一、The Development of Gel Media and Columns for Large-Scale Chromatography of Proteins, a Historical Review（论文文献综述）
白江琦[1]（2021）在《聚合物模板法制备5μm单分散全多孔硅胶微球及其在色谱分离中的应用》文中研究说明高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography,HPLC）是复杂样品分离分析的重要手段。色谱柱是HPLC分离技术的核心,色谱填料的发展是HPLC技术发展的主要推动力。色谱基质性能的优劣直接关系到色谱填料的分离性能,是高效分离介质制备的基础。硅胶微球由于其具有较高的机械强度、较大的比表面积及表面易改性等优点,是目前应用最为广泛的色谱基质。全多孔硅胶微球具有孔隙率高,比表面积大,负载量高等优点,目前仍然是液相色谱基质的主流。制备高性能的单分散全多孔硅胶微球,实现对组分的高效、快速分离一直是色谱工作者追求的目标。针对目前全多孔硅胶微球制备过程中存在球形不均一、单分散性差、粒径分布宽、孔径难以精准调控等问题,本研究以多孔聚合物微球为模板,实现了5μm全多孔硅胶微球的可控制备。研究了聚合物微球制备中致孔剂用量、不同氨基功能化试剂、正硅酸乙酯（TEOS）和模板微球的投料比以及煅烧温度对多孔硅胶微球孔径的影响。通过优化实验条件,分别制备出了适用于小分子和蛋白质分离的小孔和大孔硅胶。通过硅胶表面改性,在反相色谱模式下对小分子和蛋白质的色谱分离性能进行了表征,结果表明本方法可实现对全多孔硅胶微球孔径的调控。采用本研究制备的全多孔硅胶微球制备的液相色谱固定相可用于蛋白质和小分子的高效分离。本论文主要包括以下四个部分:1.绪论对硅胶基质的发展和多孔硅胶微球的制备方法进行综述。介绍了硅胶基质的类型及发展历史,并探讨和分析了多孔硅胶微球多种制备方法的优缺点,如聚合物模板法、溶胶凝胶法、喷雾干燥法和聚合诱导胶体凝聚法等。2.5μm全多孔硅胶微球的制备及表征采用种子溶胀法制备了5μm PGMA-EDMA多孔聚合物微球,并利用四乙烯五胺（TEPA）对聚合物微球进行氨基化改性。以氨基功能化的聚合物为模板成功制备出粒径为5μm、单分散性良好的大孔硅胶微球。研究了致孔剂用量、不同的氨基功能化试剂、TEOS和PGMA-EDMA模板微球的投料比以及煅烧温度对多孔硅胶微球孔径的影响。利用红外、热重、扫描电镜等对所制备的硅胶微球的形貌和结构进行了表征,并通过压汞法测定了所制备硅胶微球的孔径为69 nm,比表面积为108.6 m2/g。3.大孔径硅胶微球在蛋白质分离中的应用采用不同链长的烷基硅烷化试剂(C4H9SiCl3、C8H17SiCl3、C18H37SiCl3)对大孔二氧化硅微球进行表面改性,得到三种反相键合填料,分别对标准蛋白进行分离。结果表明,制备的反相色谱填料对蛋白具有较好的分离效果,三种色谱柱都能实现对7种标准蛋白的完全分离,分离效果优于商品柱。比较3种反相色谱柱对蛋白质的分离结果,表明,Silica-C4柱对蛋白的分离效果和质量回收率更高,更适合用于蛋白质的分离。4.小孔径硅胶微球的制备及在色谱分离中的应用以三甲胺盐酸盐（TMA）为氨基功能化试剂,利用TMA功能化的聚合物微球为模板,成功制备出了5μm小孔硅胶微球,并利用十八烷基三氯硅烷对合成的5μm小孔径硅胶进行改性,在反相模式下对三组极性和非极性小分子溶质进行分离,通过分离度、理论塔板数、分离因子等色谱参数对色谱柱分离性能进行评价。结果表明所制备的反相色谱柱对三组小分子溶质具有较好的分离效果,与商品ODS柱的分离效果相当。以己苯计算,其理论塔板数可达69753块/m,具有较好的分离度和分离重现性。上述结果表明以小孔硅胶微球为基质制备的反相色谱固定相可以用于小分子的分离,但与商品柱相比,其对样品溶质的保留较弱,这可能是由于硅胶表面C18键合密度较低所致,还需对其实验条件进一步进行优化。综上所述,通过选择不同的氨基功能化试剂,利用聚合物模板法制备大孔和小孔单分散全多孔硅胶微球可作为基质用于液相色谱固定相的制备,并用于蛋白质和小分子溶质的高效分离。
盛安然[2]（2021）在《基于质谱的糖胺聚糖结构表征及其与蛋白互作分子机制研究》文中研究表明糖胺聚糖（Glycosaminoglycans,GAGs）是一类异质性极高、结构十分复杂的生物大分子,广泛存在于哺乳动物的细胞表面和细胞外基质中。GAGs的糖链骨架主要由己糖醛酸或半乳糖与己糖胺连接的重复二糖单元组成。根据糖苷键连接形式、硫酸化程度以及硫酸化位置的不同,可以将GAGs分为肝素/硫酸乙酰肝素（Heparan sulfate,HS）、硫酸软骨素/硫酸皮肤素（Dermatan sulfate,DS）、硫酸角质素和透明质酸四类。与其他GAGs相比,肝素和HS具有更多变的硫酸化位点和高的负电荷密度,并在生物体内参与多种生物学过程的调控,使其成为GAGs家族中结构最复杂且重要的一类多糖。由于GAGs糖链的分子量大、结构组成复杂,对于糖链结构的表征十分困难。目前,大多数分析方法都集中在对多糖整体的组成单元或寡糖片段的分析上,对于较高分子量的糖链由于色谱分离的分辨率较低难以被具体表征,而GAGs与其靶蛋白的相互作用通常需要一定的糖链长度。因此,本研究的第一个目标是开发适用于较大GAGs糖链的结构表征方法,为直接阐明这些具有更重要生物意义的相对较大的糖链结构提供强有力的工具。GAGs在许多生物过程中起至关重要的作用,包括细胞信号转导、识别、迁移和粘附等。在人体内,GAGs还参与多种疾病的发生和发展,例如肿瘤、炎症和传染性疾病。并且,GAGs还具有广泛的生物学活性,包括抗炎、抗凝、抗肿瘤转移和控制血管生成等。除了作为生物体内重要的活性物质外,GAGs也作为一类重要的生物药物在临床广泛使用了数十年。此外,用于治疗各种急性或慢性疾病的新型的GAGs药物也在持续不断的开发中。GAGs具有上述重要功能主要依赖于其与蛋白的相互作用,两者间的相互作用是通过各自结构中的特征序列特异性识别实现的。例如肝素的抗凝血作用是通过糖链中的一个特定的含有3-O-S的核心五糖序列与抗凝血酶III特异性结合实现的。因此,阐明GAGs与蛋白相互作用中的关键序列和分子机制对于寻找特定靶向GAGs-蛋白相互作用的新型疗法至关重要。本研究的第二个目标是以质谱（Mass spectrometry,MS）为主要技术手段,开发一套GAGs与蛋白相互作用分子机制的研究策略。我们选择以肝素及其相互作用蛋白干扰素-γ（Interferon-γ,IFN-y）作为模式研究对象,从糖链长度和序列等方面阐明肝素与IFN-γ相互作用的分子机制,为更多GAGs与蛋白相互作用的研究提供快速准确的分析策略。本论文的主要研究成果如下:1.建立了一套聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE）与MS联用的糖链分析方法PAGE是表征GAGs结构和性质的强大工具之一,相比于液相色谱方法具有更广泛的糖链分子量分布适用范围,但由于未能提供糖链结构信息,PAGE的应用十分受限。为此,我们将蛋白胶内酶解的策略应用到GAGs的分析中,利用聚丙烯酰胺凝胶可以脱水收缩及吸水溶胀的特点,建立了一套新的GAGs提取方法,将PAGE与具有超高灵敏度的LC-MS/MS结合进行GAGs糖链的表征。通过该方法我们对肝素糖链进行了全面的结构分析。从电泳银染结果看,肝素在PAGE中的分布是连续的,且条带之间没有明显的界限。我们将肝素条带等分成20段,分别进行胶内酶解和LC-MS/MS分析。在其中的12段凝胶中检测到了 8种来源于骨架结构的二糖和3种来源于非还原端（Non-reducingend,NRE）的饱和二糖。根据饱和二糖与骨架二糖的分子量和比例,计算得到糖链的分子量。在PAGE中,肝素糖链的分子量范围为3.9 kDa至46.8 kDa,平均分子量为14.4 kDa,且糖链的迁移距离与分子量的对数成反比关系。在不同的凝胶区间中,肝素糖链的二糖组成基本一致,这表明肝素糖链在PAGE中的分离,不受糖链负电荷密度的影响,按照分子量大小均匀且连续分布。我们还对比了直接酶解和胶内提取方法得到的肝素二糖,两者的二糖组成和含量基本一致,表明PAGE-MS方法能够保证GAGs糖链的结构信息完整。另外,经过方法验证,PAGE-MS方法还具有良好的可靠性和可重复性。PAGE-MS方法结合了 PAGE的高分离能力与MS的高灵敏度和高信息含量,为不同来源的肝素/HS糖链表征以及肝素药物的结构一致性评价提供了强大的工具支持。2.建立了一套琼脂糖凝胶电泳（Agarose-gel electrophoresis,AGE）与MS联用的糖链结构表征方法AGE是另外一种常被用于多组分GAGs糖链的直接分离分析的电泳方法。但由于凝胶性质不同,肝素酶难以进入琼脂糖凝胶,胶内酶解方法对AGE并不适用。因此,我们开发了一套针对AGE的样品提取方法。该方法是基于琼脂糖凝胶在相对较低的温度下加热即可熔化的特点实现的。含有糖链的AGE条带加热熔化为液体,经过强阴离子交换（Strong anion exchange,SAX）瞬时离心柱回收以及GAGs酶处理,得到的组成单元使用LC-MS/MS进行定性和相对定量分析,实现各组分糖链结构的表征。应用这一方法,我们选择了一种具有代表性的多分组GAGs药物舒洛地特进行结构分析。舒洛地特在琼脂糖凝胶中具有三个明显的条带,包括快速移动肝素（Fast-movingheparin,FMH）和DS两个主要的组分,以及含量极少的慢速移动肝素（Slow-movingheparin,SMH）。三个条带分别使用SAX提取和肝素酶或硫酸软骨素酶降解,最后经过优化后的LC-MS/MS方法分析。在FMH中,共定性和定量到17种基本组成单元,分别来自糖链的NRE、中间骨架、核心五糖及还原端（Reducingend,RE）结构。根据末端和骨架结构的比例计算,FMH的平均分子量为10.7 kDa。而在SMH中,共有13种结构被定量,平均分子量为15.4 kDa。根据两者的硫酸化程度判断,SMH具有更典型的肝素结构,FMH则可以看作是分子量较低的低硫酸化肝素。DS的糖链结构相对简单,共鉴定到13种基本组成单元,平均分子量为19.9 kDa。根据LC-MS/MS定量的舒洛地特的三个组成比例与AGE凝胶直接染色得到的结果基本一致。此外,我们还首次应用了核磁技术的一种扩散排序谱（Diffusion-ordered spectroscopy,DOSY）分析了舒洛地特,在谱图的不同扩散系数范围内分别归属到了肝素/HS和DS的特征信号峰,估算两者比例约为3:1,这一结果与AGE-MS方法得到的组成一致。AGE与MS与DOSY方法为直接表征多组分GAGs样品提供了新思路。3.采用氢氘交换-MS 法（Hydrogen/Deuteriumexchange-MS,HDX-MS）研究不同聚合度肝素糖链与IFN-γ的相互作用糖链长度是GAGs与蛋白相互作用的关键因素之一。我们将HDX-MS方法应用到不同聚合度肝素糖链与IFN-γ的相互作用的研究中,通过对不同肽段氘代率的变化和IFN-γ三维构象的分析,阐明两者的结合模式。首先从IFN-γ酶解产物中筛选出10条长度合适且能覆盖氨基酸全序列的肽段用于后续分析,其中包含文献报道的两个已知的肝素结合域D1（KTGKRKR）和D2（RGRR）。然后对氘代时间、肝素与IFN-γ结合比等条件进行优化,再将不同糖链长度的肝素与IFN-γ分别进行HDX-MS分析,计算得到各条肽段的氘代率变化曲线,并将它们分为稳定型、持续下降型、平台稳定型及多平台下降型四类。根据各类肽段氘代率的变化趋势与其在IFN-γ蛋白空间位置、碱性氨基酸分布及分子长度相结合,推测出当糖链长度较短时,糖链与IFN-γ表面的碱性氨基酸簇相互吸引;随着糖链长度增长,糖链在与D1相互作用的同时还向IFN-γ二聚体的另一侧延伸;当糖链长度达到dp20左右时,可以同时覆盖IFN-y二聚体的两个D1区域;并在dp28时糖链与二聚体的构象达到稳定,部分肽段的氘代率不再发生变化,同时糖链开始进一步固定D2区域。在此过程中,IFN-γ的局部构象也因相互作用发生了改变。GAGs与蛋白的HDX-MS分析,不仅可以得到蛋白的特征结合域和构象变化等信息,还可以阐明不同聚合度糖链与蛋白的结合方式,为GAGs与蛋白相互作用的研究提供了强有力的技术支持。4.表征了肝素与IFN-γ相互作用的糖链序列结构GAGs糖链中包含的特殊序列对多糖与蛋白的结合至关重要。我们基于亲和色谱、质谱以及计算机技术,对肝素糖链中IFN-γ的特征结合序列进行了表征。不同聚合度的肝素糖链首先使用IFN-γ亲和柱富集得到具有亲和性的糖链,经LC-MS分析,与未经富集糖链相比,亲和糖链的糖链长度和硫酸化程度较高。分离得到亲和糖链中的dp8进行测序分析。为了解决MS/MS测定复杂混合寡糖序列的难题,我们开发了一款计算机辅助测序软件,该软件是将相同聚合度的混合糖链的二糖组成经过排列组合和概率计算,得到所有可能的糖链序列及其相对含量。亲和dp8经过计算机软件计算和二级质谱测序,最终得到5个确定的糖链序列。这些结构都包含一个五糖序列“-GlcNS6S-IdoA2S-GlcNS6S-IdoA2S-G1cNS6S-”,这一结构无论从单糖个数、硫酸化程度还是序列对称性都满足与二聚体IFN-γ的任意一个D1区域相互作用。并且,在亲和dp24中,含有两个能分别与二聚体IFN-y的两个D1相互作用五糖序列的糖链含量比未经富集的糖链增加了 1.7倍,这一结果也从侧面说明糖链与IFN-γ两个C末端相互作用需要至少两个全硫酸的五糖结构。另外,IFN-γ与五糖序列的分子对接结果表明,糖链主要与D1区域结合,且更易受到IFN-γ两个C端中心区域的碱性氨基酸吸引。两者的结合是由静电力主导,并且D1区域中的四个碱性氨基酸残基和五糖中几乎所有的酸性基团都参与了两者的相互作用。计算机对接结果进一步说明肝素糖链中的五糖结构在两者结合中的重要性。这一序列的发现为设计人工干预IFN-γ的靶向药物提供了重要的理论依据。同时,亲和色谱、计算机辅助测序和质谱测序以及分子对接相结合的分析策略也可以用于更多GAGs特征序列的研究。
钟卓珩[3]（2021）在《UVB诱导长春花及白桑次生代谢激活及调控的系统生物学研究》文中指出药用植物次生代谢产物是创新药物的重要来源。长春花中的吲哚生物碱与白桑中的异戊烯基化合物均具良好的生物活性,吲哚生物碱及其衍生物广泛用于肿瘤的临床治疗领域;但这些化合物在天然植株中的含量偏低,化学合成难度大,严重阻碍了大规模开发应用。前期研究表明,紫外线B（Ultraviolet B,UVB）辐射作为一种诱导因子,与暗培养手段结合,能引起长春花和白桑体内次生代谢物合成关键酶的响应并相应提升吲哚生物碱与Diels-Alder型加合物及其前体的含量,增加其药用价值,但UVB辐射下涉及的次生代谢激活及调控机制,如在信号转导、能量产生等方面,仍不清楚。本论文基于系统生物学研究思路,整合蛋白质组学、代谢组学、分子生物学等手段,对长春花及白桑响应UVB辐射的分子机理进行了探究,为阐明药用植物中活性成分生物合成机制奠定了基础,主要内容和结果如下:（1）UVB辐射下长春花磷酸化信号通路及初生代谢变化研究为探究UVB辐射下长春花叶片的响应,开展了ATP含量测定、磷酸化蛋白质组学分析、GC-MS代谢组学分析及Western-Blotting实验。结果表明,在UVB辐射下,叶片中ATP含量显着上升;磷酸化蛋白质组学分析鉴定了242个变化的磷酸化蛋白,这些磷酸化蛋白主要与蛋白质合成、修饰、降解及信号传递、转导相关,其中钙调蛋白、钙离子依赖型蛋白激酶、热激蛋白含量显着增加;GCMS代谢组学分析鉴定了110个变化的代谢物,主要属于糖类、有机酸类、氨基酸类、醇类,其中戊糖类、芳香族氨基酸类、苯丙素类代谢物显着增加;整合组学数据与Western-Blotting结果发现,糖酵解与活性氧清除系统相关途径显着变化。这些结果说明,UVB辐射对植物造成了氧化胁迫,并激活了钙离子依赖型的蛋白磷酸化/去磷酸化修饰。一方面,糖酵解途径蛋白精准调控,三羧酸循环上调,促进了ATP生成,为次生代谢中的合成反应提供能量;另一方面,氧化还原反应相关的蛋白上调,并参与催化部分次生代谢中的反应,进一步促进次生代谢物积累。（2）UVB辐射下长春花能量调控及次生代谢物积累研究为进一步探究UVB辐射下长春花叶片中线粒体对能量调控的作用及与次生代谢的联系,开展了线粒体酶活抑制实验、亚细胞器蛋白质组学分析、LC-MS靶向/非靶向代谢组学分析及q RT-PCR实验。线粒体酶活抑制实验表明,线粒体ATP合酶的抑制阻止了UVB辐射下ATP含量的上升。亚细胞器蛋白质组学分析鉴定了1051个线粒体相关蛋白质,其中线粒体呼吸链复合体I蛋白含量减少,复合体II、复合体IV蛋白含量增加;甲基赤藓糖磷酸（MEP）途径蛋白含量增加,香叶基焦磷酸（GPP）合酶含量增加,GPP还原酶含量降低;q RT-PCR实验证实这些蛋白对应基因的m RNA水平变化与蛋白变化趋势一致。LC-MS代谢组学分析鉴定了126个变化代谢物,主要包括生物碱类、有机酸类、糖类、苯丙素类、脂肪酸类,其中8个吲哚类生物碱含量显着增加。整合多组学数据分析发现,部分氨基酸代谢水平下降,色氨酸合成水平上升。这些结果说明,线粒体参与了UVB辐射反应的调控,一方面,不同复合体的响应保持了高ATP供应,MEP途径激活,GPP合酶含量增加,推动了GPP到单萜类骨架的转化,促进了吲哚生物碱单萜类前体的积累。另一方面,线粒体中部分氨基酸代谢水平下降,调控氮流参与色氨酸合成,促进吲哚生物碱另一前体积累。（3）UVB辐射结合不同时长暗培养下白桑调控机制研究为探究药用植物UVB辐射下调控机制存在的共性与特点,以白桑为例,开展了UVB辐射下白桑蛋白质组学分析、代谢物指纹图谱差异分析、体外抗氧化活力测定、化合物含量测定及q RT-PCR实验,分析了UVB辐射后暗培养不同阶段下及未处理植株不同组织部位间的差异。在未处理的白桑中,根部Diels-Alder型加合物及其前体含量显着高于其他部位,桑黄酮H、桑根皮素、chalcomoracin在根部的含量是其他部位的10倍以上。在UVB辐射处理后暗培养阶段,叶片中chalcomoracin等5个Diels-Alder型加合物及其前体含量显着增加;在暗培养30h下蛋白变化最为显着,有253个蛋白发生了变化,涉及黄酮类合成的查尔酮合酶、二氢黄酮醇-4-还原酶、柚皮素-2-酮戊二酸双加氧酶、苯香豆素苄基醚还原酶都有所增加。与长春花类似,UVB辐射下白桑内MEP途径激活,该途径中3个负责催化终产物异戊烯基单体合成的蛋白增加,使异戊烯基单体大量合成,促进了MEP途径下游以之为底物的反应,导致异戊烯基类化合物积累。由于白桑次生代谢途径仍未阐明,推测芳香类异戊烯基转移酶（Aromatic PT）催化的异戊烯基转移参与了Diels-Alder型加合物及其前体合成的调控。（4）白桑叶片UVB辐射下异戊烯基转移酶的功能研究为进一步研究白桑体内异戊烯基的转移机制,对白桑新型Aromatic PT展开研究。经过BLAST比对筛选、基因克隆、载体构建、体外酵母/烟草表达及功能验证实验,发现一条编码新型Aromatic PT的转录本,在UVB辐射后暗培养阶段RPKM值增加,能够催化GPP到氧化白藜芦醇的转移,命名为Ma OGT。通过生化性质测定及亚细胞定位实验,证实Ma OGT具有Aromatic PT的典型特征,拥有富含天冬氨酸的保守功能域,且定位于细胞质体。Ma OGT是首个接受GPP为异戊烯基供体的芪类PT,它的发现丰富了桑科Aromatic PT的信息,并为桑科更多未知Aromatic PT的深入挖掘提供参考。本论文通过对两种药用植物在UVB辐射下调控机制的共性与特点展开研究,阐明其在UVB辐射下分子响应及调控机制,揭示了MEP途径异戊烯基骨架合成及转移对下游物种特异性次生代谢途径激活的重要意义,对调控MEP途径活性成分的生物合成奠定了基础。
张哲罡[4]（2020）在《MDCK细胞基质与鸡胚基质培养对流感病毒及其疫苗影响的研究》文中提出【目的】建立纯化细胞基质流感疫苗的方法,并从分子水平、蛋白水平及糖基化水平研究MDCK细胞基质与鸡胚基质制备的H1N1病毒HA蛋白生物学特性的差异,系统性评价这些生物学特性的变化对于病毒的免疫原性和疫苗的效果的影响。【方法】采用MDCK悬浮细胞平台技术,分别培养流感病毒H1N1、H3N2、BV及BY,通过多步纯化获得较纯的抗原,制备方式包括低速离心、分子筛纯化、离子交换纯化、广谱核酸酶添加,制备成细胞基质单价H1N1疫苗及细胞基质四价流感疫苗,同时与鸡胚基质制备的单价H1N1疫苗及四价疫苗进行比较研究。进一步处理单价H1N1疫苗,将其去糖基化,制备成去糖基化的细胞基质和鸡胚基质单价H1N1疫苗。通过动物试验比较单价和四价疫苗之间免疫原性差异并对其免疫效果进行评价。同时,通过核酸测序比较两种基质培养的H1N1病毒HA核酸序列的差异;通过质谱检测比较HA蛋白氨基酸序列、糖基化位点和糖基化修饰的差异;通过动物试验比较接种后小鼠血清中细胞因子及脾脏细胞中免疫细胞分化的差异,分析上述生物学特性的差异对疫苗免疫原性的影响。在动物试验中本文还系统性比较了两种疫苗对于不同类型免疫反应的诱导能力,及剂量对于疫苗有效性的影响。【结果】纯化结果显示,该纯化策略适用于四种病毒,病毒液中的宿主蛋白去除率均高于90%,宿主DNA去除率均高于90%,血凝素回收率均高于40%,在一系列纯化后添加广谱核酸酶能进一步去除残留DNA。在生物学特性试验中,两种基质培养的流感病毒HA核酸序列一致;HA蛋白氨基酸组成与理论序列覆盖率均高于94%;鸡胚基质培养的H1N1病毒HA蛋白在N27、N39、N103、N178、N303、N497处均发现糖基化,细胞基质制备的H1N1病毒HA蛋白在N27、N39、N178、N292、N497处有糖基化,细胞基质培养的病毒在N103和N303处糖基化位点的缺失是由脱酰胺作用造成的;经过糖型分析发现,细胞基质培养的H1N1病毒HA蛋白的糖基化修饰更加复杂,多天线糖基化修饰所占比例更高,鸡胚基质培养的H1N1病毒HA蛋白中糖基修饰比较单一,主要是高甘露糖及去岩藻糖基聚糖。细胞免疫及天然免疫相关多细胞因子组动物试验结果显示,小鼠在接种细胞基质制备的流感疫苗后的6小时内,血清中MCP-1、IP-10及IL-6浓度显着升高,说明小鼠的天然免疫反应被激活,而鸡胚基质流感疫苗和去糖基化流感疫苗所引起的细胞因子变化无显着性差异,说明HA蛋白上的糖基化是诱导天然免疫的因素之一;体液免疫相关多因子组动物试验结果显示,各组小鼠在接种10天后,血清中的IL-4、IL-5及IL-10浓度无显着性差异,说明不同基质的流感疫苗及去糖基化流感疫苗在诱导体液免疫能力上差异较小;胞内细胞因子染色试验结果显示不同疫苗组之间B细胞所占比例无显着性差异,进一步说明不同基质流感疫苗在诱导体液免疫能力上差异不大,而细胞基质流感疫苗能更有效的激活CD8+T细胞的分化,且分泌TNF-α、IFN-γ及IL-2的T细胞所占比例显着高于其鸡胚基质疫苗和去糖基化流感疫苗组,说明细胞基质流感疫苗可诱导更强的细胞免疫反应,同时也说明糖基化的去除显着降低了疫苗的免疫原性及免疫效果;在体外中和试验中,小鼠在接种第二针疫苗后血清中具有中和活性的抗体显着增加,且细胞基质疫苗组小鼠的血清中和效价显着高于鸡胚基质疫苗和去糖基化疫苗组,但是在血凝抑制试验中,发现鸡胚基质疫苗组的血清保护能力略高于细胞基质流感疫苗组,这两项试验结果的矛盾可能与病毒的培养基质有关;在细胞基质流感疫苗组中比较了低、较低、中、高四个不同剂量,结果显示高剂量组诱导天然免疫、细胞免疫及体液免疫的能力显着强于中、低剂量组,说明增加剂量对细胞基质流感疫苗所产生的免疫保护结果有显着影响。【结论】本课题摸索了一套可应用于工业生产的细胞基质流感疫苗纯化策略,该方法可有效去除宿主蛋白和DNA,且在不添加广谱核酸酶的条件下宿主DNA残留量达到欧洲药典中核酸残留质量标准。在HA蛋白生物学特性的研究中发现其糖基化位点与糖基化修饰会受到培养基质的影响,在细胞基质培养的H1N1病毒中发现了一个独特的糖基化位点N292,但是该位点处于HA蛋白茎部不属于抗原表位区域,且保守性评分较低,说明并可能未处在受体结合区域,所以对于病毒的免疫原性影响仍需进一步确定;同时还发现不同基质培养的H1N1病毒HA上处于受体结合区域的几个糖基化位点的糖基化修饰存在显着差异,因HA蛋白球状头部的糖蛋白在病毒侵染细胞时起关键的识别作用,所以这些位置的糖基化差异有可能导致病毒免疫原性的变化,这说明HA蛋白上的多天线糖基化修饰和更加复杂的糖基化修饰可能是导致流感病毒免疫原性差异的重要原因。同时本研究还发现细胞基质培养的流感病毒在N103和N303处糖基化缺失是由于脱酰胺作用造成,脱酰胺作用能使蛋白质的局部疏水性发生变化,影响蛋白质的空间结构,这与培养基质的pH值、离子种类、离子强度密切相关,说明哺乳动物细胞的细胞内环境可能是造成病毒糖蛋白趋向保守的主要原因。在动物试验中发现糖基化的存在对于疫苗诱导天然免疫和细胞免疫有显着影响,说明HA蛋白的糖基化在诱导机体的天然免疫和细胞免疫时起到一定作用,这可能是因为细胞基质中流感病毒HA糖基化修饰使得病毒更容易被天然免疫和细胞免疫相关细胞识别。体液相关细胞因子的分泌情况与B细胞分化情况说明不同基质制备的流感疫苗的诱导体液免疫能力较为一致,但是动物试验中的体外中和试验结果与血凝抑制试验结果存在矛盾,产生这一现象的原因可能是由于体外中和试验中所用的细胞就是培养流感病毒的MDCK细胞,所以小鼠血清中抗体特异性更强,导致血清的中和效价更高,而血凝抑制所用的材料为鸡血红细胞,在结合鸡胚基质培养的流感病毒时能力更强,导致血凝实验中鸡胚基质疫苗组结果更好,同时上述两项试验结果也说明在检定两种基质流感疫苗时应区分别建立特异性检定方法才能获得更准确的检定结果。
文美玲[5]（2020）在《基于1DE-LC-MS系统化分析的差异蛋白质组学研究策略的建立与应用》文中研究说明蛋白质组学是对器官、组织或细胞内所有蛋白质进行大规模研究,其终极目标为全面理解并重构目标蛋白质组的构成、功能及生物过程。其中,差异蛋白质组学通过比较特定蛋白质组在不同状态下的差异来探究生理和病理机制,对于理解疾病发展、治疗方法开发和临床生物标志物的发现具有重要意义。蛋白质的功能不仅与具体蛋白质的表达水平和含量密切相关,还与蛋白质间的相互作用和具体结构形式直接相关。目前,差异蛋白质组学研究多采用shotgun（鸟枪法）分析策略,该策略在定性定量方面表现出极高的性能,但在完整蛋白质到肽段的处理过程中不可避免会造成大量蛋白质结构和相互作用的破坏且难以追溯,而这些信息对于全面理解蛋白质组的功能具有重要意义。基于此现状,本文建立了基于一维凝胶电泳-液相色谱-质谱（1DE-LC-MS）系统化分析的差异蛋白质组学研究策略,利用1DE对蛋白结构信息的保留和分离的高效性,及LC-MS/MS在大规模鉴定和定量上的高性能,实现对蛋白组学样品的大规模差异分析,同时获取与蛋白质相互作用及蛋白质降解等结构相关的信息。该策略主要由五步构成:1)非变性PAGE或SDS-PAGE分离样品;2)针对每个样品泳道平行切胶;3)对所有胶粒进行胶内酶解,接以定量LC-MS/MS分析;4)数据分析,得到蛋白质鉴定及定量结果,进行蛋白质含量差异分析;5)重构蛋白质在1DE凝胶泳道上的含量分布谱图（1DE-MS blots）,并进行与相互作用和亚基组成相关联的差异分析。本文分别在非变性1DE和SDS-PAGE情况下,将1DE-LC-MS系统化分析方法应用于人血浆/血清差异和不同时期脑缺血复灌损伤的研究中,在蛋白质含量差异分析的同时挖掘蛋白质结构信息。本文具体的研究内容及结果如下:1.1DE-LC-MS系统化分析方法中关键步骤的建立和优化。首先,通过自制的装置实现了批量梯度PAGE胶制备和平行电泳;其次,根据实际的凝胶尺寸设计平行切胶工具,将凝胶沿电泳方向切成大小均一的小胶粒,并将胶内酶解流程进行了标准化;然后,通过实验明确了凝胶电泳后CBB染色对于1DE-LC-MS系统化分析的有利作用;最后,建立“native 1DE-MS blots”（非变性1DE情况）或“SDS-PAGE-MS blots”（SDS-PAGE情况）进行蛋白质结构信息挖掘。2.结合非变性1DE、平行切胶和定量LC-MS/MS,本文建立了非变性1DE-LC-MS系统化分析方法,并应用于人血浆和血清的差异分析中。在不去除高丰度蛋白质的情况下,成功鉴定了315个蛋白质,其中33个在血浆/血清中的含量存在显着差异（变化倍数?2或?0.5,p?0.05）。除含量差异外,通过比较蛋白质的native 1DE MS-blots,我们还发现许多蛋白质在血浆/血清中结构也不同,这与凝血、补体激活中的多种酶促反应直接相关。3.结合SDS-PAGE、平行切胶和定量LC-MS/MS,本文建立了SDS-PAGE-LC-MS系统化分析方法,并应用于不同时期脑缺血复灌损伤（I/R）大鼠脑皮质蛋白质组的差异研究。此研究设置了I/R模型组（缺血2小时+复灌1天、7天和14天）以及对应假手术对照组,共6个研究组（n=4）,大鼠脑皮质蛋白质经SDS-PAGE分离后,进行全泳道切胶接以定量LC-MS/MS分析。最终鉴定到5621个蛋白质,三个时间点的模型组与对应的假手术组相比较分别有568、755和492个蛋白质发生显着的含量变化（变化倍数?1.5或?0.67,p?0.05）。生物信息学分析提示在缺血复灌损伤的不同时期最突出的改变集中在细胞骨架、突触可塑性、能量代谢、炎症反应和溶酶体五大方面。此外,通过分析蛋白质的SDSPAGE-MS blots,我们发现许多蛋白质存在降解现象,对于理解缺血复灌损伤机理和治疗方法的开发具有重要意义。这是常规差异蛋白质组学方法无法获取的,表明本策略在大规模组学分析上的独特优势。综上所述,本研究建立了基于1DE-LC-MS系统化分析的差异蛋白质组学研究策略并开展了实际应用。常规的shotgun差异蛋白质策略只能获得蛋白质含量差异信息,相比之下我们建立的1DE-LC-MS系统化分析方法不仅可以分析蛋白质的含量差异还能根据1DE-MS blots追溯相关结构信息,如亚基组成、切割或降解、或相互作用等,为全面理解蛋白质的功能及生理病理机制提供更丰富的信息。
黄一可[6]（2020）在《基于多种相互作用的固相萃取和纳米载药研究》文中提出非键相互作用是自然界中普遍存在的分子间相互作用。物质与物质之间可以通过相互作用而产生联系。在分析科学各领域,更是利用各种各样的相互作用来研究和分析所关注的对象。分析科学（包括分析化学和药物分析）始终以3 S（Sensitivity,Selectivity,Speediness）和3 A（Accuracy,Automatics,Application）为研究目标,具有很高的科学研究指导意义。固相萃取技术（SPE）作为样品前处理中重要的一环,其萃取的过程涉及萃取材料与分析对象之间的相互作用关系。因此,有效的萃取方法、新萃取材料以及先进的固相萃取装置始终是该领域研究发展方向。本论文对萃取方法进行了开发,利用具有不同识别机理的分子印迹聚合物（MIPs）作为萃取材料。通过两步萃取法,从复杂体系中获得了唯一的目标化合物,大大提高了萃取选择性。同时,吸附实验、斯卡查德方程以及萃取条件研究表明MIPs对目标化合物的识别主要基于MIPs上的功能单体与分子上官能团的结合强度以及分子进入MIPs空穴时的空间取向与匹配程度,这为MIPs识别分子的机理具有一定指导作用。本论文提出以生物分子与化合物之间所存在的相互作用为研究基础,初次尝试将活细菌作为生物萃取材料,用于低浓度下氧氟沙星的萃取。同时,将活细菌固定在毛细管内壁,发展了一种管内细菌-固相萃取装置。该装置能够较好的实现样品萃取、淋洗以及洗脱步骤。通过荧光显微观察,管内活细菌对氧氟沙星具有一定萃取能力。本论文还提出了一种以简便性和分析灵敏度为追求目标的注射式固相萃取-液相色谱联用技术（Syringe SPME-LC）,并用于水中的邻苯二甲酸酯的萃取和分析。该技术实现了萃取、脱附、进样分离分析全过程。该装置也无需对液相色谱仪器的进样接口进行改造。同时,对水中邻苯二甲酸酯的萃取结果显示出很好的效果。回归SPE的本质是分析物与萃取相（固相）和被萃取物（液相）之间的相互作用关系,这类似于纳米载药体系中药物与载体（固相）和机体内环境（包括传递和释放下的环境,通常为液相）之间的关系。这三层关系也就是一个纳米载药体系的全过程整体性研究。因此,本论文利用去溶剂法成功制备了糖基化白蛋白姜黄素纳米药物（Gal-BSA-Cur NPs）。药物体外释放实验表明Gal-BSA-Cur NPs与普通姜黄素相比具有更好的体外释放率且更长的释放时间。在传递环节,采用人结肠癌Caco-2细胞和尤斯（Ussing）肠吸收模型对该纳米药物进行了肠吸收评价。结果表明肠道对Gal-BSA-Cur NPs具有更好的吸收效果,且具有双重肠吸收机制,即网格蛋白介导的内吞作用和被动转运。大鼠药代动力学研究表明,Gal-BSA-Cur NPs的血药浓度高于普通姜黄素。其他药代参数表明,该纳米药物有助于姜黄素生物利用度的提高。这些说明了该纳米药物可以通过促进肠吸收而提高药物生物利用度。在释药环节,对Gal-BSA-Cur NPs进行了抗肝癌活性的研究。该纳米药物对肝癌细胞具有一定的毒性作用且能够抑制细胞增殖以及迁移。同时,通过细胞凋亡和细胞荧光免疫分析,Gal-BSA-Cur NPs可能通过抑制核转录因子κB-p65蛋白（NF-κB-p65）的表达来诱导肝癌细胞凋亡。综上,固相萃取与纳米载药体系传递在物质相互作用上有一定的相似性。载药过程类似萃取相作用于萃取化合物,而释药过程类似化合物从萃取相中解离。虽然是类似,但纳米载药体系相比固相萃取具有更加复杂的涉及生命体中的相互作用类型。这种以基本相互作用性质的研究为更多研究领域,特别是交叉性领域提供了一定的研究思路。
于孟冉[7]（2015）在《超大孔色谱纯化类病毒颗粒的过程研究》文中认为类病毒颗粒（Virus-like particles, VLPs）是一类用于传染性疾病预防的重要新型疫苗,有效的分离纯化是确保其安全性和有效性的关键。色谱分离是生物大分子分离纯化最主要的技术,商品化的色谱填料主要是为常规蛋白质设计,孔道一般小于30nm,而VLPs通常由上百个亚基组装而成,尺寸在20～100 nm,因此其在传统填料中的扩散速率慢,甚至会堵塞孔道,导致分离时间过长,以及产物在操作中大量失活。为此,本论文研究孔径达到100 nm以上的新型超大孔色谱填料在乙肝表面抗原类病毒颗粒（Hepatitis B virus surface antigenVLPs, HB-VLPs）分离纯化中的应用,通过与其他类型色谱填料对比,对超大孔填料色谱分离VLPs的过程特点进行了如下系统的研究：（1）选取具有不用孔径的两种琼脂糖填料（DEAE-FF、DEAE-Capto）,四种超大孔填料（DEAE-AP-120nm、DEAE-AP-280nm、POROS D和POROSHQ）,以及一种整体柱类型的阴离子交换色谱填料,首先考察了孔径对不同尺寸的蛋白质动态载量的影响,发现小孔径的琼脂糖填料对较小尺寸蛋白的结合具有优势,而超大孔填料更适合于HB-VLPs超大分子的吸附,并且有助于获得更高的HB-VLPs抗原活性回收率。（2）采用单孔和双孔分布模型,对琼脂糖填料和超大孔填料的孔结构进行准确表征。然后深入分析填料孔径对不同大小生物分子静态、动态吸附载量和吸附动力学的影响规律。结果表明,对于水力学半径小于5.4 nm的蛋白,填料的可及比表面积是影响吸附载量的主要因素；而对于水力学半径大于5.4 nm的蛋白,其吸附主要受到填料孔径的影响,大孔填料可以提供更大的可及比表面积和更快的传质速率。（3）结合激光共聚焦检测、高效液相尺寸排阻色谱分析、以及投射电镜等方法,对HB-VLPs色谱分离过程中,填料孔径对VLPs结构和活性影响的机理进行了分析。VLPs在琼脂糖填料DEAE-FF和DEAE-Capto上的吸附仅限于外表面一薄层区域,而在超大孔填料DEAE-AP-120nm和DEAE-AP-280nm上则可以通过有效的扩散传质进入到孔内部空间,使HB-VLPs在DEAE-AP-280nm上静态吸附载量增加12.9倍,扩散速度提高11.4倍。尤其是超大孔结构还可以有效降低HB-VLPs与填料表面配基之间的多位点结合,避免亚基的解聚,使其结构稳定性得到了大幅度的提高。在2.0mg/mL-media的进料量的情况下,大约85.5%的HB-VLPs经过DEAE-AP-280nm色谱之后是正确组装的结构,相反的是DEAE-FF由于不可逆的解聚VLPs,有85.2%的VLPs失去正常组装结构。在HB-VLPs实际纯化中,在2.98 mg protein/mL-media进料量,240 cm/h高流速下,经过DEAE-AP-280nm纯化后的抗原活性收率达到68.33%,纯化倍数高达3.47倍。（4）建立了HB-VLPs在离子交换填料上吸附和发生亚基解聚的热力学模型,从热力学角度阐释填料孔径和配基密度对HB-VLPs吸附过程中结构稳定性的影响机理。微量热滴定技术与色谱实验结果相结合,得到HB-VLPs吸附和解聚过程相关的热力学参数。结果表明,完整的HB-VLPs在填料上吸附的本征摩尔吸附焓均为正值,表面吸附是熵驱动的吸热过程。而吸附过程中伴随亚基解聚产生的摩尔变构焓则均为负数,表明HB-VLPs解聚体的形成是一个焓驱动的自发过程。而且随着填料孔径的减小、或是配基密度的增加,构象变化焓越来越负,表明HB-VLPs亚基的解聚越易于发生。这一结果与色谱实验发现的HB-VLPs完整颗粒吸附过程中,随孔径减小或是配基密度的增加而解聚越严重的结果一致。本文研究超大孔色谱填料分离纯化HB-VLPs的过程,对于建立高效的VLPs分离纯化工艺具有重要的指导意义。超大孔色谱填料应用于VLPs分离纯化,已经被证实不仅具有高载量、高传质速率的优势,而且从热力学方面可以提高VLPs在液固界面上的结构稳定性,从而保持高的生物活性,因此具有广泛的应用前景。
史鹏超[8]（2014）在《新型复合色谱介质的制备与性能研究》文中进行了进一步梳理关于色谱介质分离效率提高的研究着重于两点,一是其介质的孔结构改变,二是介质表面的化学修饰。本文以琼脂糖凝胶介质为基质,分别讨论了壳核介质的孔结构、修饰密度对介质吸附性能的影响,以及疏水离子复合型配基介质的研制。首先,对壳核型介质的孔结构进行研究。通过对壳核型介质结构进行微元计算模拟,讨论其对柱效的影响,初步确定各参数改变对结果的影响程度,结果表明壳核型介质外层参数的改变对介质整体性能影响要比内层大。在此基础上,进行壳核型介质的制备与性能分析,考察了不同孔结构壳核型介质吸附性能,实验结果表明,孔结构对介质的吸附性能有影响,其中内层均质多孔、外层为超大孔的壳核型孔结构在传质和吸附方面要优于其他孔结构；接着以DEAE为修饰配基,对壳核型介质的修饰密度进行研究,实验结果表明,外层修饰密度高、内层修饰密度低的分布比其他类型分布有利于提升介质的整体吸附性能。与均质多孔琼脂糖凝胶介质的对比实验也进一步展示了该类型介质在操作背压、理论塔板数及色谱对称性等色谱行为的提升。最后,考察疏水配基及离子配基是否能共存在一种介质上,这类复合配基对介质的性能有何影响。实验选用的疏水基团为苯基,离子基团为DEAE,载体基质为均质琼脂糖介质。采用分步修饰的方法,成功制备了疏水-离子复合修饰配基介质,同时对不同修饰过程介质的吸附性能进行研究。实验结果表明,先修饰基团的修饰密度大于后修饰基团,介质主要表现出修饰密度高的基团的吸附特性,另一配基对其整体吸附性能影响较小。但是对于苯基修饰密度高的复合配基介质,其吸附性能受两种修饰配基影响都较大,而且在pH7.0的磷酸盐缓冲液中明显表现出高于单修饰基团介质的特性,从多相吸附模型的拟合相关性来看,复合配基在吸附过程中存在一定双重性。本文对孔结构、修饰密度的不同分布的壳核型琼脂糖介质性能进行的相对系统的研究,并对两种不同分离机理配基复合修饰的可行性及其特性进行了探索性研究,研究方法和结果对新型色谱介质的研制提供了一定的借鉴。
郭霞[9]（2012）在《宫颈癌早期预警分子指标的血浆蛋白质组学研究》文中研究表明研究目的维吾尔族妇女宫颈癌发病率与死亡率高,被列为新疆特高发肿瘤之一,早期发现是宫颈癌有效防治的关键,而肿瘤分子标志物的筛查研究是建立早期诊断方法的前提。肿瘤细胞的诞生和生存是机体免疫监视系统失败的结果,整体上进入一种病理状态的标志,其动态信息不仅包含在肿瘤细胞自身的调控网络被“扰动”之中,而且整体病理信息更可能反映在血浆/清蛋白质组的“微调”变化,表现为血浆（血清）蛋白标志物（plasma/serum protein markers）,其研究开发是建立无创伤性诊断标准的重要切入点。从系统生物学研究思路出发,通过血浆蛋白质组的高通量、准确、快速分离与鉴定,发现肿瘤分子标志物,建立早期分子诊断方法,并探讨宫颈癌的发病机理,对新疆宫颈癌的综合防治具有重大社会经济意义。本研究以新疆维吾尔族妇女宫颈病变患者血浆为对象,联合运用多种蛋白质组学筛查技术和策略,旨在建立蛋白质组差异表达谱基础上,筛选出宫颈癌及癌前病变特异性的血浆蛋白指标,丰富宫颈癌早期筛查与预警体系。利用系统生物学分支学科——生物信息学方法,针对血浆蛋白指标进行功能注释与富集,构建功能网络,寻找主要调控通路或途径,进一步揭示宫颈病变的发生与发展的生物学本质,为宫颈癌的预防和早期诊疗提供科学依据。方法1.收集维吾尔族妇女宫颈鳞癌（cervical squamous cell carcinoma,CSCC）、宫颈内上皮瘤样病变（cervical intraepithelial neoplasia,CIN）Ⅱ和Ⅲ级和宫颈炎患者的血浆标本共69例,制备血浆低丰度蛋白质组样品,应用基于蛋白质二维液相色谱技术的ProteomeLabTM PF-2D系统,通过低丰度血浆蛋白的蛋白质组学筛查分析,建立宫颈癌早期及癌前病变特异性血浆蛋白质组差异表达谱,鉴别与收集差异蛋白组分,进一步通过差异蛋白组分的胰蛋白酶切及高分辨率质谱（linear trap quadrupole mass spectrometry,LTQ-MS）鉴定,获得血浆差异蛋白信息。依托IPA@（Ingenuity Pathway Analysis）在线生物信息学软件,分析血浆差异蛋白调控网络、典型通路、生物功能以及生物标志物,明确宫颈病变病理进程与差异蛋白质功能或异常变化的关系。2.联合运用双向荧光差异电泳（two-dimensional differential ingel electrophoresis,2D-DIGE）分离及基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight mass spectrum,MALDI-TOF MS）鉴定技术,建立宫颈癌（早期）与癌前病变特异性血浆2D-DIGE差异图谱,筛选出差异蛋白位点,鉴定出血浆差异蛋白。3.对以上两种蛋白质组学筛查分析结果进行总结,选取所谓的核心差异蛋白（专业术语）,采用MetaCoreTM Analysis生物信息学专业软件,从细胞定位、生物学功能注释、生物功能富集、信号通路网络、生物标志物筛选等5个方面对对核心差异蛋白进行分析,构建血浆差异蛋白相互作用和调控网络图,筛选出肿瘤候选标记蛋白。4.选择6种由上述研究综合分析获得的血浆差异蛋白指标,利用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）,通过宫颈病变患者的血浆样本的定量筛查及数据分析,确定不同宫颈病变之间的单一血浆蛋白指标含量差异和统计学意义,评价其对宫颈癌的早期预警或临床应用价值。结果1.在构建高质量血浆低丰度蛋白质组待测样品基础上,以宫颈炎患者为对照,通过蛋白质二维液相色谱分析,建立了 CINⅡ/ⅢⅢ及宫颈早期患者特异性蛋白质组差异表达谱。将大于2倍峰值变化设为蛋白质组差异组分的量化标准,发现宫颈癌早期患者血浆中8个蛋白组分含量显着上升,1个组分含量下降,而CINⅡ/Ⅲ患者血浆中3个蛋白组分含量显着上升,1个组分含量下降。通过以上蛋白组分的特异性酶切及其肽谱的质谱鉴定,发现宫颈癌早期患者特异性血浆蛋白质103种,CINⅡ/Ⅲ特异性蛋白质31种。利用IpA@在线生物信息学软件分析,进一步挖掘血浆差异蛋白功能相关的在线数据库信息,发现CINⅡ/Ⅲ特异性血浆差异蛋白生物功能涉及炎症反应等7个功能模块;生物功能有细胞装配与组织、癌症等;典型通路分析主要涉及急性期反应通路、JAK/Stat通路和IL-4通路等。发现宫颈癌患者特异性血浆差异蛋白质生物功能与肿瘤、炎症反应和基因异常等9个功能模块相关;生物功能涉及遗传缺陷、眼睛疾病、癌症、生殖系统疾病多种生物过程,涉及众多受体通路的激活,急性期反应通路、B细胞发育和免疫缺陷通路等。基于IPA@软件的生物标志物筛查分析,发现在宫颈癌早期患者特异性103种血浆差异蛋白中,宫颈癌发生可能与14种候选生物标记蛋白的血浆含量变化存在密切关系,包括代谢相关蛋白（APOA1、DCD、UBR4）、细胞骨架相关蛋白（ADCY2、VIL1）、转录与翻译相关蛋白（ANK2、ANK3、RelB）、信号转导相关蛋白（MADD、SHC1）、增殖和凋亡相关蛋白（BIRC6）和免疫功能相关蛋白（HLA-DQBI）,而CIN Ⅱ/Ⅲ特异性31种血浆差异蛋白中,病变进程可能与2种候选生物标记蛋白的血浆含量变化有关,包括代谢相关蛋白（APOA1）和信号转导相关蛋白（mTOR）。2.依托2D DIGE蛋白质组学技术平台,以宫颈炎为对照,建立了宫颈癌早期及CIn Ⅱ/Ⅲ特异性血浆低丰度蛋白质组差异谱,发现宫颈癌早期患者血浆蛋白质组有43个差异蛋白位点,其中18个位点含量上升,25个位点含量下降,而CIN Ⅱ/Ⅲ患者血浆蛋白质组有47个差异位点,其中20个位点含量上升,27个位点含量下降。进一步通过宫颈癌早期患者特异性差异蛋白质位点的酶切及质谱鉴定,发现16种血浆蛋白,其中7种蛋白质含量上升,9种蛋白质含量下降。3.利用以上两种蛋白质组学方法筛选的血浆差异蛋白指标,通过MetaCoreTM生物信息学软件及其数据库分析,发现宫颈癌早期患者特异性血浆核心差异蛋白43种,其蛋白质功能相关的信息如下:①生物学功能多样,主要与细胞内构成的负调节、胆固醇反向转运、应激反应的负调节等15个方面存在密切关系;②细胞内分布主要集中在高密度脂蛋白颗粒等12个方面。③主要参与脂代谢、炎症补体系统、细胞骨架肌动蛋白纤维、ESR1膜受体转导途径和炎症反应IL-6途径;④构建蛋白质相互作用网络图,主要涉及8个功能网络模块。⑤通过“子宫颈疾病”进行过滤,发现宫颈癌及宫颈病变可能与4种候选标记蛋白质存在密切关系,包括是抗凝血酶Ⅲ（AT Ⅲ）、凝集素（CLU）、绒毛蛋白1（VIL1）和免疫球蛋白κ（IGK@）,并进一步通过蛋白质相互作用网络分析,发现CLU、VIL1和IGK@均参与NFκB和COX-2激活,而CLU或IGK@参与BCL-XL、BAX或BCL-6介导的细胞凋亡抑制（或细胞生存）过程。4.通过ELISA法验证分析,发现伴随宫颈病变进程的发展,血浆APOA1与ATⅢ含量逐渐下降,APOE、CLU、mTOR和VIL1含量上升,其变化差异有统计学意义（P<0.05）。与对照组宫颈炎组相比,发现APOA1含量在宫颈癌早期、宫颈癌晚期组中含量逐渐下降,而ATⅢ的表达在CINⅡ/Ⅲ、宫颈癌早期和宫颈癌晚期患者血浆中逐渐降低,差异有显着的统计学意义（P<0.01）。APOE在CINⅡ/Ⅲ、宫颈癌早期组与宫颈炎组相比含量升高,有显着的差异（P<0.01）。发现与宫颈炎患者相比,CLU、mTOR和VIL1在CINⅡ/Ⅲ时期就有不同程度的升高,在宫颈癌早期和宫颈癌晚期患者血浆中逐渐升高,差异有统计学意义（P<0.05）。结论1.宫颈癌及癌前病变（CINⅡ/Ⅲ）与多种血浆低丰度蛋白质含量的动态变化存在密切关系。2.宫颈癌及癌前病变特异性血浆差异蛋白可能参与人体的多种生物学过程,包括炎症和应激反应、炎症相关补体和信号通路的激活、能量代谢障碍、脂代谢紊乱、细胞转导途径异常、免疫系统的免疫应答、多种受体通路的激活,是进一步揭示宫颈癌发病分子机理的重要科学依据。3.宫颈癌及癌前病变与APOA1、APOE、CLU、AT Ⅲ、mTOR和VIL 1等6种血浆蛋白质含量变化的定量关系有较高的特异性和灵敏度,可望成为宫颈癌早期诊断的血浆检测临床指标。4.联合运用二维液相色谱、2D DIGE和高分辨率质谱等高通量技术手段是肿瘤蛋白质组学研究的重要策略,而IPA@和MetaCoreTM等生物信息学软件及其数据库是重要的辅助分析工具,在高通量数据处理及筛选生物标志物方面,能够提供有效的技术支撑。
周冠月[10]（2011）在《清开灵注射液中多肽含量的快速测定及杂质蛋白的限量检查》文中研究表明清开灵注射液是北京中医药大学在“安宫牛黄丸”的基础上研制而成的现代中药制剂,,是经典名方二次开发的典范。其主要成分为胆酸、猪去氧胆酸、水牛角、珍珠母、黄芩苷、栀子、板兰根、金银花组成,具有清热解毒、化痰通络、醒神开窍功效。临床主要用于治疗热病神昏、中风偏瘫、急慢性肝炎、乙型肝炎、上呼吸道感染、肺炎、脑血管等病症,在治疗急重热症中发挥不可替代的重要作用。随着清开灵注射液在临床的应用日益广泛,不良反应报道数量也明显增多,特别是严重不良反应,使其受到前所未有的挑战。清开灵注射液不良反应产生的原因复杂,产品本身存在蛋白质等杂质或有效成分氧化降解等是重要原因之一本论文围绕清开灵注射液中的大分子物质展开研究,针对清开灵注射液中的多肽类有效成分建立了快速的含量测定方法,针对清开灵注射液中的大分子物质建立了系统的分离方法,并对大分子物质中的杂质蛋白部分建立了限量检查的方法,完善了清开灵注射液的质量标准,对提高清开灵注射液的生产质量控制水平起到了重要意义。论文主要研究内容及结果如下：1、Bradford法结合超滤离心法测定中药注射液中蛋白及总肽的含量以清开灵注射液为样品,首先采用超滤离心法将注射剂中蛋白及多肽类物质与小分子物质分离并浓缩,紧接着采用考马斯亮蓝显色法对浓缩所得样品中的蛋白及多肽类物质进行定量测定,并对所建立的含量测定方法进行了方法学考察。实验中根据分子量的不同选取不同分子截留量的超滤离心管对注射液中蛋白及多肽分子量的分布范围-并进行了研究。将建立的蛋白含量测定方法用于参麦、刺五加、茵栀黄、红花、丹参等十五种注射液中蛋白成分的限量检查,探索该方法在中药注射液中的适用性。2、超滤所得大分子样品反相指纹图谱的探索性研究在第一章实验中制得的清开灵注射液中蛋白及多肽类样品的基础上,采用AsahipakODP 504E色谱柱对样品进一步分析,考察清开灵注射液中多肽类有效成分在反相液相色谱柱上的指纹图谱。3、交联葡聚糖凝胶柱对清开灵注射液中大分子物质分离方法的建立在第二章实验内容证实超滤离心法所得的大分子样品中残留有其他小分子物质的基础上,采用葡聚糖凝胶过滤色谱除去清开灵注射液中的小分子物质,以得到清开灵注射液中的大分子物质样品。实验中分别对色谱柱、洗脱液、流速以及葡聚糖凝胶型号进行考察,建立清开灵注射液中大分子样品的最佳分离条件。4、TSK色谱柱对清开灵注射液中蛋白类杂质的限量检查在第三章实验建立了清开灵注射液中大分子物质的分离方法的基础上,采用TSK凝胶色谱柱对清开灵注射液中大分子样品进行再一次的分析,实验对各标准蛋白的分子量与保留时间进行线性考察,得到五种标准蛋白在TSK凝胶柱上的分子量标准曲线；并考察标准蛋白含量的线性关系,得到标准蛋白的质量标准曲线。在此基础上对清开灵注射液中杂质蛋白的分子量以及含量建立限量检查标准。以上实验内容的研究结果表明：（1） Bradford法结合超滤离心法用于中药注射液中杂质蛋白的检查具有其实用性,但在具体运用中还存在很多限制条件,需要对其适用范围展开进一步的研究。（2）葡聚糖凝胶色谱法结合TSK凝胶色谱法建立了清开灵注射液中杂质蛋白的限量检查方法。限量标准要求注射液中分子量大于10KD的杂质蛋白含量不得超过10ppm。将该方法运用于十批清开灵注射液的样品测定,结果表明,该方法稳定性好,重复性高,不受人员以及仪器变动的影响,结果可靠,限量标准的确定亦非常合理,可以作为药典中有关中药注射液相关物质检查的参考。
二、The Development of Gel Media and Columns for Large-Scale Chromatography of Proteins, a Historical Review（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、The Development of Gel Media and Columns for Large-Scale Chromatography of Proteins, a Historical Review（论文提纲范文）
（1）聚合物模板法制备5μm单分散全多孔硅胶微球及其在色谱分离中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 硅胶基质的发展 |
| 1.2.1 无孔硅胶微球 |
| 1.2.2 全多孔硅胶微球 |
| 1.2.3 核壳型硅胶微球 |
| 1.3 全多孔硅胶微球的制备方法 |
| 1.3.1 溶胶-凝胶法 |
| 1.3.2 喷雾干燥法 |
| 1.3.3 聚合凝胶诱导法(PICA法) |
| 1.3.4 聚合物模板法 |
| 1.4 本论文的研究内容和意义 |
| 参考文献 |
| 第二章 5μm多孔硅胶微球的制备及表征 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 试剂 |
| 2.2.2 仪器 |
| 2.2.3 试剂前处理 |
| 2.2.4 5μm大孔硅胶微球的制备 |
| 2.2.5 材料的表征 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 5μm大孔硅胶微球的制备 |
| 2.3.2 影响硅胶孔径的因素 |
| 2.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 大孔径硅胶微球在蛋白质分离中的应用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 试剂 |
| 3.2.2 仪器 |
| 3.2.3 反相固定相的制备和色谱柱的装填 |
| 3.2.4 色谱性能表征 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 色谱柱渗透性能测试 |
| 3.3.2 Silica-C8色谱柱分离性能考察 |
| 3.3.3 三种不同链长烷基键合硅胶固定相色谱分离性能的考察 |
| 3.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 小孔径硅胶微球的制备及在色谱分离中的应用 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 试剂 |
| 4.2.2 仪器 |
| 4.2.3 小孔硅胶微球的制备 |
| 4.2.4 反相固定相的制备和色谱柱的装填 |
| 4.2.5 材料的表征 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 5μm小孔硅胶微球的制备 |
| 4.3.2 P_(GMA-EDMA)微球表面改性对制备的硅胶微球形貌的影响 |
| 4.3.3 色谱柱渗透性测试 |
| 4.3.4 色谱性能表征 |
| 4.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）基于质谱的糖胺聚糖结构表征及其与蛋白互作分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略符号说明 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 糖胺聚糖概述 |
| 1.1.1 糖胺聚糖的结构与功能 |
| 1.1.1.1 肝素及硫酸乙酰肝素 |
| 1.1.1.2 硫酸软骨素及硫酸皮肤素 |
| 1.1.1.3 透明质酸 |
| 1.1.1.4 硫酸角质素 |
| 1.1.2 糖胺聚糖类药物及应用 |
| 1.1.2.1 肝素 |
| 1.1.2.2 低分子量肝素 |
| 1.1.2.3 超低分子量肝素 |
| 1.1.2.4 多组分糖胺聚糖药物 |
| 1.2 糖胺聚糖的分析方法 |
| 1.2.1 电泳 |
| 1.2.2 高效液相色谱法 |
| 1.2.3 质谱法 |
| 1.2.4 核磁共振波谱法 |
| 1.3 糖胺聚糖与蛋白相互作用 |
| 1.3.1 糖胺聚糖与蛋白相互作用中蛋白的结构特点 |
| 1.3.2 糖胺聚糖与蛋白相互作用中糖链的结构特点 |
| 1.4 糖胺聚糖与蛋白相互作用分析方法 |
| 1.4.1 基于亲和力的方法 |
| 1.4.2 核磁法、X-射线晶体衍射和分子对接 |
| 1.4.3 质谱法 |
| 1.5 论文大纲 |
| 第二章 糖胺聚糖的聚丙烯酰胺凝胶电泳-质谱联用方法研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 试剂与耗材 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.2.3 色谱柱 |
| 2.2.4 缓冲液及流动相的配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 肝素寡糖制备 |
| 2.3.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染 |
| 2.3.3 胶内酶解 |
| 2.3.4 AMAC标记 |
| 2.3.5 肝素寡糖LC-MS分析 |
| 2.3.6 C18-MS/MS MRM分析 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析GAGs |
| 2.4.2 通过胶内酶解将PAGE与LC-MS/MS结合 |
| 2.4.3 LC-MS/MS-MRM方法建立 |
| 2.4.4 LC-MS/MS MRM分析PAGE分离的肝素 |
| 2.4.5 方法验证 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 糖胺聚糖的琼脂糖凝胶电泳-质谱联用方法研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 药品与试剂 |
| 3.2.1 试剂与耗材 |
| 3.2.2 主要仪器 |
| 3.2.3 色谱柱 |
| 3.2.4 缓冲液及流动相的配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 DS寡糖制备及质谱鉴定 |
| 3.3.2 琼脂糖凝胶电泳 |
| 3.3.3 糖链的提取及酶解 |
| 3.3.4 HILIC-MS/MS MRM分析 |
| 3.3.5 2D NMR分析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 琼脂糖凝胶电泳分析多组分GAGs |
| 3.4.2 SAX离心提取及LC-MS/MS方法建立 |
| 3.4.3 LC-MS/MS MRM分析AGE分离的舒洛地特 |
| 3.4.4 方法验证 |
| 3.4.5 舒洛地特的核磁分析 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 不同聚合度肝素糖链与IFN-γ的氢氘交换质谱研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 试剂与耗材 |
| 4.2.2 主要仪器 |
| 4.2.3 色谱柱 |
| 4.2.4 缓冲液的配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 肝素寡糖制备 |
| 4.3.2 IFN-γ覆盖度考察 |
| 4.3.3 氘代时间 |
| 4.3.4 IFN-γ与肝素糖链互作比 |
| 4.3.5 不同聚合度糖链与IFN-γ的氢氘交换实验 |
| 4.3.6 数据处理 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 IFN-γ覆盖度考察 |
| 4.4.2 HDX实验条件优化 |
| 4.4.3 不同聚合度糖链与IFN-γ的HDX研究 |
| 4.4.4 糖链聚合度与IFN-γ相互作用的关系 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 肝素与IFN-γ相互作用的糖链序列结构表征 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 试剂与耗材 |
| 5.2.2 主要仪器 |
| 5.2.3 色谱柱 |
| 5.2.4 缓冲液及流动相的配制 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 肝素寡糖制备 |
| 5.3.2 装填IFN-γ亲和柱 |
| 5.3.3 IFN-γ亲和柱纯化肝素寡糖 |
| 5.3.4 完整糖链LC-MS分析 |
| 5.3.5 酶解基本组成单元及LC-MS分析 |
| 5.3.6 亚硝酸降解及LC-MS分析 |
| 5.3.7 SAX分离IFN-γ亲和dp8 |
| 5.3.8 IFN-γ亲和dp8 LC-MS/MS测序 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 IFN-γ亲和糖链分析 |
| 5.4.2 计算机辅助亲和dp8糖链测序 |
| 5.4.3 LC-MS/MS亲和dp8糖链序列鉴定 |
| 5.4.4 肝素与IFN-γ特异性结合的糖链序列 |
| 5.4.5 亲和dp24糖链序列验证 |
| 5.4.6 分子对接 |
| 5.5 本章小结 |
| 全文总结 |
| 回顾本论文的内容 |
| 本文取得的创新成果 |
| 展望 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文及申请的专利 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（3）UVB诱导长春花及白桑次生代谢激活及调控的系统生物学研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩写表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 药用植物长春花及白桑在肿瘤治疗的应用现状及前景 |
| 1.1.2 药用植物对紫外UVB辐射的响应 |
| 1.2 蛋白质组学技术发展及其在植物胁迫响应机制方面的研究进展 |
| 1.2.1 蛋白质组各流程技术及进展 |
| 1.2.2 植物单细胞型、亚细胞器及修饰型蛋白质组学研究进展 |
| 1.3 代谢组学及多组学联合分析在研究胁迫响应机制的进展 |
| 1.3.1 植物代谢组学研究技术与进展 |
| 1.3.2 代谢组学及多组学分析植物胁迫响应机制进展 |
| 1.4 植物来源异戊烯基转移酶研究进展 |
| 1.4.1 植物体内异戊烯基化反应及意义 |
| 1.4.2 植物芳香类异戊烯基转移酶功能及特性 |
| 1.4.3 植物芳香类异戊烯基转移酶研究现状及前景 |
| 1.5 本文的研究内容及意义 |
| 第二章 UVB辐射下长春花磷酸化通路及初生代谢研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 植物来源及处理 |
| 2.2.2 试剂及仪器 |
| 2.2.3 叶片ATP含量的测定 |
| 2.2.4 磷酸化蛋白的提取与富集 |
| 2.2.5 蛋白质组鉴定 |
| 2.2.6 全叶片代谢组样品制备及代谢组学分析 |
| 2.2.7 Western-Blotting |
| 2.2.8 统计分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 长春花叶片UVB辐射下ATP含量变化 |
| 2.3.2 磷酸化蛋白的鉴定及丰度检测 |
| 2.3.3 基于GC-TOF/MS技术检测的长春花UVB辐射下代谢物变化 |
| 2.3.4 关键差异表达蛋白的Western-Blotting鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 UVB辐射下长春花叶片内钙离子相关通路激活 |
| 2.4.2 UVB辐射下长春花糖酵解相关通路变化导致ATP增加 |
| 2.4.3 UVB辐射对长春花叶片造成氧化胁迫并激活次生代谢途径 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 UVB辐射下长春花能量调控及次生代谢研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 植物来源及处理 |
| 3.2.2 试剂及仪器 |
| 3.2.3 不同线粒体呼吸复合体抑制剂作用下ATP含量测定 |
| 3.2.4 叶片线粒体的纯化与蛋白富集 |
| 3.2.5 蛋白质组鉴定 |
| 3.2.6 全叶片代谢组学分析 |
| 3.2.7 qRT-PCR |
| 3.2.8 数据处理与分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 不同线粒体呼吸链抑制剂处理后长春花叶片在UVB辐射下ATP含量变化 |
| 3.3.2 长春花叶片线粒体蛋白富集与纯化程度检测 |
| 3.3.3 UVB辐射下长春花叶片线粒体差异蛋白的鉴定与功能注释 |
| 3.3.4 基于LC-MS技术检测的长春花UVB辐射下代谢物变化 |
| 3.3.5 差异蛋白质组与代谢组结合分析 |
| 3.3.6 关键差异表达蛋白基因的表达变化情况 |
| 3.4 .讨论 |
| 3.4.1 线粒体参与调控UVB辐射下长春花叶片内ATP含量的变化 |
| 3.4.2 UVB辐射下MEP途径被激活使得单萜类前体物质积累 |
| 3.4.3 氨基酸代谢调控UVB辐射下长春花叶片中吲哚类生物碱的合成 |
| 3.5 结论 |
| 第四章 UVB辐射结合不同时长暗培养下白桑调控机制研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与方法 |
| 4.2.1 植物来源与取样 |
| 4.2.2 试剂及仪器 |
| 4.2.3 蛋白质提取及蛋白质组鉴定 |
| 4.2.4 抗氧化水平检测 |
| 4.2.5 甲醇提取物指纹图谱建立与代谢物定量分析 |
| 4.2.6 总黄酮含量测定 |
| 4.2.7 qRT-PCR |
| 4.2.8 数据处理与分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 桑叶UVB辐射后不同暗培养时间点差异蛋白鉴定 |
| 4.3.2 桑叶UVB辐射后不同暗培养时间点次生代谢相关差异蛋白功能分析 |
| 4.3.3 桑叶、枝、根部代谢物指纹图谱及差异代谢物含量测定 |
| 4.3.4 桑叶、枝、根部蛋白鉴定及功能分析 |
| 4.3.5 桑叶、枝、根部次生代谢相关差异性分析 |
| 4.3.6 不同部位差异表达蛋白基因的表达量分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 白桑UVB辐射后暗培养阶段MEP途径内蛋白的变化及意义 |
| 4.4.2 异戊烯基化合物在白桑根部大量积累 |
| 4.4.3 白桑不同组织部位有效成分及相关蛋白分布存在巨大差异 |
| 4.5 结论 |
| 第五章 白桑叶片UVB辐射下异戊烯基转移酶的功能研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与方法 |
| 5.2.1 生物材料来源 |
| 5.2.2 试剂与仪器 |
| 5.2.3 异戊烯基转移酶基因的筛选 |
| 5.2.4 酵母表达载体构建 |
| 5.2.5 酵母表达体系建立 |
| 5.2.6 最适底物的筛选 |
| 5.2.7 烟草瞬时表达载体及表达体系构建 |
| 5.2.8 基因在植物中的功能及亚细胞定位分析 |
| 5.2.9 最适反应条件摸索及米氏常数测定 |
| 5.2.10 基因系统进化分析 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 白桑中异戊烯基转移酶基因序列及表达信息挖掘 |
| 5.3.2 基因在酿酒酵母细胞内的表达与功能验证 |
| 5.3.3 基因在本氏烟草内的瞬时表达亚细胞定位与功能验证 |
| 5.3.4 异戊烯基转移酶Ma OGT的最适反应条件 |
| 5.3.5 基因系统发育分析 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 MaOGT的功能及生化性质特点 |
| 5.4.2 MaOGT在白桑次生代谢生物合成途径的意义 |
| 5.4.3 MaOGT在进化发育的位置及意义 |
| 5.5 结论 |
| 第六章 全文总结 |
| 6.1 总结 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 不足之处与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 个人简介 |
| 攻读博士学位期间发表学术论文 |
（4）MDCK细胞基质与鸡胚基质培养对流感病毒及其疫苗影响的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 流感病毒简介 |
| 1.2 流感的历史、流行病学及疾病负担 |
| 1.3 流感病毒疫苗 |
| 1.3.1 早期的流感疫苗 |
| 1.3.2 鸡胚基质流感疫苗 |
| 1.3.3 细胞基质流感疫苗 |
| 1.3.4 其他在研流感疫苗 |
| 1.3.5 鸡胚基质与细胞基质流感疫苗的比较 |
| 1.3.6 不同基质对病毒糖基化的影响 |
| 1.4 本文的研究目的、内容和意义 |
| 第二章 MDCK细胞基质流感疫苗的制备 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞 |
| 2.1.2 病毒 |
| 2.1.3 其它材料 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.1.5 主要试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 MDCK-G1株贴壁细胞的复苏 |
| 2.2.2 MDCK-G1-XF株细胞的复苏 |
| 2.2.3 贴壁细胞传代 |
| 2.2.4 悬浮细胞传代 |
| 2.2.5 细胞计数 |
| 2.2.6 悬浮细胞的冻存 |
| 2.2.7 生物反应器的准备 |
| 2.2.8 细胞接种 |
| 2.2.9 病毒建库及检测 |
| 2.2.10 病毒接种 |
| 2.2.11 病毒纯化 |
| 2.2.12 检测方法 |
| 2.2.13 广谱核酸酶处理 |
| 2.2.14 电镜检测 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 CaptoTM Core700 纯化结果 |
| 2.3.2 CaptoTM Q纯化结果 |
| 2.3.3 广谱核酸酶处理结果 |
| 2.3.4 电镜检测结果 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 MDCK细胞基质与鸡胚基质培养的H1N1 病毒中糖蛋白HA生物学特性比较研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 MDCK培养的H1N1 病毒 |
| 3.1.2 鸡胚培养的H1N1病毒 |
| 3.1.3 其它材料 |
| 3.1.4 主要仪器及耗材 |
| 3.1.5 主要试剂 |
| 3.1.6 主要试剂的配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 H1N1病毒RNA提取 |
| 3.2.2 H1N1病毒RNA反转录 |
| 3.2.3 SDS-PAGE分离HA蛋白 |
| 3.2.4 Westrn Blotting检测 |
| 3.2.5 HA蛋白蛋白序列检测 |
| 3.2.6 HA蛋白理论序列的分析 |
| 3.2.7 HA蛋白糖基化位点鉴定 |
| 3.2.8 HA蛋白糖谱检定 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 HA核酸测序结果 |
| 3.3.2 HA纯化结果 |
| 3.3.3 HA蛋白序列检测结果 |
| 3.3.4 HA蛋白三维结构图 |
| 3.3.5 糖基化位点预测 |
| 3.3.6 糖基化位点及糖肽检测结果 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 MDCK细胞基质疫苗与鸡胚基质疫苗的免疫原性及保护性比较研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验用细胞 |
| 4.1.2 实验用疫苗 |
| 4.1.3 其它材料 |
| 4.1.4 主要仪器 |
| 4.1.5 主要试剂 |
| 4.1.6 主要试剂的配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 H1N1病毒的效价测定 |
| 4.2.2 H1N1病毒的N-糖苷酶酶切 |
| 4.2.3 SDS-PAGE 电泳检测 |
| 4.2.4 Western Blotting 检测 |
| 4.2.5 动物实验 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 N-糖苷酶酶切结果 |
| 4.3.2 多因子组I检测结果 |
| 4.3.3 多因子组II检测结果 |
| 4.3.4 胞内因子染色组检测结果 |
| 4.3.5 体外细胞中和组检测结果 |
| 4.3.6 血凝抑制实验结果 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 讨论 |
| 5.1 流感病毒的纯化 |
| 5.2 培养基质对病毒的影响 |
| 5.2.1 培养基质对于病毒核酸的影响 |
| 5.2.2 培养基质对于病毒氨基酸的影响 |
| 5.2.3 培养基质对于病毒糖基化修饰的影响 |
| 5.3 流感病毒蛋白糖基化修饰对疫苗免疫原性、有效性及检定的影响 |
| 第六章 总结与展望 |
| 6.1 总结 |
| 6.2 展望 |
| 6.3 创新点 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 附录Ⅰ |
| 附录Ⅱ |
| 附录Ⅲ |
| 附录Ⅳ |
| 附录Ⅴ |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
（5）基于1DE-LC-MS系统化分析的差异蛋白质组学研究策略的建立与应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 蛋白质组学概述 |
| 1.2 蛋白质组学的主要研究策略 |
| 1.2.1 Top-down蛋白质组学策略 |
| 1.2.2 Bottom-up蛋白质组学策略 |
| 1.2.3 Hybrid(基于凝胶)蛋白质组学策略 |
| 1.3 定量与差异蛋白质组学 |
| 1.3.1 同位素标记的定量蛋白质组学 |
| 1.3.2 非标记定量蛋白质组学 |
| 1.4 研究背景、内容和意义 |
| 1.4.1 研究背景 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 1.4.3 研究意义 |
| 第二章 1DE-LC-MS系统化分析的差异蛋白质组学方法的流程建立和条件优化 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与仪器 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 实验仪器与试剂 |
| 2.2.3 相关溶液配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 平行梯度凝胶制备 |
| 2.3.2 平行凝胶电泳 |
| 2.3.3 平行切胶 |
| 2.3.4 标准化胶内酶解 |
| 2.3.5 CBB染色的必要性探究 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 平行制胶、平行电泳、平行切胶和标准化酶解流程的建立 |
| 2.4.2 CBB染色对简单样品1DE-LC-MS分析的影响 |
| 2.4.3 CBB染色对复杂样品1DE-LC-MS/MS系统化分析的影响 |
| 2.4.4 蛋白质native1DE-MS-blots或 SDS-PAGE-MS blots的构建 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第三章 非变性1DE-LC-MS系统化差异蛋白质组学分析方法的建立及在人血浆/血清研究中的应用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与仪器 |
| 3.2.1 实验仪器与试剂 |
| 3.2.2 相关溶液配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 人血浆和血清样品准备 |
| 3.3.2 人血浆和血清蛋白的非变性一维凝胶电泳 |
| 3.3.3 平行全泳道网格凝胶切取、胶粒编号及表观分子量评估 |
| 3.3.4 胶内酶解及Nano LC-MS/MS数据采集 |
| 3.3.5 质谱数据分析 |
| 3.3.6 Western blot实验 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 结合非变性PAGE分离,全泳道切胶和定量LC-MS/MS分析结果 |
| 3.4.2 总蛋白native1DE-MS blots反应整体蛋白分布 |
| 3.4.3 蛋白质native1DE-MS blots反应蛋白质结构信息 |
| 3.4.4 血浆和血清蛋白native1DE-MS blots的比较 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 SDS-PAGE-LC-MS系统化差异蛋白质组学分析方法建立及在脑缺血复灌损伤研究中的应用 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与仪器 |
| 4.2.1 实验动物 |
| 4.2.2 实验仪器与试剂 |
| 4.2.3 相关溶液配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 局灶性大鼠脑缺血复灌损伤模型构建 |
| 4.3.2 动物分组及实验设计 |
| 4.3.3 动物模型成功性验证 |
| 4.3.4 大鼠脑皮质蛋白质组学分析 |
| 4.3.5 Western blot蛋白验证 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 大鼠脑缺血复灌损伤模型验证结果 |
| 4.4.2 大鼠脑皮质蛋白质组数据整体评估 |
| 4.4.3 大鼠脑皮质蛋白质组的差异变化蛋白及Western blot验证 |
| 4.4.4 蛋白质SDS-PAGE-MS blots反应蛋白质结构信息 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 结论 |
| 创新之处 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（6）基于多种相互作用的固相萃取和纳米载药研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 绪论 |
| 1.1 固相萃取与相互作用 |
| 1.1.1 固相萃取发展历史 |
| 1.1.2 固相萃取机理 |
| 1.1.3 固相萃取步骤 |
| 1.1.4 固相萃取材料 |
| 1.1.5 新型的固相萃取材料和方法 |
| 1.2 分子印迹技术(MIT) |
| 1.2.1 分子印迹发展历史 |
| 1.2.2 分子印迹原理 |
| 1.2.3 分子印迹聚合物的制备 |
| 1.2.4 分子印迹聚合物与模板分子之间的相互作用 |
| 1.2.5 分子印迹固相萃取的应用 |
| 1.2.6 提高分子印迹固相萃取选择性的方法 |
| 1.3 固相微萃取(SPME) |
| 1.3.1 固相微萃取发展历史 |
| 1.3.2 固相微萃取基本理论 |
| 1.3.3 固相微萃取基本类型 |
| 1.3.4 SPME-LC自动化联用系统 |
| 1.3.5 固相微萃取新方法 |
| 1.4 纳米载药体系(NDDS)中的相互作用 |
| 1.4.1 NDDS发展历史 |
| 1.4.2 载药中的相互作用 |
| 1.4.3 纳米药物传递与机体的相互作用 |
| 1.4.4 纳米药物释放与体内药物效应的关系 |
| 1.4.5 纳米载药体系整体性研究思路 |
| 1.5 研究命题及其意义 |
| 1.6 研究内容与技术路线 |
| 1.7 本论文创新之处 |
| 2 双分子印迹顺序固相萃取新方法研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 实验材料和仪器 |
| 2.2.2 分子印迹聚合物(MIPs)制备与特性评价 |
| 2.2.3 MIPs和 NIPs的吸附机理分析 |
| 2.2.4 创建双分子印迹聚合物两步固相萃取法 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 MIPs和 NIPs的研制与其特征 |
| 2.3.2 MIPs的吸附特征与吸附机理 |
| 2.3.3 选择性的双分子印迹聚合物两步固相萃取法(TMIPs-TSPE) |
| 2.4 本章小结 |
| 3 直接注射式固相微萃取与液相色谱联用初探 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 试剂和仪器 |
| 3.2.2 实验准备与HPLC条件 |
| 3.2.3 直接注射式固相微萃取器的研制 |
| 3.2.4 新固相微萃取装置-液相色谱联用的搭建与操作 |
| 3.2.5 SPME的条件优化 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 萃取时间对固相微萃取效率的影响 |
| 3.3.3 解吸时间对固相微萃取效率的影响 |
| 3.3.4 解吸体积对固相微萃取效率的影响 |
| 3.3.5 萃取浓度对固相微萃取的影响 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 管内活细菌-固相萃取技术的初探 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 试剂和仪器 |
| 4.2.2 管内细菌的培养与活性评价 |
| 4.2.3 细菌作用药物后的状态 |
| 4.2.4 管内细菌-固相微萃取法的建立与操作 |
| 4.3 结果部分 |
| 4.3.1 管内活细菌涂敷情况分析 |
| 4.3.2 细菌活性评价 |
| 4.3.3 实时操作过程的监测 |
| 4.4 本章小结 |
| 5 糖基化白蛋白纳米载药体系的研制 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 试剂和仪器 |
| 5.2.2 糖基化牛血清白蛋白(Gal-BSA)的制备与表征 |
| 5.2.3 糖基化白蛋白姜黄素纳米粒(Gal-BSA-Cur NPs)的制备与表征 |
| 5.2.4 纳米药物的包封率和载药量测定 |
| 5.2.5 纳米药物释放行为 |
| 5.2.6 数据处理 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 Gal-BSA-Cur NPs制备流程 |
| 5.3.2 Gal-BSA特性评价 |
| 5.3.3 Gal-BSA-Cur NPs特性评价 |
| 5.3.4 纳米药物的包封率和载药量 |
| 5.3.5 纳米药物体外释放行为 |
| 5.4 本章小结 |
| 6 糖基化白蛋白纳米载药体系靶向治疗肝癌研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验部分 |
| 6.2.1 试剂和仪器 |
| 6.2.2 细胞培养 |
| 6.2.3 细胞对纳米药物的摄取能力评价 |
| 6.2.4 评价纳米药物对细胞毒性与增殖 |
| 6.2.5 评价纳米药物对细胞迁移行为 |
| 6.2.6 纳米药物对细胞凋亡及其信号通路的研究 |
| 6.2.7 数据处理 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 Gal-BSA-Cur NPs对癌细胞作用过程 |
| 6.3.2 细胞对纳米药物的摄取及竞争性结合分析 |
| 6.3.3 纳米药物对细胞毒性与增殖的影响 |
| 6.3.4 纳米药物对细胞凋亡的情况分析 |
| 6.3.5 纳米药物对细胞迁移行为的影响 |
| 6.3.6 纳米药物抑制癌细胞的机制研究 |
| 6.4 本章小结 |
| 7 糖基化白蛋白纳米载药体系的肠吸收与生物利用度考察 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 实验部分 |
| 7.2.1 实验材料和仪器 |
| 7.2.2 细胞培养与动物准备 |
| 7.2.3 评价药物对细胞毒性 |
| 7.2.4 评价细胞对药物的摄取能力与机制 |
| 7.2.5 药物的肠吸收转运研究 |
| 7.2.6 口服纳米药物的方法学评价与药代动力学研究 |
| 7.2.7 统计分析 |
| 7.3 结果与讨论 |
| 7.3.1 纳米药物剂量的选择 |
| 7.3.2 细胞对纳米药物的摄取情况研究 |
| 7.3.3 细胞摄取纳米药物的机制研究 |
| 7.3.4 细胞渗透与转运机制的研究 |
| 7.3.5 方法学验证 |
| 7.3.6 Gal-BSA-Cur NPs的药代动力学研究 |
| 7.4 本章小结 |
| 8 结论与展望 |
| 8.1 研究结论 |
| 8.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| A 作者在攻读学位期间发表及拟发表文章目录 |
| B 作者在攻读学位期间参与的科研项目目录 |
| C 学位论文数据集 |
| 致谢 |
（7）超大孔色谱纯化类病毒颗粒的过程研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 色谱技术在病毒和类病毒颗粒纯化中的应用 |
| 1.1.1 色谱技术纯化病毒、类病毒颗粒的难点 |
| 1.1.2 色谱技术纯化病毒、类病毒颗粒的解决方法 |
| 1.2 超大孔色谱分离填料 |
| 1.2.1 色谱分离填料发展历程 |
| 1.2.2 超大孔色谱分离填料的优势 |
| 1.2.3 超大孔色谱分离填料的种类以及应用 |
| 1.2.4 超大孔填料分离纯化病毒、类病毒颗粒的研究现状 |
| 1.3 蛋白质构象变化研究 |
| 1.3.1 蛋白质在色谱分离中的构象变化的影响因素 |
| 1.3.2 超大分子VLPs在色谱中构象变化的研究 |
| 1.3.3 超大孔填料提高蛋白质在色谱中的构象稳定性 |
| 1.4 蛋白质色谱过程中构象研究方法 |
| 1.4.1 蛋白色谱过程中的热力学特征 |
| 1.4.1.1 热力学基本原理 |
| 1.4.1.2 蛋白质与色谱间相互作用对热力学参数的影响 |
| 1.4.2 蛋白质色谱过程中的热力学研究方法 |
| 1.4.2.1 Van't Hoff方程分析法 |
| 1.4.2.2 等温滴定量热法 |
| 1.5 超大孔填料分离纯化疫苗的研究展望 |
| 1.6 本文研究内容和意义 |
| 2 适合于类病毒颗粒分离纯化的色谱填料筛选 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 离子交换色谱填料的表征 |
| 2.2.2 动态结合载量 |
| 2.2.3 HB-VLPs的离子交换色谱 |
| 2.2.4 酶联免疫法和高效液相色谱法分析HB-VLPs |
| 2.2.5 从重组汉逊酵母培养液中纯化HB-VLPs |
| 2.2.6 HB-VLPs纯度检测 |
| 2.3 实验结果与讨论 |
| 2.3.1 色谱填料的基本物性 |
| 2.3.2 离子交换填料孔径对不同分子量蛋白动态载量的影响 |
| 2.3.3 蛋白在阴离子交换填料上的分离效果 |
| 2.3.4 流速对于HB-VLPs色谱过程中回收率和结构的影响 |
| 2.3.5 洗脱盐类型对于HB-VLPs回收率和结构的影响 |
| 2.3.6 HB-VLPs的实际纯化 |
| 2.4 本章小结 |
| 3 填料孔径对蛋白质色谱性质影响的规律研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 逆体积色谱法测定填料可及孔隙体积和表观孔径 |
| 3.2.2 等度洗脱 |
| 3.2.3 吸附平衡实验 |
| 3.2.4 吸附动力学 |
| 3.2.5 动态结合载量 |
| 3.2.6 激光共聚焦 |
| 3.3 实验结果与讨论 |
| 3.3.1 蛋白和填料的基本物性 |
| 3.3.2 逆体积排阻色谱法对IEC填料孔径结构进行表征 |
| 3.3.3 可及比表面积随IEC填料的孔径与蛋白大小比的变化 |
| 3.3.4 静态吸附载量随着IEC填料的孔径与蛋白大小比的变化 |
| 3.3.5 吸附解离常数随着IEC填料的孔径与蛋白大小比的变化 |
| 3.3.6 吸附动力学随着IEC填料的孔径与蛋白大小比的变化 |
| 3.3.7 动态载量随着IEC填料的孔径与蛋白大小比的变化 |
| 3.3.8 根据CLSM观测研究蛋白质在IEC填料上的吸附动力学 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 超大孔离子交换填料提高类病毒颗粒的载量和稳定性 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 定性离子交换填料 |
| 4.2.2 吸附平衡实验 |
| 4.2.3 动态结合载量 |
| 4.2.4 吸附动力学 |
| 4.2.5 激光共聚焦 |
| 4.2.6 不同进料量的HB-VLPs的离子交换色谱 |
| 4.2.7 酶联免疫法(ELISA)和高效液相色谱法分析HB-VLPs |
| 4.2.8 透射电子显微镜法(TEM)分析 |
| 4.2.9 从重组汉逊酵母培养液中纯化HB-VLPs |
| 4.2.10 HB-VLPs纯度检测 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 离子交换填料孔径大小对于HB-VLPs吸附平衡的影响 |
| 4.3.1.1 HB-VLPs在不同孔径填料上的静态载量 |
| 4.3.1.2 激光共聚焦显示孔径大小对于HB-VLPs吸附的影响 |
| 4.3.2 IEC填料孔径大小对于吸附动力学的影响 |
| 4.3.3 IEC填料孔径大小对于HB-VLPs动态载量的影响 |
| 4.3.4 IEC填料孔径大小对于HB-VLPs色谱过程中回收率和结构的影响 |
| 4.3.4.1 进料量对于HB-VLPs回收率和结构的影响 |
| 4.3.4.2 相同进料量孔径大小对于HB-VLPs回收率和结构的影响 |
| 4.3.5 HB-VLPs在四种填料上的实际纯化 |
| 4.4 本章小结 |
| 5 超大孔填料促进HB-VLPs纯化过程中结构稳定性的热力学机理研究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 离子交换色谱填料的定性 |
| 5.2.2 HB-VLPs完整颗粒在不同孔径填料上的离子交换色谱 |
| 5.2.3 酶联免疫分析和高效液相色谱法分析HB-VLPs |
| 5.2.4 HB-VLPs完整颗粒和HB-VLPs解聚体的定性 |
| 5.2.5 不同孔径填料上的吸附平衡实验 |
| 5.2.6 ITC实验：HB-VLPs完整颗粒和HB-VLPs解聚体 |
| 5.3 实验结果与讨论 |
| 5.3.1 色谱实验检测蛋白结构变化 |
| 5.3.1.1 IEC填料的孔径对于HB-VLPs抗原回收率的影响 |
| 5.3.1.2 IEC填料的孔径对于HB-VLPs结构的影响 |
| 5.3.1.3 圆二色谱(CD) |
| 5.3.2 孔径对于HB-VLPs完整颗粒和解聚体吸附平衡的影响 |
| 5.3.3 等温滴定量热实验研究 |
| 5.3.3.1 吸附热力学模型的建立 |
| 5.3.3.2 HB-VLPs完整颗粒和解聚体的ITC实验确定模型参数 |
| 5.3.3.3 孔径对于HB-VLPs完整颗粒和解聚体吸附焓变的影响 |
| 5.3.3.4 关于ITC热力学参数的进一步分析和讨论 |
| 5.4 本章小结 |
| 6 超大孔填料配基密度影响HB-VLPs结构稳定性的热力学机理研究 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 制备不同配基密度的阴离子交换填料 |
| 6.2.2 离子交换色谱填料的性能测定 |
| 6.2.3 HB-VLPs在不同配基密度填料上的离子交换色谱 |
| 6.2.4 酶联免疫分析和高效液相色谱法分析HB-VLPs |
| 6.2.5 HB-VLPs完整颗粒和HB-VLPs解聚体的定性 |
| 6.2.6 不同配基密度填料上的吸附平衡实验 |
| 6.2.7 ITC实验：HB-VLPs完整颗粒和HB-VLPs解聚体 |
| 6.3 实验结果与讨论 |
| 6.3.1 色谱实验检测蛋白结构变化 |
| 6.3.1.1 IEC填料配基密度对于HB-VLPs抗原回收率的影响 |
| 6.3.1.2 IEC填料的配基密度对于HB-VLPs结构的影响 |
| 6.3.1.3 圆二色谱(CD) |
| 6.3.2 配基密度对于HB-VLPs完整颗粒和解聚体吸附平衡的影响 |
| 6.3.3 等温滴定量热实验 |
| 6.3.3.1 热力学模型阐明色谱过程HB-VLPs解聚体的形成 |
| 6.3.3.2 ITC实验确定模型参数 |
| 6.3.3.3 配基密度对IEC中HB-VLPs完整颗粒构象变化焓变的影响 |
| 6.3.4 关于ITC热力学参数的进一步分析和讨论 |
| 6.3.5 溶菌酶与不同配基密度填料相互作用的热力学 |
| 6.4 本章小结 |
| 7 结论与展望 |
| 7.1 本文的研究结果 |
| 7.2 本文的创新点 |
| 7.3 展望 |
| 符号表 |
| 参考文献 |
| 附录 A图目录 |
| 附录 B表目录 |
| 个人简历及发表文章目录 |
| 致谢 |
（8）新型复合色谱介质的制备与性能研究（论文提纲范文）
| 学位论文数据集 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 壳核介质简介 |
| 1.2.1 发展背景 |
| 1.2.2 发展历程 |
| 1.2.3 目前研究方向 |
| 1.3 离子交换色谱介质简介 |
| 1.3.1 应用现状 |
| 1.3.2 吸附能力影响因素 |
| 1.4 疏水型色谱介质简介 |
| 1.4.1 作用机理 |
| 1.4.2 研究现状 |
| 1.5 本文的选题思路及主要内容 |
| 第二章 孔隙率分布对介质性能的影响 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验试剂与仪器 |
| 2.2.1 实验试剂 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 Matlab模拟介质结构对介质性能的影响 |
| 2.3.2 介质的制备 |
| 2.3.3 介质的表征 |
| 2.3.4 介质的吸附及解吸附表征 |
| 2.4 结果讨论 |
| 2.4.1 matlab运算模拟结果讨论 |
| 2.4.2 介质的表征 |
| 2.4.3 介质的静态吸附 |
| 2.4.4 介质的动力学吸附 |
| 2.4.5 介质的洗脱曲线 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 修饰密度分布对介质性能的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验试剂与仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 matlab模拟修饰密度对分离效率的影响 |
| 3.3.2 介质的制备 |
| 3.3.3 修饰密度的测定 |
| 3.3.4 介质的吸附性能比较 |
| 3.3.5 柱实验的比较 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 matlab运算模拟结果讨论 |
| 3.4.2 修饰密度的比较 |
| 3.4.3 介质的静态吸附 |
| 3.4.4 介质的动力学吸附 |
| 3.4.5 与均质琼脂糖介质的柱实验比较 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 疏水-离子复合配基介质性能的研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验试剂及仪器 |
| 4.2.1 实验试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 复合色谱介质的修饰 |
| 4.3.2 苯基修饰密度的测定 |
| 4.3.3 介质的红外光谱分析 |
| 4.3.4 介质的吸附与解吸附 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 复合介质的理化分析 |
| 4.4.2 不同溶液对介质静态吸附性能的影响 |
| 4.4.3 不同溶液对介质动态吸附的影响 |
| 4.4.4 相同吸附溶液中介质性能的比较 |
| 4.4.5 复合介质解吸附溶液的选择 |
| 4.4.6 复合介质的静态吸附拟合 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 研究成果与发表的学术论文 |
| 导师及作者简介 |
| 附件 |
（9）宫颈癌早期预警分子指标的血浆蛋白质组学研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 基于二维液相色谱-质谱技术的宫颈病变患者血浆蛋白质组学研究 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 临床标本 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 1.4 化学试剂与耗材 |
| 1.5 专用试剂及缓冲液的配制 |
| 1.6 实验方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 第二部分 基于双向荧光差异电泳-质谱技术的宫颈病变患者血浆蛋白质组学研究 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 临床标本 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 1.4 试剂与耗材 |
| 1.5 特殊试剂的制备 |
| 1.6 实验方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 第三部分 宫颈癌及癌前病变特异性候选血浆蛋白标志物的生物信息学分析 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 生物信息学分析研究对象 |
| 1.2 生物信息学分析软件 |
| 1.3 实验方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 第四部分 宫颈癌及癌前病变特异性候选血浆蛋白标志物的单一指标验证分析 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 研究对象和临床标本 |
| 1.2 ELISA验证分析的候选标记蛋白 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 1.4 试剂与耗材 |
| 1.5 实验方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（10）清开灵注射液中多肽含量的快速测定及杂质蛋白的限量检查（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 清开灵注射液综述 |
| 1 清开灵注射液的化学成分研究 |
| 2 清开灵注射液的药理作用及临床应用 |
| 2.1 清开灵注射液的药理作用 |
| 2.2 清开灵注射液的临床应用 |
| 3 清开灵注射的不良反应 |
| 3.1 药物成分因素 |
| 3.2 制剂工艺及辅料因素 |
| 3.3 配伍用药因素 |
| 3.4 给药方案因素 |
| 3.5 患者体质因素 |
| 4 清开灵注射液的质量标准研究 |
| 第二章 蛋白质的分离纯化以及检测方法的综述 |
| 1 蛋白质的分离和纯化方法 |
| 1.1 蛋白质的提取 |
| 1.2 蛋白质的浓缩 |
| 1.3 蛋白质的分离纯化 |
| 2 蛋白质的分析及检测方法 |
| 2.1 蛋白质的定量分析方法 |
| 2.2 蛋白质的分子量测定方法 |
| 3 蛋白质分离与检测的联用技术 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验部分 |
| 第一章 Bradford法结合超滤离心法测定中药注射液中蛋白及总肽的含量 |
| 1 实验设计 |
| 1.1 研究内容 |
| 1.2 技术路线 |
| 1.3 仪器与试剂 |
| 1.3.1 仪器 |
| 1.3.2 样品与试剂 |
| 2 方法与结果 |
| 2.1 清开灵注射液中蛋白及多肽类物质的含量测定方法的建立 |
| 2.1.1 溶液的配制 |
| 2.1.2 方法学考察 |
| 2.1.3 小结与讨论 |
| 2.2 其他中药注射液中杂质蛋白的限量测定 |
| 2.2.1 磺基水杨酸沉淀比浊法检测限的测定 |
| 2.2.2 样品含量测定 |
| 2.2.3 小结与讨论 |
| 3 本章小结与讨论 |
| 第二章 超滤所得大分子样品反相指纹图谱的探索性研究 |
| 1 仪器与试剂 |
| 2 色谱条件 |
| 3 样品处理方法 |
| 4 结果与讨论 |
| 第三章 交联葡聚糖凝胶柱对清开灵注射液中大分子物质分离方法的建立 |
| 1 实验设计 |
| 1.1 实验内容 |
| 1.2 技术路线 |
| 1.3 仪器与试剂 |
| 1.3.1 仪器 |
| 1.3.2 试剂 |
| 2 方法与结果 |
| 2.1 凝胶柱操作 |
| 2.2 大分子物质分离预实验 |
| 2.2.1 方法 |
| 2.2.2 结果与讨论 |
| 2.3 分离条件的优化 |
| 2.3.1 Bradford法选择葡聚糖凝胶型号 |
| 2.3.2 洗脱液的选择 |
| 2.3.3 标准溶液对照法选择葡聚糖凝胶型号 |
| 2.3.4 流速的选择 |
| 2.4 样品分离方法的建立 |
| 2.4.1 样品分离方法 |
| 2.4.2 结果与讨论 |
| 3 本章小结与讨论 |
| 第四章 TSK色谱柱对清开灵注射液中杂质蛋白的限量检查 |
| 1 仪器与试剂 |
| 1.1 仪器 |
| 1.2 试剂 |
| 2 色谱条件与系统适应性试验 |
| 3 方法学考察试验 |
| 3.1 标准蛋白分子量线性关系的考察 |
| 3.2 专属性试验 |
| 3.3 质量标准曲线 |
| 3.4 重复性试验 |
| 3.5 葡聚糖凝胶c层析柱的回收率试验 |
| 3.5.1 对照品与样品溶液的制备 |
| 3.5.2 方法与结果 |
| 3.6 检测限和定量限 |
| 3.7 样品分析 |
| 3.7.1 对照品溶液与样品溶液的制备 |
| 3.7.2 方法与结果 |
| 3.7.3 小结与讨论 |
| 3.8 高分子蛋白的限量检查方法 |
| 4 本章小结与讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、The Development of Gel Media and Columns for Large-Scale Chromatography of Proteins, a Historical Review（论文参考文献）
- [1]聚合物模板法制备5μm单分散全多孔硅胶微球及其在色谱分离中的应用[D]. 白江琦. 西北大学, 2021(12)
- [2]基于质谱的糖胺聚糖结构表征及其与蛋白互作分子机制研究[D]. 盛安然. 山东大学, 2021(11)
- [3]UVB诱导长春花及白桑次生代谢激活及调控的系统生物学研究[D]. 钟卓珩. 浙江大学, 2021(01)
- [4]MDCK细胞基质与鸡胚基质培养对流感病毒及其疫苗影响的研究[D]. 张哲罡. 武汉生物制品研究所, 2020(01)
- [5]基于1DE-LC-MS系统化分析的差异蛋白质组学研究策略的建立与应用[D]. 文美玲. 华南理工大学, 2020(01)
- [6]基于多种相互作用的固相萃取和纳米载药研究[D]. 黄一可. 重庆大学, 2020(02)
- [7]超大孔色谱纯化类病毒颗粒的过程研究[D]. 于孟冉. 中国科学院研究生院(过程工程研究所), 2015(05)
- [8]新型复合色谱介质的制备与性能研究[D]. 史鹏超. 北京化工大学, 2014(07)
- [9]宫颈癌早期预警分子指标的血浆蛋白质组学研究[D]. 郭霞. 新疆医科大学, 2012(05)
- [10]清开灵注射液中多肽含量的快速测定及杂质蛋白的限量检查[D]. 周冠月. 北京中医药大学, 2011(09)