基酸位点可能是对Vip3Aa39蛋白杀虫活性起关键作用的位点。4.嵌合蛋白和突变体蛋白胰蛋白酶消化结果显示,除Vip3Aa Ad-2,A10T外,其余均被消化成稳定的62k Da片段,证实胰蛋白酶参与了改造蛋白的活化;该结果进一步表明,Vip3Aa Ad-2、A10T蛋白不具有杀虫活性的原因也可能是因为该蛋白不能够被胰蛋白酶消化出核心片段。综上,本研究基于Vip3Aa39和Vip3Ad、Vip3Aa39和Vip3Aa11杀虫蛋白活性的差异以及氨基酸序列的差异,对Vip3Aa39进行改造,构建Vip3Aa39嵌合蛋白及突变蛋白,获得了与杀虫活性相关的关键活性区信息,对深入研究Vip3Aa杀虫基因的功能及功能与结构关系具有指导意义。并获得了高活性的Vip3Aa杀虫蛋白,为高效工程菌的构建和转基因植物的培育、延缓昆虫抗性提供了遗传材料,也为该类基因在生物农药、基因修饰等领域的应用提供理论依据。
孔浩然[8]（2020）在《苏云金芽孢杆菌内毒素CryIVD重组表达及灭蝇效果评估》文中提出长期以来,具有高效、速效、经济和使用方便的有机合成农药是养殖场赖以防蝇的最主要的手段,但是由于长时间、大量、长期使用有机合成灭虫剂,“3R”问题（resistance,resurgence,residue）也会随之而来,同时化学灭虫剂的作用也难以得到保证,甚者危害人类健康,污染环境。而生物型灭虫剂拥有低毒、易降解、对人畜无害、害虫不容易产生耐药性等特点,可满足生态学发展的需求,是未来新型杀虫剂研制的重要方向之一。近年来,生物型杀虫剂研制发展较为迅速、应用也较为广泛,尤其以苏云金芽孢杆菌为代表新型制剂正处于研发和应用阶段,其防虫原理是分泌的内毒素（伴胞晶体）具有胃毒素,害虫因此停止进食,最后因饥饿、神经紊乱、细胞壁破裂而死。苏云金芽孢杆菌以色列亚种最初用于杀虫主要是针对双翅目蚊的卵和幼虫,本实验意外发现该亚种的内毒素CryIVD基因对家蝇（尤其是对其蝇的卵）具有着较强的杀灭作用。本文参照NCBI GenBank 中已发布的目的基因序列（登录号EU124377.1）,采用软件Primer6.0设计用于扩增CryIVD基因的引物,并在两端引入限制性酶切位点。对增殖的苏云金芽孢杆菌以色列亚种提取基因组DNA,采用PCR技术扩增CryIVD基因,将PCR产物与pMD19-T载体连接构建克隆质粒,然后进行酶切鉴定并测定序列,并进行同源性分析;将目的进行连接至pGEX-4T-1原核表达载体中,构建重组质粒pGEX-4T-CryIVD,经PCR鉴定为阳性克隆后,并对其采用IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和免疫印迹技术进行鉴定;利用重组表达CryIVD在体外开展了急性毒理试验,评估对家蝇的杀灭效果。结果表明:成功扩增出目的基因,其大小为660 bp。序列分析显示,其与Bacillus thuringiensis strain DAB-Bt2 Cry4d gene同源性最高,达100%,进化树分析也显示其与Bacillus thuringiensis strain DAB-Bt2 Cry4d gene 在遗传距离上最为接近;质粒pGEX-4T-CryIVD经IPTG诱导后,可表达出目的蛋白,其大小约为51kDa融合蛋白;体外毒性试验结果表明:CryIVD蛋白对蝇卵的杀灭效果较好,其LD50可达7.87×107cells/g;而对家蝇成虫的杀灭效果一般,其LD50为6.30×105cells/只。由此可见,重组表达的CryIVD对家蝇的卵具有良好的杀灭作用,是一种具有潜在性地可替代化学药物灭蝇方法。
曹蓓蓓[9]（2020）在《对灰飞虱高毒力的新型Bt杀虫蛋白基因克隆及其活性研究》文中提出灰飞虱是水稻上非常重要的半翅目害虫,不仅能通过刺吸式口器吸取水稻等作物汁液,掠夺其营养物质,直接危害作物,同时还在水稻、玉米等作物间传播植物病毒,严重影响了水稻、玉米等农作物的安全生产。此类害虫主要依靠化学农药进行防治,但化学农药长期滥用带来了害虫抗药性上升、农药残留、环境污染、食品安全等一系列严重后果,急需开辟新的绿色防控途径。苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）已被广泛的应用于多种水稻鳞翅目害虫的绿色防控。近年来,本实验室在大量分离筛选Bt菌株资源的基础上,发现了两株对灰飞虱具有活性的野生菌株,并从中分别克隆了cry64Ba、cry64Ca和cry78Aa三种新基因,这些基因表达产物对灰飞虱均具有很高的毒杀作用。由此说明从Bt菌株资源中筛选新的对飞虱高毒力杀虫蛋白是可行的。本研究在Bt基因组高通量测序基础上,以对灰飞虱高毒力的cry64Ba、cry64Ca和cry78Aa基因为参照,利用生物信息学技术分析挖掘新型Bt杀虫基因,并以灰飞虱为靶标害虫,结合传统的生物活性测定,克隆对灰飞虱具有显着杀虫活性的新基因,为灰飞虱的生物防治提供重要的菌株和基因资源。主要结果如下:（1）利用生物信息学技术,经BLAST比对,从实验室前期完成的1368个Bt菌株草图数据库获得162条cry78Aa1基因同源核苷酸序列,确定了17株含有cry78-like基因的候选Bt菌株。（2）生测结果发现P14E12、B4F11、C8D6、T5D8、B15C9这5株候选菌株总晶体蛋白对灰飞虱具有一定程度的杀虫活性,致死率在40-80%。这些菌株的采集地具有一致性,均来自于北京百望山森林公园。（3）完成了P14E12、B4F11、C8D6、T5D8、B15C9共5株菌株的Bt基因注释,蛋白结构预测发现这些菌株含有的cry78-like基因编码的蛋白均含有RicinB＿lectin和Toxin＿10超家族保守结构域。（4）无活性菌株Bt P14C1、P14F6、C14F11、P10C11、A4A4、B9B3的蛋白样品经胰蛋白酶消化后对灰飞虱的致死率均有所提高,其中C14F11、P10C11两种菌株总晶体蛋白经胰蛋白酶消化前后的活性具有显着性差异。（5）分别从B4F11、A3F10、P10C11、P14F6、T5D8、A4A4、C14F11、P14E12菌株中克隆cry78-like基因共8种,这些基因编码蛋白与Cry78Aa1的氨基酸序列相似性介于31.8-54.3%;在大肠杆菌中成功表达了7种新基因,这些蛋白分子量在41.6-43.7 kDa之间,与预测蛋白分子量大小一致;其中Protein 6、Protein 10、Protein 11三种蛋白可溶性表达,蛋白分子量分别为42.5、43.7、42.4 kDa。生物活性初筛结果显示这三种Cry78-like蛋白对灰飞虱三龄若虫一定程度的杀虫活性,在30μg/mL时校正死亡率分别为90.15%、40.99%、26.23%。（6）选取初筛活性最好的Protein 6蛋白进行深入研究。该蛋白由来源于活性Bt菌株B4F11的gene6编码,包含380个氨基酸残基,预测的分子量约为42.5 kDa,具有Ricin＿B＿Lectin和Toxin＿10超家族保守结构域。其对灰飞虱三龄若虫具有很高杀虫活性,致死中浓度LC50为9.72μg/mL。gene6基因序列已提交给NCBI GenBank,登录号为MN075151,与Cry78Aa1氨基酸相似性为54.3%,被Btδ-内毒素国际命名委员会命名为cry78Ba1,这是第二等级的新基因。（7）Cry78Ba1蛋白与目前已知的过敏原均无序列同源性,在90℃加热10 min即可变性失活。Cry78Ba1蛋白在模拟胃液处理15 s内完全降解失活,但模拟肠液中消化1 h仍具有杀虫活性。由此推测Cry78Ba1蛋白被人或高等动物摄入后在胃液中可被迅速降解短肽,在进入肠道时应当已经丧失了毒性。在本研究测试范围内,就消化和吸收而言,该蛋白没有发现对人类或哺乳动物的安全隐患。综上,本研究基于高通量测序技术获得Bt菌株基因组草图数据以及生物信息学方法比对现有活性基因的同源核苷酸序列,从候选菌株活性筛选、同源基因活性鉴定两方面出发,挖掘对灰飞虱具有高毒性的Bt菌株与基因。这说明,在Bt野生菌株中发现对灰飞虱等刺吸式口器害虫有活性的Bt菌株具有很大的潜力。研究结果为发掘对半翅目刺吸式口器害虫高毒力的Bt菌株及基因提供了新思路;同时,本研究获得的Cry78Ba1蛋白为稻飞虱高效、绿色防控方面创造了有利条件。
李延利[10]（2020）在《中华鳖“摇头病”病原的分离鉴定及其对中华鳖4个免疫相关基因的影响研究》文中研究指明中华鳖“摇头症”的爆发,使得鳖大规模死亡,给中华鳖养殖业造成严重经济损失。为确定病原,了解病原致病情况和对机体的损伤情况,进而提出合理的防治办法,本研究首次从中华鳖国家水产新品种清溪乌鳖病鳖中分离获得到一株病原菌,通过综合形态观察、革兰氏染色、16S rDNA、gyr B和rpo B序列测定比对及菌生理生化指标测定等对病原菌鉴定,并进行药敏试验;接着运用PCR方法分析其毒力基因,并通过内脏组织切片来观察其对组织的侵袭情况;通过转录组测序分析该菌对中华鳖转录组产生的影响;最后通过荧光定量PCR法测定机体各组织的免疫基因MyD88、TLR2、TLR3、TLR4表达水平。研究结果如下:1.病原菌的分离鉴定及药敏试验（1）分离获得的该病原菌呈乳白色融蜡状凸起,革兰氏染色阳性且具有芽孢,呈单个或链状排列;生理生化指标与《常见细菌系统鉴定手册》蜡样芽孢杆菌描述基本一致,16S rDNA基因、gyr B基因和rpoB基因序列分析以及系统进化树结果显示,该菌株为蜡样芽孢杆菌群（Bacillus cereus group）内新种,命名为蜡样芽孢杆菌XS0724菌株。人工注射感染可复现发病症状,表现为浮于水面、反应迟钝、四肢无力、不断摇头而死亡。经测定其LD50为2.42×105 CFU/kg体重。（2）药敏试验发现,此株菌对头孢氨苄、氟苯尼考、强力霉素、恩诺沙星、氧氟沙星高度敏感,对麦迪霉素、呋喃妥因、妥布霉素、卡那霉素、呋喃唑酮、庆大霉素、万古霉素中度敏感,对利福平、头孢他啶耐药。2.病原菌的毒力基因及其对组织的侵袭情况（1）对蜡样芽胞杆菌10个常见毒力基因的PCR检测发现,蜡样芽孢杆菌XS0724菌株包含非溶血性肠毒素基因（nheA、nheB、nheC）、溶血性肠毒素基因（hblA、hblC和hblD）和肠毒素基因（entFM）等7个毒力基因,表明本株蜡样芽孢杆菌为有毒菌株,且具有较高毒性。（2）组织病理切片显示,中华鳖的肝脏、脾脏、肠道受损较为严重,肾脏和肺部相较于上述三个部位情况较轻,但也有病变可见;同时在肝脏和脾脏中可见大量病原菌聚集。3.病原菌感染的中华鳖脾脏转录组的影响转录组分析最终得到Clean Data约42.63 Gb,各样品的数据量均在6.07 Gb以上,数据拼接后共获得348,665条Unigene。差异表达基因统计发现,注射菌XS0724的实验组（Case）相比于注射PBS的对照组（Control）共18593个差异表达基因,其中上调基因9678个,下调基因8915个。KEGG通路富集主要集中在toll样受体信号通路、抗原处理及呈递通路、IL-17信号通路、Th1和Th2细胞分化通路、自身免疫缺陷、寄生虫病、结核、人类肿瘤和金黄色葡萄球菌感染等免疫相关通路。4.病原菌感染的中华鳖各组织4个免疫基因表达情况除脑部外其他所测定组织中MyD88 mRNA表达均与对照组存在极显着差异（P<0.01）,相对表达水平顺序依次为脾脏>肌肉>心脏>肾脏>肺>血液>肝脏>肠>脑。TLR2 mRNA表达量相对于对照组,除肠和血液两者无显着差异外（P>0.05）,在脑中有显着差异（P<0.05）,其余组织均有极显着差异（P<0.01）,相对表达水平顺序依次为肌肉>脾脏>心脏>血液>肺>肾脏>肝脏>脑>肠。TLR3 mRNA表达量相对于对照组在肺部有显着差异（P<0.05）,其余组织中有极显着差异（P<0.01）,相对表达水平顺序依次为肌肉>脾脏>血液>心脏>肝脏>肺>肾脏>肠>脑。TLR4mRNA表达量相对于与对照组在肠中无差异（P>0.05）,肺及血液相有显着差异（P<0.05）,其余各组织均有极显着差异（P<0.01）,相对表达水平顺序依次为肌肉>脾脏>心脏>肾脏>肝脏>肺>血液>脑>肠。综上所述,蜡样芽孢杆菌XS0724菌株对中华鳖具有致病性,在选择蜡样芽胞杆菌作为益生菌使用时应加以区别;该有毒菌株毒性大,对中华鳖肝脏、脾脏、肠道破坏性强,在治疗和预防过程中可优先考虑有益于肝脏、脾脏、肠道的药物;头孢氨苄、氟苯尼考和强力霉素等可用于疾病治疗。
二、韭蛆病原菌cyt基因的克隆及工程菌株的构建（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、韭蛆病原菌cyt基因的克隆及工程菌株的构建（论文提纲范文）
（1）异硫氰酸烯丙酯及CO2浓度升高对异迟眼蕈蚊的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Summary |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 异迟眼蕈蚊研究概况 |
| 1.1.1 形态体征、生活习性及为害 |
| 1.1.2 发生规律 |
| 1.1.3 发生与环境条件的关系 |
| 1.1.4 防治策略 |
| 1.2 植物源杀虫剂概况 |
| 1.2.1 植物源杀虫剂简介 |
| 1.2.2 杀虫植物资源及活性成分 |
| 1.3 异硫氰酸烯丙酯概况 |
| 1.3.1 异硫氰酸烯丙酯简介 |
| 1.3.2 异硫氰酸酯类化合物的提炼步骤简介 |
| 1.3.3 异硫氰酸烯丙酯的杀菌活性 |
| 1.3.4 异硫氰酸烯丙酯的除杂草活性 |
| 1.3.5 异硫氰酸烯丙酯的杀虫活性 |
| 1.3.6 异硫氰酸烯丙酯的作用机制概述 |
| 1.4 转录组学概况 |
| 1.4.1 转录组学简介 |
| 1.4.2 转录组学的研究方法 |
| 1.4.3 转录组学在调控昆虫生殖方面的应用 |
| 1.5 代谢组学概况 |
| 1.5.1 代谢组学简介 |
| 1.5.2 非靶向代谢组学在昆虫领域的研究进展 |
| 1.6 设施作物概况 |
| 1.6.1 设施作物简介 |
| 1.6.2 温室大棚环境条件及常见虫害 |
| 1.6.3 防治策略 |
| 1.7 大气CO_2浓度变化趋势及对昆虫的影响 |
| 1.7.1 大气CO_2浓度变化趋势分析 |
| 1.7.2 CO_2浓度升高对昆虫的影响 |
| 1.7.3 CO_2 对熏蒸剂的作用 |
| 1.8 研究背景及意义 |
| 1.8.1 研究背景 |
| 1.8.2 研究意义 |
| 1.9 研究内容和技术路线 |
| 1.9.1 研究内容 |
| 1.9.2 技术路线 |
| 第二章 异硫氰酸烯丙酯对异迟眼蕈蚊的作用活性及亚致死效应 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 供试寄主植物 |
| 2.1.2 供试昆虫 |
| 2.1.3 试剂及仪器 |
| 2.1.4 配药 |
| 2.1.5 熏蒸法 |
| 2.1.6 浸叶法 |
| 2.1.7 AITC亚致死浓度对异迟眼蕈蚊3 龄幼虫后续发育的影响 |
| 2.1.8 数据处理与分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 AITC对异迟眼蕈蚊的生物活性分析 |
| 2.2.2 AITC异迟眼蕈蚊各虫态的存活率分析 |
| 2.2.3 AITC亚致死浓度对异迟眼蕈蚊幼虫发育历期的影响 |
| 2.2.4 AITC亚致死浓度对异迟眼蕈蚊蛹期和蛹重的影响 |
| 2.2.5 AITC亚致死浓度对异迟眼蕈蚊化蛹率和羽化率的影响 |
| 2.2.6 AITC亚致死浓度对异迟眼蕈蚊成虫寿命及繁殖力的影响 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 异硫氰酸烯丙酯对异迟眼蕈蚊转录组学的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 供试寄主植物 |
| 3.1.2 供试昆虫 |
| 3.1.3 试剂及仪器 |
| 3.1.4 测序样品准备 |
| 3.1.5 c DNA文库构建 |
| 3.1.6 转录组测序 |
| 3.1.7 序列拼接和功能注释 |
| 3.1.8 差异表达基因的筛选和实时荧光定量PCR检测 |
| 3.1.9 数据处理与分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 测序质量评估 |
| 3.2.2 Unigene功能注释 |
| 3.2.3 GO功能分类 |
| 3.2.4 KEGG功能分类 |
| 3.2.5 差异表达基因分析 |
| 3.2.6 差异表达基因GO注释与分类 |
| 3.2.7 差异基因的KEGG通路富集分析 |
| 3.2.8 差异基因的实时荧光定量验证 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 异硫氰酸烯丙酯对异迟眼蕈蚊非靶向代谢组学的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 供试寄主植物 |
| 4.1.2 供试昆虫 |
| 4.1.3 设备及试剂 |
| 4.1.4 样品准备 |
| 4.1.5 样本提取方法 |
| 4.1.6 色谱-质谱分析 |
| 4.1.7 数据分析流程 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 样本质控分析 |
| 4.2.2 代谢物化学分类归属统计 |
| 4.2.3 组间PLS-DA分析 |
| 4.2.4 组间差异显着的代谢物 |
| 4.2.5 差异代谢物热图分析 |
| 4.2.6 差异代谢物KEGG通路分析 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 AITC与高CO_2联用对异迟眼蕈蚊的熏蒸效率及酶活力的影响 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 供试韭菜 |
| 5.1.2 供试昆虫 |
| 5.1.3 试剂及仪器 |
| 5.1.4 幼虫的高CO2 胁迫 |
| 5.1.5 AITC与高CO_2联用对幼虫的双重胁迫 |
| 5.1.6 抗氧化酶、解毒酶和消化酶活力检测 |
| 5.1.7 数据处理与分析 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 AITC与高CO_2联用对异迟眼蕈蚊致死率的影响 |
| 5.2.2 AITC熏蒸、CO_2浓度及其交互作用对异迟眼蕈蚊死亡率影响的方差分析 |
| 5.2.3 AITC与高CO_2联用对异迟眼蕈蚊抗氧化酶活力的影响 |
| 5.2.4 AITC与高CO_2联用对异迟眼蕈蚊解毒酶活力的影响 |
| 5.2.5 AITC与高CO_2联用对异迟眼蕈蚊消化酶活力的影响 |
| 5.2.6 AITC熏蒸、CO_2浓度及其交互作用对异迟眼蕈蚊酶活力影响的方差分析 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 CO_2浓度升高对异迟眼蕈蚊生长繁殖的影响 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 供试寄主植物 |
| 6.1.2 供试昆虫 |
| 6.1.3 异迟眼蕈蚊生长发育指标的测定 |
| 6.1.4 异迟眼蕈蚊年龄-阶段两性生命表的建立 |
| 6.1.5 不同CO_2浓度对异迟眼蕈蚊存活率的影响 |
| 6.1.6 不同CO_2浓度对异迟眼蕈蚊繁殖力的影响 |
| 6.1.7 不同CO_2浓度对异迟眼蕈蚊寿命期望的影响 |
| 6.1.8 不同CO_2浓度对异迟眼蕈蚊各虫态繁殖值的影响 |
| 6.1.9 不同CO_2浓度对异迟眼蕈蚊种群参数的影响 |
| 6.1.10 数据分析 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 不同CO_2浓度对异迟眼蕈蚊生长发育指标的影响 |
| 6.2.2 不同CO_2浓度对异迟眼蕈蚊各虫态存活率的影响 |
| 6.2.3 不同CO_2浓度对异迟眼蕈蚊种群存活率及繁殖力的影响 |
| 6.2.4 不同CO_2浓度对异迟眼蕈蚊各虫态寿命期望值的影响 |
| 6.2.5 不同CO_2浓度对异迟眼蕈蚊各虫态繁殖值的影响 |
| 6.2.6 不同CO_2浓度对异迟眼蕈蚊种群参数的影响 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 CO_2浓度升高通过食物链对异迟眼蕈蚊生理特性的影响 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 供试寄主植物 |
| 7.1.2 供试昆虫 |
| 7.1.3 试剂及仪器 |
| 7.1.4 样品收集 |
| 7.1.5 生理指标测定方法 |
| 7.1.6 数据分析 |
| 7.2 结果 |
| 7.2.1 CO_2浓度升高对韭菜营养物质含量的影响 |
| 7.2.2 CO_2浓度升高对异迟眼蕈蚊生理指标的影响 |
| 7.2.3 韭菜营养物质含量与异迟眼蕈蚊生理指标的相关性分析 |
| 7.3 讨论 |
| 7.4 小结 |
| 第八章 总体结论与展望 |
| 8.1 总体结论 |
| 8.2 创新点 |
| 8.3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
（2）杀鲑气单胞菌的筛选及其细胞毒素的鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 鱼类肠道微生物概况 |
| 1.1.1 鱼类肠道微生物简介 |
| 1.1.2 鱼类肠道微生物组成和分布 |
| 1.1.3 鱼类肠道微生物的功能 |
| 1.2 气单胞菌概况 |
| 1.2.1 气单胞菌分类地位 |
| 1.2.2 气单胞菌毒力因子 |
| 1.2.3 气单胞菌的鉴定 |
| 1.3 杀鲑气单胞菌的概况 |
| 1.3.1 杀鲑气单胞菌菌株简介 |
| 1.3.2 杀鲑气单胞菌菌株的危害 |
| 1.3.3 相关毒力因子 |
| 1.3.4 杀鲑气单胞菌的防治 |
| 1.4 全基因组测序 |
| 1.4.1 全基因组测序概念 |
| 1.4.2 DNA测序技术发展历程 |
| 1.4.3 生物信息学统计与预测 |
| 1.5 立题依据及意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 鱼类样品来源 |
| 2.1.2 所用菌株和细胞及质粒 |
| 2.1.3 培养基和抗生素 |
| 2.1.4 工具酶、试剂盒及所用主要试剂 |
| 2.1.5 引物 |
| 2.1.6 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 草鱼肠道微生物的分离和纯化 |
| 2.2.2 肠道菌株的鉴定 |
| 2.2.3 全基因组测序 |
| 2.2.4 pET-28a-Cyt1Aa-like异源表达载体的构建 |
| 2.2.5 目的蛋白的诱导表达和SDS-PAGE检测 |
| 2.2.6 目的蛋白的纯化 |
| 2.2.7 细胞培养 |
| 2.2.8 Cyt1Aa-like蛋白的细胞毒性研究 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 菌株的分离与鉴定 |
| 3.1.1 菌株的分离 |
| 3.1.2 16SrDNA基因扩增 |
| 3.1.3 16SrDNA基因同源性分析及系统发育树的构建 |
| 3.2 DBFF01菌株的生长特性 |
| 3.2.1 生长曲线 |
| 3.2.2 抗生素敏感性 |
| 3.3 DBFF01菌株基因组提取 |
| 3.4 测序数据统计及质控 |
| 3.5 组装结果 |
| 3.5.1 染色体序列分析 |
| 3.5.2 碱基组成分析 |
| 3.5.3 Coverage统计 |
| 3.6 生物信息学分析 |
| 3.6.1 tRNA及 rRNA预测 |
| 3.6.2 预测蛋白长度统计 |
| 3.6.3 功能基因注释 |
| 3.7 携带His标签的重组质粒的构建及鉴定 |
| 3.8 Cyt1Aa-like蛋白的诱导表达 |
| 3.9 Cyt1Aa-like蛋白的纯化脱盐 |
| 3.10 Cyt1Aa-like蛋白的细胞毒性研究 |
| 3.10.1 Cyt1Aa-like蛋白对CF203/2.5 细胞的毒性实验分析 |
| 3.10.2 Cyt1Aa-like蛋白对CF203/2.5 细胞的活性和细胞增殖影响 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
（3）白桦T-DNA插入突变体的鉴定及突变基因BpCOI1功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 插入突变 |
| 1.2.1 转座子插入突变 |
| 1.2.2 T-DNA插入突变 |
| 1.3 植物T-DNA插入突变体的研究方法 |
| 1.3.1 T-DNA插入拷贝数的确定 |
| 1.3.2 T-DNA侧翼序列的分离 |
| 1.3.3 突变基因的验证 |
| 1.4 COI1基因与茉莉素信号转导 |
| 1.4.1 COI1基因的研究概况 |
| 1.4.2 茉莉素的发现 |
| 1.4.3 茉莉素的化学结构及生物合成 |
| 1.4.4 茉莉素的信号转导 |
| 1.4.5 茉莉素的生物学功能 |
| 1.5 目的意义 |
| 1.6 技术路线 |
| 2 白桦突变体的鉴定 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 感病分析所用菌株 |
| 2.1.3 主要试剂和培养基 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.1.5 主要软件 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 苗期生长量的测定 |
| 2.2.2 生长特性的测定 |
| 2.2.3 叶片和芽的解剖结构的观察 |
| 2.2.4 相对叶绿素含量、光合特性参数及叶绿素荧光参数的测定 |
| 2.2.5 木材特性的测定 |
| 2.2.6 感病性分析 |
| 2.2.7 内源激素含量的测定 |
| 2.2.8 生长素和细胞分裂素的免疫组织化学定位 |
| 2.2.9 数据分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 突变体苗期生长量的变异 |
| 2.3.2 突变体生长参数的变异 |
| 2.3.3 突变体株型的变异 |
| 2.3.4 突变体芽形态及解剖结构特征 |
| 2.3.5 突变体叶片形态、解剖结构及光合特性变异 |
| 2.3.6 突变体材质特性的变异 |
| 2.3.7 突变体感病性分析 |
| 2.3.8 突变体内源激素含量变化 |
| 2.3.9 突变体生长素和细胞分裂素的分布 |
| 2.3.10 突变体展叶时间和结实情况的调查 |
| 2.4 本章小结 |
| 3 基于转录组测序的白桦突变体差异基因分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器设备和实验耗材 |
| 3.1.4 主要数据库和软件 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 转录组的取材及测序 |
| 3.2.2 转录组数据分析 |
| 3.2.3 数据分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 转录组数据的评估及qRT-PCR验证 |
| 3.3.2 突变体主枝茎尖的转录组分析 |
| 3.3.3 突变体侧枝茎尖的转录组分析 |
| 3.3.4 突变体茎尖的转录组分析 |
| 3.3.5 突变体中差异基因的分析 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 白桦突变体T-DNA插入位点的鉴定 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 载体和菌株 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 主要仪器设备和实验耗材 |
| 4.1.5 主要软件和网站 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 转基因株系的分子检测 |
| 4.2.2 Southern杂交 |
| 4.2.3 TAIL-PCR确定T-DNA的插入位点 |
| 4.2.4 基因组重测序确定T-DNA的插入位点 |
| 4.2.5 突变体中突变基因BpCOI1的时空表达特异性分析 |
| 4.2.6 突变体对MeJA应答分析 |
| 4.2.7 数据分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 突变体的分子检测 |
| 4.3.2 br株系中T-DNA插入位点数目鉴定 |
| 4.3.3 br株系中T-DNA插入位点侧翼序列的分离及验证 |
| 4.3.4 突变体中BpCOI1的时空表达特异性及MeJA应答 |
| 4.4 本章小结 |
| 5 白桦BpCOI1启动子功能研究 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 植物材料 |
| 5.1.2 载体和菌株 |
| 5.1.3 主要试剂及培养基 |
| 5.1.4 主要仪器设备和实验耗材 |
| 5.1.5 主要网站和软件 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 突变基因BpCOI1启动子的克隆及序列分析 |
| 5.2.2 BpCOI1启动子融合GUS的载体构建 |
| 5.2.3 工程菌的制备 |
| 5.2.4 白桦遗传转化 |
| 5.2.5 转ProBpCOI1::GUS白桦株系的分子检测 |
| 5.2.6 转ProBpCOI1::GUS白桦株系的GUS染色 |
| 5.2.7 转ProBpCOI1::GUS白桦株系的组织表达特异性分析 |
| 5.2.8 转ProBpCOI1::GUS白桦株系对不同激素的响应分析 |
| 5.2.9 转ProBpCOI1::GUS白桦株系对不同光周期的响应分析 |
| 5.2.10 数据分析 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 BpCOI1启动子顺式作用元件预测 |
| 5.3.2 ProBpCOI1::GUS载体构建及工程菌的获得 |
| 5.3.3 转ProBpCOI1::GUS白桦株系的获得 |
| 5.3.4 转ProBpCOI1::GUS白桦株系的组织定位及表达特性 |
| 5.3.5 转ProBpCOI1::GUS白桦株系对不同激素和光周期的响应特性 |
| 5.4 本章小结 |
| 6 BpCOI1与SKP1家族互作关系验证 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 植物材料 |
| 6.1.2 载体和菌株 |
| 6.1.3 主要试剂和培养基 |
| 6.1.4 主要仪器设备和实验耗材 |
| 6.1.5 主要网站和软件 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 BpCOI1基因的克隆及亚细胞定位 |
| 6.2.2 BpCOI1基因的生物信息学分析 |
| 6.2.3 酵母双杂交 |
| 6.2.4 双分子荧光互补 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 BpCOI1基因的克隆及定位 |
| 6.3.2 BpCOI1基因的生物信息学分析及系统发育进化分析 |
| 6.3.3 BpCOI1互作蛋白的验证 |
| 6.4 本章小结 |
| 7 白桦BpCOI1基因功能研究 |
| 7.1 材料 |
| 7.1.1 植物材料 |
| 7.1.2 载体和菌株 |
| 7.1.3 主要试剂和培养基 |
| 7.1.4 主要仪器设备和实验耗材 |
| 7.1.5 主要网站和软件 |
| 7.2 实验方法 |
| 7.2.1 超表达和抑制表达载体的构建 |
| 7.2.2 工程菌的制备及白桦的遗传转化 |
| 7.2.3 BpCOI1转基因白桦的分子检测 |
| 7.2.4 BpCOI1转基因白桦的生长性状测定 |
| 7.2.5 BpCOI1转基因白桦的MeJA应答 |
| 7.2.6 BpCOI1转基因白桦的感病性分析 |
| 7.2.7 BpCOI1转基因白桦的转录组测序及qRT-PCR验证 |
| 7.2.8 数据分析 |
| 7.3 结果与分析 |
| 7.3.1 BpCOI1基因植物表达载体的构建及工程菌的获得 |
| 7.3.2 BpCOI1转基因白桦的获得 |
| 7.3.3 BpCOI1转基因白桦生长性状分析 |
| 7.3.4 BpCOI1转基因白桦MeJA应答分析 |
| 7.3.5 BpCOI1转基因白桦感病性分析 |
| 7.3.6 BpCOI1转基因白桦转录组分析 |
| 7.4 本章小结 |
| 8 讨论 |
| 8.1 T-DNA插入突变体是研究基因功能的珍贵材料 |
| 8.2 基因表达差异影响br突变体的突变表型 |
| 8.3 激素调控植物分枝发育 |
| 8.4 F-box在植物激素信号转导中发挥重要作用 |
| 8.5 BpCOI1基因对外界环境因子有不同的应答模式 |
| 8.6 br突变体和BpCOI1抑制表达株系含有相同的差异基因 |
| 8.7 COI1参与调控植物的生长发育及逆境应答 |
| 结论 |
| 工作展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 东北林业大学博士学位论文修改情况确认表 |
（4）奶牛乳房炎中葡萄球菌耐药性检测及多糖连接酶LcpC功能与机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 奶牛健康养殖 |
| 1.2 抗生素对奶牛养殖的潜在危害 |
| 1.3 奶牛乳房炎 |
| 1.3.1 奶牛乳房炎的类型及诊断 |
| 1.3.2 奶牛乳房炎的危害 |
| 1.4 引起奶牛乳房炎的主要病原菌 |
| 1.4.1 金黄色葡萄球菌 |
| 1.4.2 链球菌属 |
| 1.4.3 大肠杆菌 |
| 1.4.4 血浆凝固酶阴性的葡萄球菌 |
| 1.5 金黄色葡萄球菌的耐药性 |
| 1.5.1 青霉素和甲氧西林的耐药性 |
| 1.5.2 针对PBP2a的新型β-内酰胺类抗生素耐药性 |
| 1.5.3 万古霉素的耐药性 |
| 1.6 金黄色葡萄球菌的细胞壁 |
| 1.6.1 肽聚糖 |
| 1.6.2 壁磷壁酸 |
| 1.6.3 荚膜多糖 |
| 1.6.4 表面蛋白 |
| 1.7 Lyt R-Cps A-Psr家族蛋白 |
| 1.8 利用CRISPR-Cas9系统对金黄色葡萄球菌基因敲除 |
| 1.9 本研究的目的和意义及主要研究内容 |
| 1.9.1 研究目的和意义 |
| 1.9.2 主要研究内容 |
| 试验部分 |
| 第二章 奶牛乳房炎来源的葡萄球菌的抗性检测 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 试剂 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 Mueller-Hinton琼脂培养基 |
| 2.2.2 琼脂稀释法平板的准备 |
| 2.2.3 菌液的准备与处理 |
| 2.2.4 琼脂稀释法平板的接种和培养 |
| 2.2.5 MIC的读取 |
| 2.2.6 耐药菌株的各抗性示意图 |
| 2.3 试验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 奶牛乳腺来源的MRSA中与耐药有关基因的敲除体构建及相关表型的检测 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 菌株 |
| 3.1.2 质粒 |
| 3.1.3 引物及序列信息 |
| 3.1.4 试剂 |
| 3.1.5 主要仪器及设备 |
| 3.2 试验原理及方法 |
| 3.2.1 CRISPR-Cas9 敲除质粒的构建 |
| 3.2.2 构建过表达载体pSE1-16 |
| 3.2.3 金黄色葡萄球菌的电转感受态细胞的制备及电转化 |
| 3.2.4 构建敲除菌株 |
| 3.3 相关表型检测 |
| 3.3.1 菌株耐药性的检测 |
| 3.3.2 金黄色葡萄球菌生物膜形成能力的检测 |
| 3.3.3 统计分析方法 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 金黄色葡萄球菌转录因子敲除体库的构建 |
| 3.4.2 金黄色葡萄球菌敲除体的表型检测 |
| 3.4.3 回补敲除基因抗性表型恢复 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 细胞壁连接酶Lcp C影响MRSA耐药性及致病性的研究 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 菌株 |
| 4.1.2 质粒 |
| 4.1.3 引物及测序服务 |
| 4.1.4 细胞系 |
| 4.1.5 试剂 |
| 4.1.6 主要仪器及设备 |
| 4.2 试验原理及方法 |
| 4.2.1 构建LcpC敲除菌株 |
| 4.2.2 构建LcpC基因的原位回补菌株 |
| 4.2.3 LcpC蛋白纯化及其多克隆抗体的制备与纯化 |
| 4.2.4 LcpC敲除菌株耐药性的检测 |
| 4.2.5 细胞粘附试验 |
| 4.2.6 电镜观测LcpC敲除菌细胞壁的形态 |
| 4.2.7 小鼠脓毒血症模型 |
| 4.2.8 巨噬细胞炎症因子的检测 |
| 4.2.9 实时定量PCR试验 |
| 4.2.10 双分子荧光互补检测LcpC与其他蛋白间的相互作用 |
| 4.2.11 统计分析方法 |
| 4.3 试验结果 |
| 4.3.1 LcpC菌株的敲除与回补 |
| 4.3.2 LcpC蛋白纯化及抗体制备 |
| 4.3.3 LcpC的敲除影响金黄色葡萄球菌对多种抗生素的耐药性 |
| 4.3.4 LcpC的敲除影响金黄色葡萄球菌对细胞的粘附作用 |
| 4.3.5 LcpC的敲除影响金黄色葡萄球菌的细胞壁形态 |
| 4.3.6 Lcp C的敲除会降低MRSA对小鼠的致病性 |
| 4.3.7 LcpC的敲除降低巨噬细胞的炎症因子表达水平 |
| 4.3.8 Lcp C的敲除影响与细胞壁合成有关基因和细胞表面蛋白的m RNA水平 |
| 4.3.9 荧光双分子互补试验验证与LcpC相互作用的蛋白 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 论文总结 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 研究展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）陆地棉WAK和DUF642基因家族抗黄萎病功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词及中文对照 |
| 1 引言 |
| 1.1 棉花黄萎病 |
| 1.2 棉花抗病研究 |
| 1.2.1 生理生化抗性 |
| 1.2.2 组织结构抗性 |
| 1.2.3 抗黄萎病相关基因 |
| 1.3 植物WAK基因家族 |
| 1.4 植物DUF642基因家族 |
| 1.5 病毒诱导的基因沉默技术及其应用 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 供试材料和试验试剂 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 载体与菌株 |
| 2.1.3 试验试剂 |
| 2.1.4 试剂配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 棉苗培养 |
| 2.2.2 接菌处理与取样 |
| 2.2.3 激素处理与取样 |
| 2.2.4 组织特异表达分析及取样 |
| 2.2.5 基因鉴定与生物信息学分析 |
| 2.2.6 基因染色体定位和基因结构分析 |
| 2.2.7 基因聚类分析和蛋白结构域分析 |
| 2.2.8 基因上游顺式作用元件分析 |
| 2.2.9 转录组表达谱分析 |
| 2.2.10 RNA提取和荧光定量PCR分析 |
| 2.2.11 基因克隆 |
| 2.2.12 亚细胞定位 |
| 2.2.13 棉花VIGS |
| 2.2.14 黄萎病菌侵染检测 |
| 2.2.15 H_2O_2和NO含量,及POD活性测定 |
| 2.2.16 木质素含量测定 |
| 2.2.17 显着性分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 陆地棉WAK基因家族生物信息学分析 |
| 3.1.1 GhWAKs鉴定 |
| 3.1.2 GhWAKs结构分析 |
| 3.1.3 GhWAKs蛋白结构域分析 |
| 3.1.4 GhWAKs调控元件分析 |
| 3.2 黄萎病菌胁迫处理后GhWAKs的表达分析 |
| 3.3 GhWAK77亚细胞定位分析 |
| 3.4 GhWAK26和GhWAK77组织特异性表达分析 |
| 3.5 GhWAK26和GhWAK77沉默显着降低棉苗的黄萎病抗性 |
| 3.6 沉默GhWAK26和GhWAK77显着增加了黄萎病菌在植株中的扩展 |
| 3.7 GhWAKs基因沉默显着降低棉株体内H_2O_2、NO和木质素含量 |
| 3.8 GhWAKs沉默显着提高了植株体内POD活性 |
| 3.9 GhWAKs受SA和JA诱导表达 |
| 3.10 陆地棉DUF642基因家族生物信息学分析 |
| 3.10.1 陆地棉DUF642基因家族鉴定 |
| 3.10.2 GhDUF642基因结构分析 |
| 3.10.3 陆地棉与拟南芥DUF642家族的系统进化分析 |
| 3.10.4 GhDUF642基因启动子中顺式作用元件分析 |
| 3.10.5 GhDUF642基因的组织表达特异性分析 |
| 3.10.6 GhDUF642基因响应逆境胁迫表达分析 |
| 3.10.7 黄萎病菌胁迫处理后GhDUF642基因的表达分析 |
| 3.11 沉默GhDUF642-10显着降低棉花黄萎病抗性 |
| 4 讨论 |
| 4.1 GhWAKs和GhDUF642在棉花中可能发挥多样的功能 |
| 4.2 GhWAKs和GhDUF642参与对棉花黄萎病抗性 |
| 4.3 GhWAKs可能通过SA和JA信号参与调控棉花抗黄萎病 |
| 4.4 GhWAKs可能通过POD、木质素等参与棉花抗黄萎病 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录A 试验中所用载体结构示意图 |
| 在读期间发表的学术论文 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
| 附件 |
（6）Gb3在蜡样芽孢杆菌感染过程中的作用与机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 Gb3促进蜡样芽孢杆菌导致的急性感染 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株和质粒 |
| 1.1.2 细胞和动物 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 蜡样芽孢杆菌培养 |
| 1.2.2 蜡样芽孢杆菌感染小鼠 |
| 1.2.3 小鼠存活实验 |
| 1.2.4 小鼠脏器细菌载量计数 |
| 1.2.5 细胞因子测定 |
| 1.2.6 组织病理学评估 |
| 1.2.7 蜡样芽孢杆菌基因plc R敲除株的构建 |
| 1.2.8 细菌粘附实验 |
| 1.2.9 统计分析 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 小鼠存活实验 |
| 1.3.2 小鼠脏器细菌载量和血清细胞因子的测定 |
| 1.3.3 小鼠组织病理切片分析 |
| 1.3.4 蜡样芽孢杆菌基因plc R敲除株的构建 |
| 1.3.5 蜡样芽孢杆菌分泌毒力因子导致小鼠急性死亡 |
| 1.3.6 某蜡样芽孢杆菌表面成分与Gb3相互作用 |
| 1.4 讨论 |
| 第二章 蜡样芽孢杆菌鞭毛蛋白与宿主细胞表面Gb3的相互作用 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株和质粒 |
| 2.1.2 细胞和动物 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 纯化和分析与Galα1-4Gal二糖结构结合的蜡样芽孢杆菌蛋白 |
| 2.2.2 重组鞭毛蛋白的表达与纯化 |
| 2.2.3 蜡样芽孢杆菌鞭毛蛋白与鸽卵类粘蛋白亲和常数的测定 |
| 2.2.4 流式细胞计数检测鞭毛蛋白与细胞表面Gb3结合 |
| 2.2.5 电子显微镜观察蜡样芽孢杆菌粘附 |
| 2.2.6 蜡样芽孢杆菌基因fla敲除株的构建 |
| 2.2.7 共聚焦显微镜观察蜡样芽孢杆菌粘附 |
| 2.2.8 蜡样芽孢杆菌天然鞭毛蛋白的提取 |
| 2.2.9 鞭毛蛋白抗血清的制备及抗体纯化 |
| 2.2.10 免疫印迹分析 |
| 2.2.11 统计分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 鉴定与Galα1-4Gal结合的蜡样芽孢杆菌蛋白 |
| 2.3.2 重组表达载体构建和蛋白的表达纯化 |
| 2.3.3 蜡样芽孢杆菌鞭毛蛋白与鸽卵类粘蛋白亲和常数的测定 |
| 2.3.4 流式细胞技术检测鞭毛蛋白与细胞表面的Gb3结合 |
| 2.3.5 蜡样芽孢杆菌天然鞭毛蛋白的提取 |
| 2.3.6 蜡样芽孢杆菌鞭毛蛋白敲除株的构建 |
| 2.3.7 蜡样芽孢杆菌鞭毛蛋白有助于细菌粘附 |
| 2.3.8 鞭毛蛋白与细胞表面Gb3相互作用有助于细菌粘附 |
| 2.3.9 鞭毛蛋白与Gb3参与蜡样芽孢杆菌感染小鼠过程 |
| 2.3.10 抗蜡样芽孢杆菌鞭毛抗体的制备 |
| 2.3.11 抗鞭毛抗体对蜡样芽孢杆菌感染小鼠具有保护作用。 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 蜡样芽孢杆菌鞘磷脂酶作用机制初步研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 菌株和质粒 |
| 3.1.2 细胞和动物 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 蜡样芽孢杆菌鞘磷脂酶基因敲除株的构建 |
| 3.2.2 蜡样芽孢杆菌鞘磷脂酶基因敲除株的鉴定 |
| 3.2.3 ELISA检测小鼠血清TNFα 水平 |
| 3.2.4 激光扫描共聚焦显微镜观察神经酰胺的释放 |
| 3.2.5 统计分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 蜡样芽孢杆菌鞘磷脂酶基因敲除株的构建和鉴定 |
| 3.3.2 鞘磷脂酶基因的敲除降低了蜡样芽孢杆菌毒力 |
| 3.3.3 蜡样芽孢杆菌鞘磷脂酶可以促进宿主细胞神经酰胺的释放 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 作者在学期间取得的学术成果 |
| 附件 |
| 主要简历 |
| 致谢 |
（7）苏云金芽胞杆菌Vip3Aa39的改造（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 苏云金芽胞杆菌简介 |
| 1.1.1 Bt的分布及特征 |
| 1.1.2 Bt菌株分离及杀虫基因的鉴定方法 |
| 1.1.3 杀虫晶体蛋白 |
| 1.1.4 抗癌晶体蛋白 |
| 1.2 Vip简述 |
| 1.2.1 Vip的命名 |
| 1.2.2 Vip的分类 |
| 1.2.3 Vip3的杀虫机理 |
| 1.2.4 Vip3蛋白的应用 |
| 1.3 Bt蛋白的改造方式 |
| 1.3.1 定点突变 |
| 1.3.2 重组蛋白 |
| 1.3.3 随机突变 |
| 1.4 重要的鳞翅目害虫 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 1.6 技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 vip3A杀虫基因筛选的试验材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试验方法 |
| 2.2 vip3A嵌合基因构建的试验材料与方法 |
| 2.2.1 试验材料 |
| 2.2.2 试验方法 |
| 2.3 vip3Aa39基因突变的试验材料与方法 |
| 2.3.1 试验材料 |
| 2.3.2 试验方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 vip3A基因发掘 |
| 3.1.1 Bt菌株的分离鉴定 |
| 3.1.2 vip3A基因的鉴定 |
| 3.1.3 vip3Ad基因的克隆表达 |
| 3.1.4 室内杀虫活性测定 |
| 3.2 Vip3Aa39与Vip3Ad嵌合蛋白 |
| 3.2.1 嵌合基因的获得 |
| 3.2.2 Vip3Aa39 和嵌合蛋白的结构分析 |
| 3.2.3 嵌合蛋白的SDS-PAGE分析 |
| 3.2.4 嵌合蛋白的胰蛋白酶消化处理 |
| 3.2.5 嵌合蛋白杀虫活性分析 |
| 3.3 Vip3Aa39定点突变 |
| 3.3.1 突变位点确定 |
| 3.3.2 含vip3Aa39的表达载体的构建 |
| 3.3.3 突变基因的克隆 |
| 3.3.4 Vip3Aa39与突变体蛋白的表达与分析 |
| 3.3.5 胰蛋白酶的敏感性分析 |
| 3.3.6 杀虫活性测定 |
| 3.3.7 Vip3Aa39突变蛋白结构分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 vip3A基因资源挖掘 |
| 4.2 Vip3Aa39 和 Vip3Ad 的嵌合蛋白 |
| 4.3 Vip3Aa39定点突变 |
| 5 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（8）苏云金芽孢杆菌内毒素CryIVD重组表达及灭蝇效果评估（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文符号表 |
| 文献综述 |
| 1.1 家蝇的特征及防治现状 |
| 1.1.1 家蝇的形态特征 |
| 1.1.2 家蝇的生物学特性 |
| 1.2 家蝇的危害及其防治 |
| 1.2.1 家蝇的主要危害 |
| 1.2.2 家蝇的防治现状 |
| 1.3 苏云金芽孢杆菌及其应用研究进展 |
| 1.3.1 Cry蛋白的生物学特性 |
| 1.3.2 Cry蛋白的作用机理 |
| 1.3.3 Cry蛋白的研究进展 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 菌株和载体 |
| 2.2 试验家蝇 |
| 2.3 培养基和试剂 |
| 2.4 实验仪器 |
| 2.5 苏云金芽孢杆菌质粒的提取 |
| 2.6 核酸琼脂糖凝胶电泳分析 |
| 2.7 大肠杆菌(DH5α)感受态的制备 |
| 2.8 目的基因的克隆 |
| 2.8.1 目的基因引物设计 |
| 2.8.2 CryIVD基因PCR扩增 |
| 2.9 CryIVD基因PCR产物胶回收 |
| 2.10 构建克隆载体pMD-19-T-CryIVD |
| 2.11 PCR鉴定pMD-19-T-CryIVD克隆 |
| 2.12 重组质粒pMD-19-T-CryIVD的提取 |
| 2.13 重组质粒pMD-19-T-CryIVD双酶切与产物的纯化 |
| 2.14 pGEX-4T-1-CryIVD原核表达载体的构建 |
| 2.15 PCR鉴定重组质粒pGEX-4T-1-CryIVD |
| 2.16 CryIVD基因的原核表达 |
| 2.17 SDS-PAGE分析重组蛋白的表达情况 |
| 2.17.1 SDS-PAGE检测 |
| 2.17.2 制胶和上样 |
| 2.17.3 电泳 |
| 2.17.4 染色和脱色 |
| 2.18 Western-blot鉴定重组蛋白 |
| 2.18.1 SDS-PAGE阶段 |
| 2.18.2 电转移阶段 |
| 2.18.3 免疫应答及显色反应 |
| 2.19 CryIVD杀虫蛋白杀蝇毒效观察 |
| 2.19.1 CryIVD杀虫蛋白对蝇卵毒效的初步观察 |
| 2.19.2 CryIVD杀虫蛋白对蝇卵的毒力测定 |
| 2.19.3 CryIVD杀虫蛋白对家蝇成虫的毒力测定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 目的基因的PCR扩增 |
| 3.2 克隆载体pMD-19-T-CryIVD的PCR鉴定 |
| 3.3 克隆载体的酶切鉴定 |
| 3.4 CryIVD基因的测序结果 |
| 3.5 基因进化树结果 |
| 3.6 重组质粒表达载体pGEX-4T-1-CryIVD的鉴定 |
| 3.7 CryIVD基因的原核表达 |
| 3.8 免疫印迹结果 |
| 3.9 CryIVD杀虫蛋白杀蝇毒效观察 |
| 3.9.1 杀虫蛋白对蝇卵毒效的初步观察结果 |
| 3.9.2 蝇卵急性毒理试验结果 |
| 3.9.3 家蝇成虫急性毒理试验结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 苏云金杆菌作为新型杀虫剂研制与应用 |
| 4.2 CryIVD基因表达与利用 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（9）对灰飞虱高毒力的新型Bt杀虫蛋白基因克隆及其活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 灰飞虱危害与防治 |
| 1.2 苏云金芽胞杆菌 |
| 1.2.1 Bt杀虫蛋白 |
| 1.2.2 Cry蛋白与三维结构 |
| 1.2.3 Bt蛋白成孔及杀虫机理 |
| 1.3 Bt蛋白与刺吸式口器害虫 |
| 1.3.1 Bt蛋白对刺吸式害虫的活性 |
| 1.3.2 Bt蛋白对刺吸式害虫的活性低的原因 |
| 1.4 转Bt基因作物Cry蛋白的食用安全性 |
| 1.4.1 Cry蛋白的热稳定性 |
| 1.4.2 Cry蛋白的消化稳定性 |
| 1.4.3 Cry蛋白的过敏原性 |
| 1.4.4 Cry蛋白的动物毒理学实验 |
| 1.5 Bt新基因的鉴定方法 |
| 1.5.1 DNA层面的Bt新基因鉴定 |
| 1.5.2 蛋白层面的Bt新基因鉴定 |
| 1.5.3 高通量测序水平的Bt新基因挖掘 |
| 1.6 本研究的立题依据与目的意义 |
| 1.6.1 立题依据 |
| 1.6.2 目的意义 |
| 第二章 对灰飞虱有活性的Bt菌株筛选与分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 候选菌株 |
| 2.1.2 供试昆虫与饲料 |
| 2.1.3 培养基 |
| 2.1.4 酶与生化试剂 |
| 2.1.5 常用仪器与设备 |
| 2.1.6 常用试剂与溶液 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 cry78-like序列的生物信息学分析 |
| 2.2.2 cry64-like序列的生物信息学分析 |
| 2.2.3 候选Bt菌株晶体蛋白的提取 |
| 2.2.4 候选Bt菌株晶体蛋白的生物活性测定 |
| 2.2.5 活性菌株蛋白处理与活性检测 |
| 2.2.6 活性菌株芽胞晶体形态观察 |
| 2.2.7 活性菌株基因组分析与杀虫基因注释 |
| 2.2.8 无活性菌株蛋白胰蛋白酶消化与生测 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 cry78-like序列的生物信息学分析情况 |
| 2.3.2 cry64-like序列的生物信息学分析情况 |
| 2.3.3 候选Bt菌株晶体蛋白的提取与活性测定结果 |
| 2.3.4 活性菌株蛋白处理与活性成分确定结果 |
| 2.3.5 活性菌株芽胞晶体形态观察结果 |
| 2.3.6 活性菌株基因组分析与杀虫基因注释情况 |
| 2.3.7 无活性菌株蛋白胰蛋白酶消化的活性对比结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 新型杀虫蛋白表达与特性研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌株与质粒 |
| 3.1.2 供试昆虫与饲料 |
| 3.1.3 培养基与抗生素 |
| 3.1.4 酶与生化试剂 |
| 3.1.5 常用仪器与设备 |
| 3.1.6 常用试剂与溶液 |
| 3.1.7 消化实验相关试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 Bt基因组提取 |
| 3.2.2 cry78-like基因的克隆、表达与生测 |
| 3.2.3 新型杀虫基因gene6来源菌株特征分析 |
| 3.2.4 新型杀虫基因gene6分子特征分析 |
| 3.2.5 新型杀虫蛋白Cry78Ba1热稳定性分析 |
| 3.2.6 新型杀虫蛋白Cry78Ba1消化稳定性分析 |
| 3.2.7 新型杀虫蛋白Cry78Ba1过敏原蛋白及结构分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 Bt基因组提取 |
| 3.3.2 cry78-like基因的克隆、表达与纯化 |
| 3.3.3 Cry78-like蛋白的生物活性测定 |
| 3.3.4 新型杀虫基因gene6来源菌株特征分析 |
| 3.3.5 新型杀虫基因gene6分子特征 |
| 3.3.6 新型杀虫蛋白Cry78Ba1热稳定性分析 |
| 3.3.7 新型杀虫蛋白Cry78Ba1消化稳定性分析 |
| 3.3.8 新型杀虫蛋白Cry78Ba1过敏原蛋白及结构分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（10）中华鳖“摇头病”病原的分离鉴定及其对中华鳖4个免疫相关基因的影响研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 中华鳖概述 |
| 1.1.1 中华鳖的分类地位及价值 |
| 1.1.2 中华鳖产业发展现状 |
| 1.2 蜡样芽胞杆菌情况概述 |
| 1.2.1 蜡样芽孢杆菌无毒菌株应用现状 |
| 1.2.2 蜡样芽胞杆菌有毒菌株致病现象 |
| 1.2.3 蜡样芽胞杆菌有毒菌株的致病原因 |
| 1.3 TOLL样受体(TLRS)与获得性免疫 |
| 1.3.1 Toll样受体(TLRs)概况 |
| 1.3.2 TLRs对获得性免疫影响 |
| 1.4 本研究的意义及技术路线 |
| 1.4.1 选题意义 |
| 1.4.2 技术路线 |
| 第2章 中华鳖“摇头病”病原的分离与鉴定 |
| 引言 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要实验耗材 |
| 2.1.2 主要实验仪器 |
| 2.1.3 实验所用引物序列 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 病原菌的分离与培养 |
| 2.2.2 病原菌16S r DNA、gyrB和 rpoB序列的PCR扩增和系统进化树构建 |
| 2.2.3 分离菌的生理生化鉴定 |
| 2.2.4 人工感染试验及半致死浓度的测定 |
| 2.2.5 药敏试验 |
| 2.2.6 数据分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 病原菌分离及形态观察 |
| 2.3.2 功能基因序列分析及系统进化树构建 |
| 2.3.3 生理生化鉴定结果 |
| 2.3.4 人工感染试验结果 |
| 2.3.5 药敏试验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 蜡样芽孢杆菌的致病性 |
| 2.4.2 清溪乌鳖“摇头症”的发病原因及防控技术 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 蜡样芽胞杆菌XS0724的毒力基因及其对中华鳖的组织病理切片分析 |
| 引言 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 主要实验耗材 |
| 3.1.2 主要实验仪器 |
| 3.1.3 实验所用引物 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 毒力基因的PCR反应 |
| 3.2.2 蜡样芽胞杆菌XS0724感染对中华鳖组织侵袭情况的观察 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 蜡样芽胞杆菌XS0724所包含的毒力基因情况 |
| 3.3.2 中华鳖内脏组织的切片结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 蜡样芽胞杆菌XS0724对中华鳖脾脏组织转录组的影响 |
| 引言 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 中华鳖的蜡样芽胞杆菌感染 |
| 4.2.2 中华鳖脾脏的采集及转录组测序 |
| 4.2.3 数据处理与分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 测序数据质量评估 |
| 4.3.2 拼接结果统计 |
| 4.3.3 样本重复相关性评估 |
| 4.3.4 差异表达基因情况 |
| 4.3.5 差异表达基因GO分析 |
| 4.3.6 差异表达基因的KEGG注释分析 |
| 4.3.7 差异表达基因的KEGG通路富集分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 蜡样芽胞杆菌XS0724侵染对中华鳖各组织免疫基因的影响 |
| 引言 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 主要实验仪器 |
| 5.1.2 主要实验耗材 |
| 5.1.3 实验所用引物 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 中华鳖的XS0724菌感染试验 |
| 5.2.2 中华鳖各组织RNA的提取 |
| 5.2.3 组织RNA的反转录 |
| 5.2.4 荧光定量检测中华鳖My D88、TLR2、TLR3、TLR4 mRNA在不同组织的表达 |
| 5.2.5 数据处理与分析 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 蜡样芽胞杆菌XS0724 感染中华鳖后组织My D88 mRNA表达差异分析 |
| 5.3.2 蜡样芽胞杆菌XS0724 感染中华鳖后组织TLR2 mRNA表达差异分析 |
| 5.3.3 蜡样芽胞杆菌XS0724 感染中华鳖后组织TLR3 mRNA表达差异分析 |
| 5.3.4 蜡样芽胞杆菌XS0724 感染中华鳖后组织TLR4 mRNA表达差异分析 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第6章 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
四、韭蛆病原菌cyt基因的克隆及工程菌株的构建（论文参考文献）
- [1]异硫氰酸烯丙酯及CO2浓度升高对异迟眼蕈蚊的影响[D]. 苟玉萍. 甘肃农业大学, 2021(01)
- [2]杀鲑气单胞菌的筛选及其细胞毒素的鉴定[D]. 刘智鹏. 湖南师范大学, 2020(03)
- [3]白桦T-DNA插入突变体的鉴定及突变基因BpCOI1功能研究[D]. 韩锐. 东北林业大学, 2020
- [4]奶牛乳房炎中葡萄球菌耐药性检测及多糖连接酶LcpC功能与机制研究[D]. 李帆. 西北农林科技大学, 2020
- [5]陆地棉WAK和DUF642基因家族抗黄萎病功能分析[D]. 解美霞. 河北农业大学, 2020(01)
- [6]Gb3在蜡样芽孢杆菌感染过程中的作用与机制研究[D]. 高嵩. 军事科学院, 2020(02)
- [7]苏云金芽胞杆菌Vip3Aa39的改造[D]. 于爽. 东北农业大学, 2020
- [8]苏云金芽孢杆菌内毒素CryIVD重组表达及灭蝇效果评估[D]. 孔浩然. 安徽农业大学, 2020(04)
- [9]对灰飞虱高毒力的新型Bt杀虫蛋白基因克隆及其活性研究[D]. 曹蓓蓓. 中国农业科学院, 2020
- [10]中华鳖“摇头病”病原的分离鉴定及其对中华鳖4个免疫相关基因的影响研究[D]. 李延利. 西南大学, 2020