一、抗人P185~(erbB2)嵌合抗体在CHO细胞中的高效表达及其活性分析（论文文献综述）
张龙真,郭佳,顾华,房健民[1]（2017）在《重组抗c-Met嵌合抗体的构建及其利用慢病毒快速表达》文中研究表明文章采用兼并引物逆转录PCR（reverse transcription PCR,RT-PCR）从特异性分泌抗人c-Met阻断型单克隆抗体的杂交瘤细胞株3E1D7中扩增抗体重、轻链可变区基因（VH和VL）。通过重叠延伸PCR（splice overlap extension PCR,SOE-PCR）方法分别将鼠源VH与人IgG1的重链恒定区基因Cγ1相连,鼠源VL与人IgG1的轻链恒定区基因Cκ相连获得嵌合抗体重链基因（H）和轻链基因（L）。将嵌合抗体重、轻链基因连接到慢病毒表达载体中,经双酶切和测序鉴定成功构建了慢病毒表达质粒pRRL-CMV-ch3E-H和pRRL-CMVch3E-L。磷酸钙法转染293T细胞,表达的嵌合抗体经Protein A Sepharose 4B亲和层析柱纯化,通过SDSPAGE检测抗体的完整性,ELISA法检测嵌合抗体的特异性抗原结合活性及人源性。感染慢病毒的293T细胞上清纯化后,经SDS-PAGE分析,可见25kDa嵌合抗体轻链和50kDa的嵌合抗体重链蛋白。且纯化后的嵌合抗体能够与c-Met抗原特异性结合成功获得重组抗人c-Met嵌合抗体,该抗体减少了鼠源成分,降低了免疫原性,利用慢病毒可以快速获得大量重组抗体蛋白,为该抗体药物的体内外评估奠定基础。
孙红,张国利,岳玉环,张辉[2]（2014）在《抗人细胞间粘附分子-1嵌合抗体的制备及其生物学活性》文中研究指明目的构建抗人细胞间粘附分子-1（intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1）嵌合抗体的真核表达质粒,在CHO-dhfr-细胞中进行表达,并检测其生物学活性。方法采用RT-PCR法从特异性分泌抗人ICAM-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株3F2中扩增抗体VH和VL基因,从人淋巴细胞RNA中扩增人κ、IgG1的轻、重链恒定区序列,再通过重叠延伸PCR连接鼠源性可变区基因片段与人源性恒定区基因片段,获得人-鼠嵌合抗体基因;将轻、重链基因连接至pIRES双表达载体,构建嵌合抗体真核表达质粒;将质粒在脂质体LipofectAMINE介导下转染CHO-dhfr-细胞进行表达,表达的嵌合抗体经Protein A-Sepharose 4B亲和层析柱纯化后,紫外分光光度法测定抗体浓度,ELISA法检测嵌合抗体的特异性抗原结合活性及人源性,并进行还原性SDS-PAGE分析、Western blot分析及抑制细胞间黏附活性分析。结果嵌合抗体真核表达质粒pIRES-anti-ICAM-1经双酶切鉴定构建正确;嵌合抗体在真核细胞CHO-dhfr-中高效表达,培养上清中表达量可达0.5 mg/L;纯化的嵌合抗体经10%还原性SDS-PAGE分析,可见相对分子质量分别约为25 000的IgG轻链和50 000的IgG重链,相对分子质量约25 000的蛋白可被羊抗人IgGκ链所识别,而相对分子质量约50 000的蛋白可被羊抗人IgGγ链所识别;纯化的嵌合抗体可与羊抗人κ链或羊抗人IgG多抗呈强阳性反应,可与人ICAM-1抗原特异结合;该嵌和抗体具有良好的抑制内皮细胞与单核细胞黏附的活性。结论成功制备了抗人ICAM-1嵌合抗体,并在真核细胞中实现高表达,该抗体减少了鼠源性成分,降低了其免疫原性,为ICAM-1相关的炎性疾病的抗体治疗奠定了基础。
刘芳,李力,张玮,王琪[3]（2013）在《抗p185erbB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体的构建》文中提出本研究构建抗p185erbB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体,并将其转染293T细胞,明确转染后嵌合抗体基因的表达情况。采用PCR法扩增抗p185erbB2鼠单抗轻、重链可变区基因（vL和vH）和人IgG1的轻、重链恒定区基因（κ和γ1）,再利用三引物PCR法将vL和κ,vH和γ1进行拼接,得到嵌合轻链基因（L）和嵌合重链基因（H）,分别插入质粒pVAX1/IRES的IRES元件的下、上游。用内切酶将H-IRES-L从pVAX1/H-IRES-L上切下,插入慢病毒载体pWPI中,经相应酶切和测序鉴定,正确构建了慢病毒表达载体pWPI/H-IRES-L。将其转染293T细胞,48h后通过荧光显微镜检测绿色荧光蛋白（GFP）的表达,RT-PCR和直接ELISA法检测嵌合抗体的表达。结果显示,转染pWPI/H-IRES-L的293T细胞中有嵌合轻链和嵌合重链基因的共同表达,而且表达的嵌合抗体能够与p185erbB2分子特异性结合,为今后抗p185erbB2工程抗体的研究奠定了基础。
张雪,张爱华,闭兰,赵亚杰,孙可芳,方志正[4]（2009）在《抗人T淋巴细胞CD4人-鼠嵌合抗体的真核表达》文中研究表明目的在小鼠骨髓瘤细胞SP2/0中表达抗人T淋巴细胞CD4人-鼠嵌合抗体。方法真核表达质粒PAG4622+CD4VL和PAH4604+CD4VH经酶切和序列测定后,采用电穿孔转染技术将二者共转染SP2/0细胞,经组胺醇和霉酚酸联合筛选阳性克隆,通过ELISA、流式细胞术、RT-PCR和DNA测序的方法进行初步鉴定。结果真核表达质粒经酶切和测序鉴定证明构建正确。获得2株分泌抗人T淋巴细胞CD4人-鼠嵌合抗体的阳性SP2/0细胞克隆0925CASP2/0和1107CASP2/0,嵌合抗体表达量为0.5～2ng/ml。结论已成功地在SP2/0细胞中表达了抗人T淋巴细胞CD4人-鼠嵌合抗体,为该抗体在其他真核细胞中的高效表达及临床应用奠定了基础。
王德彬,颜华[5]（2008）在《含前S的乙肝病毒表面抗原的纯化与分析》文中指出将获得的能稳定表达含前S的乙肝病毒表面抗原的重组CHO细胞进行培养,并收取培养液上清,拟分析并纯化重组CHO细胞表达的蛋白。利用高效液相层析试验,分析表达产物,表明重组细胞表达产物具有乙肝表面抗原——大蛋白（LS）的生化特性。并通过沉淀离心和Sepharose CL-4B柱层析进行了初步纯化。结果表明,C10细胞株表达的蛋白与预期设计的相似,并获得初步的纯化。
胡玲玲[6]（2008）在《CD86人—鼠嵌合抗体的构建、表达及其生物学活性的初步研究》文中研究表明B7分子（包括B7-1和B7-2,又称CD80和CD86）是表达在APC表面的共刺激分子,其与表达于T细胞表面的相应受体CD28/CTLA-4结合产生共刺激信号,对T细胞的活化和耐受起关键性调节作用。CD86为一个由1120bp的基因所编码,其基因序列与B7-1有26%的同源性,整个蛋白由306个氨基酸组成,属于I型跨膜糖蛋白。本研究在已获得稳定分泌鼠抗人CD86单克隆抗体杂交瘤细胞株的基础上,采用基因重组技术及细胞与分子生物学方法等进行了以下研究:1.CD86人-鼠嵌合抗体表达载体的构建及在CHO细胞中的表达首先采用RT-PCR从特异性分泌抗人CD86单克隆抗体的杂交瘤细胞株1D1中提取总RNA,常规逆转录,应用简并引物进行PCR扩增,并根据重、轻链基因序列分析结果设计引物,应用SMART-PCR方法扩增含信号肽序列的VH和VL基因,进行测序鉴定。在本科室构建的表达质粒PIRES/ch5C11基础上,通过PCR获得人IgG1γ链、κ链恒定区基因。将含信号肽序列的VH序列和人的IgG1重链恒定区序列进行拼接获得嵌合重链,将含信号肽序列的VL序列和人的κ链恒定区序列进行拼接获得嵌合轻链,拼接产物测序鉴定,构建共表达嵌合重、轻链的重组质粒pIRES/ch1D1。采用脂质体法将重组质粒转染293T细胞。以CD86-L929基因转染细胞株作为检测细胞,经流式细胞术对293T细胞培养上清鉴定后转染CHO细胞,再行鉴定后大量收集无血清培养上清,经Protein G亲和层析纯化及Lowry法定量。结果显示,本研究成功构建了含人-鼠嵌合重链和嵌合轻链基因的CD86人-鼠嵌合抗体真核表达载体pIRES/ch1D1。选择中国仓鼠卵巢细胞（CHO）作为表达宿主,经试剂盒抽提的pIRES/ch1D1嵌合抗体重组表达质粒用脂质体法转染CHO细胞,经G418加压筛选后进行亚克隆,获得持续稳定分泌抗人CD86人-鼠嵌合抗体（ch1D1）的基因转染细胞株（ch1D1-CHO）。RT-PCR鉴定结果表明ch1D1表达基因成功整合在ch1D1-CHO细胞中;FCM结果表明,转染pIRES/ch1D1质粒的CHO培养上清中的嵌合抗体与L929-CD86基因转染细胞膜型CD86分子的阳性结合率为98.5%。从CHO细胞培养上清中获取嵌合抗体纯化品的量约为3.0mg/L。2.CD86人—鼠嵌合抗体的生物学活性的初步研究采用间接免疫荧光及流式细胞术方法,对多株肿瘤细胞株Daudi、Sub-T、U937、Jurkat、HO8910、H1299及WERI-RB1细胞膜性CD86分子进行分析。在此基础上,选取天然高表达CD86及CD80分子的Daudi细胞为靶细胞,观察和分析了抗CD86嵌合抗体单独及联合抗CD80嵌合抗体对细胞生长和增殖的影响作用。将嵌合抗体（终浓度为5μg/mL）加入到Daudi细胞的培养体系中,经显微镜观察及MTT法分析,嵌合抗体对Daudi细胞的生长具有抑制作用（p＜0.05）,且CD86与CD80嵌合抗体具有协同抑制作用。将两个健康人外周血单个核细胞（PBMC）加入96孔板中,分别加入CD86嵌合抗体及联合CD80嵌合抗体（终浓度为5μg/mL）,于培养72小时采用MTT法检测增殖情况。结果显示在双向混合淋巴细胞反应中,CD86嵌合抗体能抑制混合淋巴细胞的增殖效应,且CD86与CD80嵌合抗体具有协同抑制作用。综上所述,本实验成功构建了CD86人-鼠嵌合抗体（ch1D1）真核表达质粒,并在CHO细胞中实现了稳定表达,表达的嵌合抗体对B淋巴瘤细胞株Daudi细胞的生长增殖具有抑制作用,并且在混合淋巴细胞反应中,能抑制混合淋巴细胞的增殖效应。
王阶平[7]（2006）在《抗人肺癌单克隆抗体3D3的人源化及分子小型化研究》文中研究表明自1975年杂交瘤技术问世以来,单克隆抗体（mAb）因其高度的均一性、亲和力和选择性等优点,在临床诊断和治疗等方面得到广泛应用。但鼠源性mAb存在可引起人体产生人抗鼠抗体（HAMA）反应、分子大而穿透能力差等缺陷,极大地削弱了其临床疗效。随着分子生物学的发展,人们可以通过抗体的人源化和小型化,降低鼠源性mAb的免疫原性,改善其药代动力学特性,从而克服其临床应用上的障碍。我们制备的鼠抗人肺癌单克隆抗体3D3,在一系列体内外研究中,显示出其具有较理想的临床应用前景。为了推进其临床应用研究,本文对mAb 3D3进行了人源化和分子小型化改造。采用CDR移植技术对mAb3D3的重链可变区进行人源化。设计并通过重叠PCR技术构建出hu3D3VH单域抗体基因。为了提高hu3D3VH的功能性亲和力,通过重组PCR技术分别将SV5-Cys基因和p53四聚化结构域基因与hu3D3VH基因融合,得到同源二聚体dihu3D3VH和四聚体tehu3D3VH基因。分别构建pET-22b（+）/hu3D3VH、pET-22b（+）/dihu3D3VH和pET-22b（+）/tehu3D3VH表达载体,并在E.coli BL21（DE3）中表达。它们的表达产物均主要以包涵体的形式存在,且表达量均占菌体总蛋白的30%以上。表达产物经Ni2+亲和层析柱纯化后,目的蛋白的纯度均在95%以上。间接ELISA结果证实,单域抗体hu3D3VH的抗原反应性和特异性与3D3VH基本相同。竞争ELISA结果证实,hu3D3VH保留了单域抗体3D3VH的抗原表位特异性。流式细胞仪的分析结果显示,与3D3VH相比,hu3D3VH的抗原结合能力下降了约29%;而与hu3D3VH相比,dihu3D3VH和tehu3D3VH与靶抗原的结合能力分别提高了约60%和160%。本文成功建立了人源化单域抗体hu3D3VH的高效原核表达系统,制备的hu3D3VH保留了亲本抗体的抗原反应性和特异性,并通过基因工程技术获得了功能性亲和力得到优化的hu3D3VH的同源二聚体和四聚体。这些研究工作为进一步的体内外生物活性研究及研制新型的肺癌靶向治疗药物奠定了重要基础。
陈振海,范学政,夏春,王琴,宋立,王在时,宁宜宝[8]（2005）在《猪瘟病毒E0基因在CHO细胞中的表达》文中进行了进一步梳理将EGFPE0融合基因插入哺乳动物细胞表达载体pCI-dhfr中,构建重组质粒pCI-EGFPE0。将重组质粒转染CHO（dhfr-）,在荧光显微镜下观察到少数细胞呈现绿色荧光,表明转染成功。通过MTX加压筛选后,在荧光显微镜下观察到多数细胞呈现强绿色荧光,表明重组融合蛋白EGFPE0在CHO细胞中得到大量表达。高效表达重组融合蛋白细胞克隆的获得为进一步大量制备可溶性的猪瘟病毒E0糖蛋白、制备其单抗筛选抗原表位及研究E0蛋白的生物学功能奠定基础。
单连慧[9]（2004）在《重组CHO细胞高效表达乙肝表面抗原的研究》文中指出目前，全世界有3.5～4亿人为慢性乙肝病毒携带者，其中九千万人发展成继发性肝病。由于HBV感染及其继发病而死亡的患者每年约1～2百万。我国是HBV感染的高发区，约1.7亿人受HBV感染，一千七百万人患慢性肝炎。每年死于HBV导致的肝癌，肝硬化者约五十万人。注射乙肝疫苗是预防乙型肝炎的重要手段。采用乙肝疫苗来预防乙型肝炎，经过多年广泛应用以被证明是一种安全、可靠、有效的方法。世界卫生组织（WHO）推荐在乙型肝炎高度流行的国家给婴幼儿常规免疫接种。目前我国已将接种乙肝疫苗纳入国家计划免疫体系。我国，由中国预防医学科学院病毒所和长春生物制品研究所共同研制的中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）表达的乙肝表面抗原S蛋白于1992年批量上市。利用CHO细胞表达的乙肝表面抗原具有免疫原性强，阳转率高的优点，但产量低是目前遇到的主要问题。长春生物制品所目前生产所用细胞株构建于二十世纪八十年代末，产量在12 mg HBsAg/48 hr/L，产品供不应求。为了扩大市场份额，向社会提供更多的优质的乙肝疫苗，我们打算构建新的CHO工程细胞株，使其HBsAg表达量在现有水平上得到提高。我们对目前长春生物制品所使用的乙肝疫苗生产细胞株C28的特点进行仔细研究，在查阅大量文献的基础上提出全新的表达载体设计方案，包括更换启动子、引入内含子、去除目的基因的5′和3′非翻译区、弱化抗性标记基因、改造目的基因中的稀有密码子等，构建了乙型肝炎病毒表面抗原S基因的两种新型表达载体。启动子是影响外源基因表达效率的关键因素之一。我们构建的1号和3号两种表达载体是以pCI和pCIneo质粒为出发质粒。pCI和pCIneo都带有hCMV启动子，此启动子比pSV中的SV40早期启动子要强5倍。 <WP=69>表达载体中引入天然或人工合成的内含子序列有利于引导外源蛋白前体的稳定性，我们选择的pCI和pCIneo表达载体中，紧接hCMV下游有一IVS序列，有利于目的基因mRNA的成熟与稳定。在目的基因5′非翻译区（UTR），有可能形成一定的二级结构，从而影响目的基因的翻译起始，而3′非翻译区则可能存在降低mRNA稳定性，影响mRNA寿命的区域，从而影响外源基因的表达。所以我们构建1号和3号表达载体时，去除目的基因的5′和3′非翻译区。对dhfr的弱化可以大大提高共扩增基因的拷贝数，而对neo的弱化可促使筛选到整合于染色体热点上的转化子。1号表达载体通过去除SV40早期启动子中的增强子而弱化dhfr基因的表达；3号表达载体在弱化dhfr基因表达的同时，又增添了一种新的选择标记，即neo。采用去除SV40早期启动子中的增强子来弱化启动子强度，从而达到弱化neo基因表达的目的。稀有密码子在真核细胞中对翻译有一定的影响，在真核生物中有两个最稀有密码子TTA和TCG，当几个这种稀有密码子相距较近时会严重阻碍核糖体的前进，使翻译效率大大降低，表达水平下降。在本课题中，通过对乙肝表面抗原S基因密码子使用情况的分析表明，在213，216位氨基酸处分别存在一个使用频率最低的密码子TTA，二者只相距6个核苷酸。我们预计，这两个相距较近的密码子可能会对翻译过程造成很大的影响，从而降低蛋白表达量。因此，我们用哺乳动物细胞最常用密码子CTG来取代TTA，同时将224位稀有密码子GTA突变成GTG得到Sm基因。用PCR方法从长春生物制品研究所基因工程乙肝疫苗生产用工程细胞C28中分离和扩增HBsAg S基因片段，采用重叠PCR技术将第213，216和224位氨基酸的三个稀有密码子替换成哺乳动物细胞偏爱的密码子，得到Sm。以C28基因组DNA为模板，扩增出570bp的dhfr基因和930bp的SV弱<WP=70>+dhfr基因，其中后者含有SV40早期启动子序列和dhfr基因序列。以pCIneo为模板，扩增出1140bp的SV弱+neo基因，它含有SV40早期启动子序列和完整的新霉素磷酸转移酶基因序列。把Sm基因、dhfr、SV弱+dhfr、SV弱+neo分别克隆到pCI和pCIneo载体上，构建成两种表达载体。两种表达载体经PCR方法和酶切方法证明构建正确。序列分析表明所构建的表达载体插入的外源基因型为我国乙型肝炎病毒主要流行株adr亚型的S基因，对该基因稀有密码子的改造结果也与预期相符；载体上其他表达元件也经测序证实。将两种质粒载体经大提和氯化铯密度梯度离心纯化后转染CHO-dhfr-细胞，在CHO-dhfr-细胞中成功表达出HBsAg。利用DIAGNOSTIC KIT for HBsAg检测HBsAg的表达量。在dhfr基因与目的基因共转化的细胞中，随着培养基中MTX浓度的增加，dhfr基因与外源基因均明显扩增。将1号、3号两种表达载体成功转染到CHO-dhfr-细胞后，1号转染的细胞一直使用MTX筛选培养基,并逐渐增加MTX的浓度，使S基因拷贝数不断增加；3号转染的细胞我们首先使用G418使3号表达载体尽可能整合到染色体的热点部位。然后我们用MTX代替G418筛选培养基，并逐渐加大MTX的浓度，使S基因得到扩增。经不同加压筛选策略获得抗性细胞群，进一步用单克隆培养筛选出了几株高效表达HBsAg的细胞株，为提高重组CHO乙型肝炎疫苗的产量奠定了基础。
刘洋,臧晓怡,李兰英,郭善一[10]（2003）在《破骨细胞分化因子哺乳类荧光蛋白融合表达载体的构建与序列鉴定》文中研究表明目的 :为了用基因工程表达重组人破骨细胞分化因子 （ODF）可溶性功能片段 ,构建哺乳动物细胞表达载体。方法 :PCR扩增人ODF基因cDNA功能活性片段 ,利用拓扑酶连接入哺乳动物细胞表达载体 pcDNA3.1/CT -GFP -TOPO ,转化E.coliTOP10感受态细胞 ,氨苄青霉素筛选阳性克隆 ,提取质粒进行酶切分析和测序分析。结果 :成功克隆了人ODF基因cDNA功能片段。结论 :载体构建成功 ,为基因工程制备ODF并进一步研究奠定了基础
二、抗人P185~(erbB2)嵌合抗体在CHO细胞中的高效表达及其活性分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、抗人P185~(erbB2)嵌合抗体在CHO细胞中的高效表达及其活性分析（论文提纲范文）
（1）重组抗c-Met嵌合抗体的构建及其利用慢病毒快速表达（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 质粒、菌株和细胞 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 亲本基因的扩增及测序 |
| 1.4 嵌合抗体完整重、轻链基因的扩增 |
| 1.5 嵌合抗体慢病毒表达质粒的构建 |
| 1.6 嵌合抗体在293T细胞中的表达 |
| 1.6.1 绿色荧光蛋白的表达 |
| 1.6.2 检测H、L链基因mRNA的表达 |
| 1.7 嵌合抗体的纯化 |
| 1.8 嵌合抗体ch3E1D7生物学活性检测 |
| 2 结果分析 |
| 2.1 表达载体构建鉴定 |
| 2.2 感染细胞的荧光显微镜观察 |
| 2.3 转录水平鉴定嵌合抗体重、轻链基因的表达 |
| 2.4 SDS-PAGE分析 |
| 2.5 嵌合抗体生物学活性检测 |
| 3 讨论 |
（2）抗人细胞间粘附分子-1嵌合抗体的制备及其生物学活性（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细胞、菌株及质粒 |
| 1.2主要试剂 |
| 1.3 引物设计及合成 |
| 1.4 杂交瘤细胞和人淋巴细胞总RNA的提取及c DNA的合成 |
| 1.5 VH、VL基因和CL、CH基因的扩增及克隆 |
| 1.6 完整轻、重链抗体基因的扩增 |
| 1.7 嵌合抗体真核表达质粒的构建 |
| 1.8 嵌合抗体在CHO-dhfr-细胞中的表达 |
| 1.9 表达蛋白的纯化 |
| 1.1 0 嵌合抗体特异性抗原结合活性及人源性的检测 |
| 1.1 1 嵌合抗体的Western blot分析 |
| 1.1 2 嵌合抗体对内皮细胞-单核细胞黏附率影响的检测 |
| 1.1 3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 各抗体基因扩增产物的鉴定 |
| 2.2 嵌合抗体真核表达质粒的鉴定 |
| 2.3 纯化的抗ICAM-1嵌合抗体的鉴定 |
| 2.3.1 抗体浓度 |
| 2.3.2 SDS-PAGE分析 |
| 2.3.3 抗体的特异性抗原结合活性及人源性 |
| 2.3.4 Western blot分析 |
| 2.3.5 嵌合抗体对内皮细胞-单核细胞黏附率的影响 |
| 3 讨论 |
（4）抗人T淋巴细胞CD4人-鼠嵌合抗体的真核表达（论文提纲范文）
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 质粒及细胞 |
| 1.2 主要试剂及仪器 |
| 1.3 引物设计及合成 |
| 1.4 嵌合抗体轻、重链基因真核表达质粒的鉴定 |
| 1.5 细胞转染及筛选 |
| 1.6 嵌合抗体在SP2/0细胞中表达的检测 |
| 1.6.1 双抗体夹心ELISA法: |
| 1.6.2 间接免疫荧光标记法: |
| 1.6.3 RT-PCR鉴定: |
| 1.6.4 DNA测序鉴定: |
| 2. 结果 |
| 2.1 嵌合抗体轻、重链基因真核表达质粒的鉴定 |
| 2.2 转染细胞的筛选 |
| 2.3 嵌合抗体在SP2/0细胞中的表达 |
| 2.3.1 双抗体夹心ELISA法及间接免疫荧光标记法检测: |
| 2.3.2 RT-PCR及测序鉴定: |
| 3. 讨论 |
（5）含前S的乙肝病毒表面抗原的纯化与分析（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 粗提液表达水平的测估 |
| 1.3 ELISA法测定表达产物和提取物的S、preS1和preS2 |
| 1.4 蛋白含量检测 (Lowry法) |
| 1.5 高效液相层析检测[2, 3] |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 表达水平的测估 |
| 2.1.1 ELISA法测定[4] |
| 2.1.2 免疫沉淀法测定[5] |
| 2.2 Sepharose CL-4B柱层析对表达产物的纯化 |
| 2.2.1 Sepharose CL-4B层析柱对目的蛋白的获取 |
| 2.2.2 Sepharose CL-4B层析各洗脱峰的相对抗原量的测定 (根据结果2.1.1计算方法计算) |
| 2.3 粗提物及回收峰的S、preS1和preS2抗原成分的检测 |
| 2.4 蛋白含量的测定 |
| 2.4.1 细胞上清液的蛋白含量测定 |
| 2.4.2 细胞上清处理液蛋白 (大约20倍浓缩) 含量测定 |
| 2.5 HPLC检测分析细胞上清液 |
| 2.5.1 TSK 3000 SW不锈钢柱高效液相层析检测 |
| 2.5.2 TSK 5 000 PW不锈钢柱高效液相层析检测 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
（6）CD86人—鼠嵌合抗体的构建、表达及其生物学活性的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 研究背景 |
| 第一部分 CD86人-鼠嵌合抗体的构建及表达 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 CD86人-鼠嵌合抗体生物学活性的研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 小结和展望 |
| 本研究所获的基金资助 |
| 研究生期间完成的论文 |
| 附录一 缩略词表 |
| 附录二 综述 |
| 致谢 |
（7）抗人肺癌单克隆抗体3D3的人源化及分子小型化研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 抗体及其临床应用 |
| 1.2 抗体人源化 |
| 1.3 抗体分子的小型化 |
| 1.4 小分子抗体的抗原结合能力的提高 |
| 1.5 抗人肺癌mA63D3 的临床应用前景 |
| 1.6 本文的研究目的和内容 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 mAb3D3 的重链可变区的人源化设计 |
| 2.2.2 四种小分子抗体基因的构建 |
| 2.2.3 表达载体的构建与转化 |
| 2.2.4 重组子的菌落PCR 筛选与序列分析 |
| 2.2.5 四种基因在大肠杆菌中的表达 |
| 2.2.6 目的蛋白的纯化与复性 |
| 2.2.7 dihu3D3VH 和tehu3D3VH 的聚合体形式的鉴定 |
| 2.2.8 小分子抗体的活性分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 人源化设计和hu3D3VH 的氨基酸译本的确定 |
| 3.2 四种基因的构建 |
| 3.3 表达载体的构建、菌落PCR 筛选与序列分析 |
| 3.4 四种基因在大肠杆菌中的表达 |
| 3.5 dihu3D3VH 和tehu3D3VH 的聚合体形式的鉴定 |
| 3.6 小分子抗体的活性分析 |
| 4 讨论 |
| 5 总结 |
| 6 参考文献 |
| 7 致谢 |
（8）猪瘟病毒E0基因在CHO细胞中的表达（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材 料 |
| 1.1.1 细胞、质粒: |
| 1.1.2 培养基及血清: |
| 1.2 方 法 |
| 1.2.1 重组表达载体的构建 |
| 2 结 果 |
| 2.1 重组表达质粒的鉴定 |
| 2.2 重组蛋白的表达 |
| 3 讨 论 |
（9）重组CHO细胞高效表达乙肝表面抗原的研究（论文提纲范文）
| 第一章 前言 |
| 1.1 HBsAg的分子生物学 |
| 1.2 乙肝表面抗原SP表达的研究 |
| 1.3 乙肝疫苗的发展 |
| 1.4 CHO细胞表达系统 |
| 1.5 立题背景 |
| 1.6 可行性分析 |
| 第二章 乙肝表面抗原(HBsAg)S基因的克隆及基因突变 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.1.2.1 生产细胞株C28基因组DNA的提取 |
| 2.1.2.2 S基因的PCR扩增 |
| 2.1.2.3 S基因PCR产物与T载体的连接与转化 |
| 2.1.2.4 质粒DNA的提取和回收 |
| 2.1.2.5 DNA酶切 |
| 2.1.2.6 S基因中稀有密码子的突变 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 细胞C28基因组DNA的提取 |
| 2.2.2 S基因的扩增 |
| 2.2.3 S基因与pMD 18T载体的连接，转化及鉴定 |
| 2.2.4 S基因的突变 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 表达载体的构建 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.1.2.1 dhfr基因的扩增 |
| 3.1.2.2 SV弱+dhfr基因的扩增 |
| 3.1.2.3 SV弱+neo基因的扩增 |
| 3.1.2.4 1 号表达载体的构建 |
| 3.1.2.5 3 号表达载体的构建 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 dhfr、SV弱+neo、SV弱+dhfr三个基因片段的扩增 |
| 3.2.2 表达载体的构建 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 重组CHO高产细胞株的构建及筛选 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.1.2.1 质粒的大量制备 |
| 4.1.2.2 CHO dhfr 细胞的培养 |
| 4.1.2.3 目的基因的导入 |
| 4.1.2.4 加压筛选 |
| 4.1.2.5 抗性细胞的单克隆筛选 |
| 4.1.2.6 单克隆的放大培养 |
| 4.1.2.7 单层细胞培养的分泌动态研究 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 附录 |
| 附图1. S基因测序图 |
| 附图2. Sm基因测序图 |
| 附图3. dhfr基因测序图 |
| 附图4. SV弱+dhfr基因测序图 |
| 附图5. SV弱+neo基因测序图 |
（10）破骨细胞分化因子哺乳类荧光蛋白融合表达载体的构建与序列鉴定（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 人ODF可溶性片段cDNA的PCR修饰扩增 |
| 1.4表达质粒的连接和转化 |
| 1.5 重组质粒的酶切鉴定 |
| 1.6 重组质粒的聚合酶链反应 (PCR) 鉴定 |
| 1.7 测序 |
| 2 结果 |
| 2.1 目的基因的PCR扩增结果 |
| 2.2 重组质粒的转化和酶切鉴定 |
| 2.3 重组质粒的PCR鉴定 |
| 2.4 重组质粒的测序结果 |
| 3 讨论 |
四、抗人P185~(erbB2)嵌合抗体在CHO细胞中的高效表达及其活性分析（论文参考文献）
- [1]重组抗c-Met嵌合抗体的构建及其利用慢病毒快速表达[J]. 张龙真,郭佳,顾华,房健民. 合肥工业大学学报(自然科学版), 2017(06)
- [2]抗人细胞间粘附分子-1嵌合抗体的制备及其生物学活性[J]. 孙红,张国利,岳玉环,张辉. 中国生物制品学杂志, 2014(07)
- [3]抗p185erbB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体的构建[J]. 刘芳,李力,张玮,王琪. 生物医学工程学杂志, 2013(02)
- [4]抗人T淋巴细胞CD4人-鼠嵌合抗体的真核表达[J]. 张雪,张爱华,闭兰,赵亚杰,孙可芳,方志正. 中国生物制品学杂志, 2009(10)
- [5]含前S的乙肝病毒表面抗原的纯化与分析[J]. 王德彬,颜华. 湖北农业科学, 2008(12)
- [6]CD86人—鼠嵌合抗体的构建、表达及其生物学活性的初步研究[D]. 胡玲玲. 苏州大学, 2008(11)
- [7]抗人肺癌单克隆抗体3D3的人源化及分子小型化研究[D]. 王阶平. 厦门大学, 2006(01)
- [8]猪瘟病毒E0基因在CHO细胞中的表达[J]. 陈振海,范学政,夏春,王琴,宋立,王在时,宁宜宝. 中国预防兽医学报, 2005(06)
- [9]重组CHO细胞高效表达乙肝表面抗原的研究[D]. 单连慧. 吉林大学, 2004(04)
- [10]破骨细胞分化因子哺乳类荧光蛋白融合表达载体的构建与序列鉴定[J]. 刘洋,臧晓怡,李兰英,郭善一. 天津医科大学学报, 2003(02)