一、Characterization of a calmodulin binding protein kinase from Arabidopsis thalian（论文文献综述）
杨晨[1]（2021）在《番茄BAG8和BAG9在响应温度胁迫中的作用》文中研究说明番茄（Solanum lycopersicum）属喜温园艺作物,具有食用和药用等价值。目前,我国设施番茄产业发展迅速,但也存在一系列问题,尤其是近年来极端低温和高温天气的频繁出现,严重影响着番茄产量和品质的提高。BAG（Bcl-2associated athanogene）是一类多功能伴侣调节蛋白,在植物中的研究相对较少且主要集中于拟南芥（Arabidopsis thaliana）,被报道广泛参与调控生长发育和盐、干旱等胁迫响应途径,但在番茄中响应温度的作用机理还鲜为人知。本文鉴定了番茄的10个BAG基因,利用生物信息学手段进行了系统进化、蛋白功能和转录调控分析;以番茄为实验材料,筛选出了响应温度胁迫的主效基因BAG8和BAG9,利用生理学与分子技术探究了二者在胁迫应答中的功能;明确了BAG8、BAG9的定位和互作蛋白,并对二者的生物学功能进行了初步鉴定。主要研究结果如下:1.鉴定了番茄的10个BAG基因,明确了BAG家族广泛参与番茄响应非生物胁迫的过程。根据与拟南芥的同源性和进化关系,将鉴定出的10个BAG基因命名为Sl BAG1～10。构建了番茄、拟南芥、水稻和烟草的系统进化树并进行了氨基酸序列分析,发现Sl BAGs主要包含保守BAG结构域、类泛素UBL结构域和钙调蛋白Ca M结合基序。进一步预测分析蛋白信息和结构,发现大多数BAG均由300～400个氨基酸组成,且蛋白间所含的结构域类型及数量存在差异。转录调控分析发现BAG8基因启动子的反义链中含有低温应激反应元件,BAG9基因中含有热休克反应元件。以上结果表明,番茄BAG家族成员具有丰富的蛋白结构和生物学功能,可能通过多种途径广泛参与到非生物胁迫的应答过程中,特别是BAG8和BAG9可能在抵抗温度胁迫方面发挥了重要作用。2.筛选了番茄BAG家族在响应低温胁迫中的主效基因BAG8和BAG9,明确了二者对低温抗性的正向调控作用。对野生型番茄进行低温处理,发现有6个基因上调,其中BAG8和BAG9上调最显着;通过病毒诱导的基因沉默（VIGS）技术构建了所有上调基因的沉默材料并进行低温处理,发现BAG8和BAG9沉默材料表现出明显的抗性减弱,关键冷害响应基因CBF1的表达受到显着抑制;净光合速率（Pn）、气孔导度（Gs）和蒸腾速率（Gr）显着降低;抗氧化酶关键基因的表达量显着降低、酶活性的升高受到抑制;自噬体数目明显减少,自噬关键基因ATG8a的表达受到抑制;泛素化蛋白积累增多。以上结果表明,低温胁迫后番茄BAG8和BAG9发挥了主要作用,二者可能参与CBF正调控抗冷途径,还可能在维持光合作用的正常运行和抗氧化防御机制稳态、影响自噬体形成以及在减缓低温胁迫诱导的蛋白泛素化积累中发挥作用,进而正调控番茄的低温抗性。3.明确了番茄BAG家族在响应高温胁迫中的表达水平和BAG8、BAG9对高温抗性的正向调控作用。在高温处理的野生型番茄中,BAG6、BAG8和BAG9的表达量与常温相比显着上调,表明BAG6、BAG8和BAG9可能在番茄参与响应高温胁迫中起作用。为进一步完善对BAG8和BAG9响应温度胁迫的作用研究,通过VIGS技术构建了二者的沉默材料。高温处理后,BAG8和BAG9沉默材料与对照相比表现出明显的热敏性;Pn、Gs和Gr显着降低;自噬体数目明显减少;总蛋白泛素化水平显着提高。这些结果表明,BAG8和BAG9正调控番茄的高温抗性,二者可能在维持植株正常光合作用、影响自噬体形成和减缓高温胁迫诱导的蛋白泛素化积累中发挥作用。4.明确了番茄中BAG8和BAG9的定位,筛选并验证了与二者互作的蛋白,初步鉴定了BAG8和BAG9的生物学功能。亚细胞定位表明,BAG8和BAG9均位于细胞核和细胞质。酵母筛库筛选出可能参与响应温度胁迫的互作蛋白有钙调蛋白（Ca M1～6）、铁硫蛋白（PGR1、Fd C1、Fd2）和小分子热休克蛋白（HSP17.7A、HSP17.7B、HSP17.6B、HSP17.6C）。酵母双杂交和Bi FC表明,BAG8与PGR1、Ca M2～4在细胞质中互作,BAG9与PGR1、Fd C1、Fd2、Ca M2～4在细胞核和细胞质中互作。进一步验证表明,BAG8、BAG9均与包含HSP17.7A、HSP17.7B、HSP17.6B、HSP17.6C的小分子热休克蛋白HSP20家族互作。以上结果表明,温度胁迫下BAG8、BAG9可能通过与钙调蛋白、铁硫蛋白或小分子热休克蛋白结合正调控番茄对温度胁迫的抗性,但具体作用机制还有待深入探究。
李建鑫[2]（2021）在《番茄钙依赖蛋白激酶CPK28在植物响应高温胁迫中的功能及机制研究》文中认为在全球气候变暖大背景下,气温不断升高并伴随着频繁的高温天气。我国是设施面积最大的国家,半封闭的设施环境内更容易形成高温环境。番茄是我国极为重要的园艺作物和设施主栽培作物,高温胁迫严重危害了我国番茄的品质和制约了番茄产业的高效周年生产。因此探索高温胁迫下番茄内在的调控机制,挖掘植物响应高温的分子机制,从而基于植物的高温性状来创新抗性技术,对我国蔬菜产业健康稳定的发展具有十分重要的意义。Ca2+作为一种普遍存在的第二信使调节着植物的胁迫信号机制,在植物响应高温胁迫中发挥重要作用。钙依赖性蛋白激酶CPK是一种重要的钙传感蛋白,可以传递钙信号,并将其转化为下游蛋白质磷酸化事件。近年来,越来越多的研究证实CPK在非生物逆境中发挥的作用,然而CPK在植物高温抗性中的作用及其分子调控机制尚不明确。本文以番茄为研究材料,利用植物生理学、遗传学、分子生物学等技术手段,研究了CPK28在番茄响应高温胁迫中发挥的作用并明确了CPK28突变对植物抗氧化系统的影响,进一步阐明了CPK28通过磷酸化APX2的Thr-59和Thr-164位点调控植物高温抗性的内在分子机制。所得主要结果如下:1、明确了CPK28在番茄响应高温胁迫中的正调控作用。我们利用CRISPR-Cas9技术构建了CPK28基因功能缺失突变体cpk28#36和cpk28#44,发现cpk28高温抗性显着降低,表现为高温处理后更加萎蔫的叶片,叶片电解质渗透率升高,膜脂质过氧化物MDA的含量上升。2、发现了CPK28增强番茄植株高温响应中的抗氧化能力。高温处理能够导致叶片中氧化物质积累蛋白氧化等多种氧化胁迫,使得多种抗氧化酶的活性被激活。我们发现了cpk28突变体细胞内氧化物质O2.-、H2O2的积累量显着增多,ROS清除蛋白2-CP单体含量显着减少,同时APX表达量减少,CAT、APX、DHAR、GR等抗氧化酶活性被抑制,且GSH/GSSG及As A/DHA的比率显着降低。其次我们发现常温条件下cpk28中APX活性和As A/DHA比值也受到抑制,我们通过外源As A处理有效提高了cpk28的高温抗性,提高了高温下As A/DHA的比值。这些结果表明,CPK28通过影响抗氧化酶活性和As A/DHA的水平来参与对植物氧化还原系统的调控,进而影响高温胁迫下植物氧化物质的积累和蛋白质的变性。3、鉴定到CPK28互作靶蛋白APX2并明确其同样正调控番茄高温抗性。通过荧光素酶互补试验和免疫共沉淀Co-IP试验发现CPK28与APX2存在互作,并发现Ca2+诱导CPK28与APX2的互作增强,而钙离子螯合剂EGTA则抑制了CPK28与APX2的互作。进一步,我们构建了apx2,发现APX2同样正调控番茄高温抗性,apx2在高温胁迫下高温抗性降低,光化学效率降低,同时APX活性降低。4、明确了CPK28通过磷酸化APX2的Thr-59和Thr-169影响了APX的活性和植物的高温抗性。CPK28作为蛋白激酶可以磷酸化APX2并激活APX2的活性,且磷酸化受到Ca2+的正向调控。其中APX2的Thr-59和Thr-164残基被CPK28磷酸化,失活型磷酸化位点突变阻断了CPK28的磷酸化,在烟草和番茄中,失活型磷酸化位点不仅削弱了植株的高温抗性,同时降低了APX的活性。以上结果表明,Ca2+介导了CPK28磷酸化APX2,CPK28可能通过磷酸化APX2两个Thr-59和Thr-164残基位点来调控APX2的活性,进而参与调控番茄的氧化还原稳态,提高番茄的高温抗性。
张小花[3]（2021）在《外源独脚金内酯对黄瓜盐胁迫耐受性的影响》文中认为环境胁迫可以抑制种子萌发、延缓植株生长、加速衰老,甚至导致植株死亡。盐胁迫是严重制约农业生产的环境胁迫因子。植物通过多种生化和分子机制对盐胁迫作出响应,这些机制包括调节离子吸收和积累,缓解膜脂损伤,维持渗透平衡,增强光合作用和氧化酶（抗氧化酶和非抗氧化酶）的活性,改变抗盐基因的表达,强化植物盐胁迫耐受性。此外,植物激素（生长素、乙烯、茉莉酸、赤霉酸和脱落酸等）水平或其它信号分子（过氧化氢和钙离子）感知和转导也可调整植物生长策略,从而适应盐胁迫。黄瓜是一种重要的蔬菜作物,而盐碱地种植的黄瓜产量明显受到限制。因此,耐盐机制的研究对盐胁迫下黄瓜幼苗的增产具有理论指导意义。独脚金内酯（Strigolactones/SLs）是从植物根系分泌物中分离得到的一类类胡萝卜素类萜类内酯,能够参与植物的生长发育和非生物胁迫的防御应答,但是目前关于SLs介导植物对盐胁迫反应的分子机制研究还不系统,参与SLs调节植物盐胁迫响应过程的信号途径和信号分子的研究比较少。本研究以“景润35号”黄瓜品种为实验材料,对盐胁迫下黄瓜幼苗叶片喷施GR24（SLs类似物）,研究外源GR24对黄瓜幼苗生长表型、渗透调节、膜脂损伤、离子含量、光合作用、气孔开度、氧化防御能力和抗逆基因表达水平的影响,并利用转录组（RNA-Seq）分析了外源GR24对黄瓜幼苗耐盐性基因和代谢通路的影响。此外,还通过加入NADP氧化酶抑制剂DPI、H2O2清除剂DMTU、Ca2+螯合剂EGTA和Ca2+通道抑制剂La Cl3探究信号分子H2O2和Ca2+是否参与调控黄瓜幼苗耐盐性。从生理生化和基因水平分析SLs诱导黄瓜幼苗耐盐性的机制,为SLs缓解盐胁迫的抗逆机制提供新的见解。主要结果如下:（1）与单独盐胁迫相比,外源GR24预处理下黄瓜幼苗中生长受到明显抑制,MDA、ASA和GSH含量显着上升,GSSG含量和GSH/GSSG比值明显下降,表明外源GR24可通过影响ASA-GSH循环缓解盐胁迫,降低膜损伤,提高耐盐性。此外,盐胁迫导致黄瓜幼苗气孔开度减小,总叶绿素含量、叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量、RWC、Tr、Gs、Pn、Ci、Pn、Fv′/Fm′、ETR、Y（II）、q P、q L和Fv/Fm均降低,NPQ、Y（NPQ）及qN均升高。GR24预处理缓解盐胁迫造成的光合速率的下降,气孔开度增强,叶绿素含量、叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量以及RWC、Tr、Gs、Pn、Ci、Pn、Fv′/Fm′、ETR、Y（II）、q P、q L和Fv/Fm均升高,NPQ、Y（NPQ）及qN均显着升高,而DPI和DMTU抑制了GR24对盐胁迫下黄瓜幼苗光合作用的缓解作用。表明外源GR24提高了盐胁迫下黄瓜幼苗渗透调节、气体交换参数和光和参数,增强了黄瓜幼苗的光合作用,且H2O2参与了该过程。（2）盐胁迫造成膜损伤,离子失衡,渗透胁迫和氧化应激,而外源GR24预处理缓解了盐胁迫下黄瓜幼苗膜损伤,增强渗透调节,维持离子稳态,提高ROS清除能力,增强了抗氧化酶的活性和抗逆基因的表达。qRT-PCR分析发现,外源GR24诱导抗氧化酶基因（CsCAT、CsSOD、CsPOD和CsAPX）、NADPH基因（CsRBOHA-F）、MAPK基因（Cs MAPK3、CsMAPK4和CsMAPK6）、SOS基因（CsSOS1、CsSOS2和CsSOS3）和CDPK相关基因（CsCDPK1-6、CsCDPK10-14和CsCDPK16-19）在响应盐胁迫中基因的表达水平发生了显着变化。此外,DPI、DMTU、EGTA和LaCl3的施用抑制了外源GR24对黄瓜耐盐性的提高,表明信号分子Ca2+和H2O2介导黄瓜幼苗中的盐胁迫信号转导。（3）RNA-Seq测序分析发现,CK（对照）vsD（NaCl）、CKvsLD（GR24+NaCl）、和DvsLD中分别有10726个、7072个和1678个差异表达基因（DEGs）。GO功能注释表明,DEGs主要富集在代谢过程、细胞过程、生物调节以及刺激应答、信号传导、膜和抗氧化等过程。KEGG富集分析表明,DEGs主要富集在淀粉、蔗糖代谢、碳代谢、光合作用、光合生物中的碳固定、植物激素信号转导等。其中DvsLD中DEGs主要包括光合作用、过氧化、谷胱甘肽代谢、Ca2+信号转导和MAPK级联信号途径的相关蛋白和代谢物以及刺激其它植物激素（IAA、赤霉素、BRs、ABA等）信号转导增强耐盐性的相关蛋白和转录因子。此外,部分DEGs也参与了盐胁迫的代谢过程,包括糖酵解、碳水化合物代谢、TCA循环和次级代谢途径。
李鲁申[4]（2021）在《拟南芥钙调蛋白结合蛋白60b调控植物免疫的机理研究》文中研究指明免疫系统对于不能主动移动的植物来说至关重要。在植物与病原菌的互作中,植物有两种策略来感知并响应病原菌。首先是在植物细胞表面分布着一类由类受体激酶（Receptor-like kinases,RLKs）和类受体蛋白（Receptor-like proteins,RLPs）组成的病原菌模式识别受体（Pattern recognition receptors,PRRs）,它们可以感知病原菌表面的一些特定分子,即病原菌/微生物相关的分子模式（Pathogen/Microbe-associated molecular patterns,PAMPs/MAMPs）,进而触发PAMP引起的免疫（PAMP-triggered immunity,PTI）。为了对抗植物的PTI,病原菌会释放效应因子攻击破坏植物的免疫系统。而植物的胞内受体抗性蛋白,即R蛋白（Resistance protein）,则会通过直接或者间接的方式感知这些进入细胞的效应因子,触发效应因子引起的免疫（Effector-triggered immunity,ETI）。当植物的免疫系统被激活后,会引发一系列的事件,包括磷酸化类受体胞内激酶（Receptor-like cytoplasmic kinases,RLCKs）、钙离子(Ca2+)内流、活性氧爆发、激活丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase,MAPK）级联反应等等。其中,免疫响应引起的转录重编程（Transcriptional reprogramming）是一个重要过程,大量的免疫响应基因被激活进而对抗病原菌的入侵。转录因子钙调蛋白结合蛋白60（Calmodulin binding protein 60,CBP60）家族成员CBP60g和SARD1（SAR deficient 1）是目前已知的在免疫响应时发挥主要转录功能的转录因子,它们功能冗余地激活ETI途径、PTI途径、水杨酸（Salicylic acid,SA）途径、系统获得抗性（Systemic acquired resistance,SAR）途径免疫基因的表达。该家族的另一个成员CBP60a被报道能够负调控免疫。然而,CBP60家族其它五个保守性高的成员,即CBP60b-f的功能尚未被解析。本研究中,我们从这五个基因的表达模式入手,发现CBP60b组成型高量表达。随后通过实时荧光定量PCR、LUC转录激活、Ch IP-PCR等技术,结合大量的遗传实验表明CBP60b在植物免疫中发挥核心作用。主要结果和结论如下:（1）CBP60b组成型高量表达在本研究中,我们首先通过对CBP60家族其它五个成员的表达模式进行分析,通过对CBP60b-f genomic-GUS转基因植株的GUS组织化学染色,我们发现CBP60b是组成型的高量表达,特别在茎尖和根尖部位;而CBP60c-f仅在某些组织中有少量的表达。这表明在这五个基因中,CBP60b可能在植物发育中发挥功能。（2）CBP60b突变导致植物发育缺陷并且组成型激活免疫响应接下来,我们对它们的突变体进行分析。cbp60b单突表现出严重的发育缺陷,包括叶片卷曲畸形,茎尖分生组织（Shoot apical meristem,SAM）不能维持,生长素异常分布和积累等;而cbp60c;d;e;f四突的发育与野生型没有差异。对cbp60b突变体的进一步分析表明cbp60b是自免疫突变体:植物体内的SA积累增加、免疫响应基因组成型高量表达、叶片中过氧化氢（H2O2）以及细胞程序性死亡（Programmed cell death,PCD）增多、对病原菌的抗性增加等。（3）CBP60b作为转录激活因子正调控免疫我们发现CBP60b定位于细胞核中,且在转录水平和蛋白水平均受病原菌诱导。通过Ch IP-PCR和LUC激活实验,我们发现CBP60b可以结合DNA基序G（A/T）AATT（T/G）,激活免疫基因表达,而这些免疫基因同样是CBP60g和SARD1的下游靶基因。我们还定义了CBP60b蛋白的转录激活区。这些结果表明CBP60b作为转录激活因子正调控免疫。过表达CBP60b同样会导致植物免疫响应组成型激活,进一步表明CBP60b正调控免疫。另外,我们还证明CBP60b的DNA结合结构域和Ca M结合结构域对其功能是必需的。（4）R蛋白监控CBP60b或者其所在的途径CBP60b正调控免疫不能解释cbp60b所表现的自免疫表型。于是我们推测CBP60b可能受R蛋白监控,cbp60b的自免疫表型是由于R蛋白组成型激活所致。为了验证这一假设,我们在cbp60b中引入EDS1（Enhanced disease susceptibility 1）、PAD4（Phytoalexin deficient 4）或NDR1（Non-race-specific disease resistance 1）的突变体,发现cbp60b;eds1、cbp60b;pad4或者cbp60b;ndr1可以完全恢复或者显着恢复cbp60b的表型,这些结果表明CBP60b或者它所在的信号途径同时受到TNL型以及CNL型R蛋白的监控。进一步,我们发现TNL型R蛋白SNC1（Suppressor of npr1-1,constitutive 1）突变可以部分恢复cbp60b的表型,表明SNC1是监控CBP60b的R蛋白之一。（5）CBP60b与CBP60g/SARD1功能冗余又有差异CBP60b与CBP60g/SARD1都能调控相同的下游基因,暗示其存在功能冗余。将cbp60g;sard1引入cbp60b中后,我们发现三突的自免疫表型显着加重,支持三者的功能冗余性。然而,cbp60g;sard1却没有表现出自免疫表型。通过检测它们的表达量,我们发现正常发育的植株中CBP60b的表达量远远高于CBP60g和SARD1,这可能可以解释cbp60b表现出严重的自免疫表型,而cbp60g;sard1发育正常的原因。然而我们利用CBP60b的启动子分别驱动CBP60g和SARD1回补cbp60b,发现它们并没有恢复cbp60b的自免疫表型,表明它们存在功能差异。有意思的是,我们发现CBP60b可以直接结合到CBP60g和SARD1的启动子激活它们的表达。这是目前发现的唯一能够同时结合到CBP60g和SARD1的启动子调控它们表达的转录因子。综上,CBP60b作为免疫转录调控中核心的转录因子,既在植物发育时维持免疫基因表达,又在病原菌入侵时进一步激活免疫基因表达,使植物成功抵抗病原菌的入侵。
冷艳[5]（2021）在《绿豆幼苗响应镉胁迫的分子机制研究》文中提出镉（Cd）是一种能够对植物产生严重损伤的重金属,植物可通过一系列的响应机制应对Cd胁迫产生的毒害作用,目前关于植物响应Cd胁迫的生理生化机制的研究较为普遍,而胁迫响应的分子机制还不清楚。本研究利用RNA-Seq技术,以绿豆为研究材料,以土壤污染最为普遍、最为严重且毒性最强的重金属Cd为研究对象,研究植物根、茎、叶响应重金属的分子机制。主要结果如下:1.对100μM的Cd Cl2处理下绿豆幼苗的形态指标进行了分析,结果显示,Cd胁迫在5 d、9 d显着抑制了绿豆幼苗植物地上部分和根的生长,株高分别降低了25.3%和27.5%,主根长分别降低了20.7%和23.4%,侧根数分别降低了14.5%和34.9%,地上部分鲜重分别降低了23.2%和42.6%,根鲜重分别降低了10.8%和57.1%,同时引起根部畸变、严重褐化,表明Cd胁迫可显着影响绿豆幼苗的生长发育,导致植株矮小,根系发育受阻。Cd含量测定结果显示,绿豆根中Cd含量为283.17 mg/kg,茎叶中的Cd总含量为18.37 mg/kg,表明绿豆根是积累重金属Cd的主要场所。2.对Cd胁迫处理1 d、5 d、9 d的根、茎、叶通过转录组分析。从根中共鉴定到13055个差异表达基因（DEGs）,GO富集分析表明,上调的DEGs主要富集在细胞识别、解毒、次生代谢过程、谷胱甘肽代谢过程、胁迫响应、毒素分解过程等GO功能中,下调的DEGs主要富集在细胞壁组织合成、微管过程、膜锚定构件、质膜锚定成分、膜固有成分等GO功能中。从茎鉴定到8189个DEGs,上调的DEGs主要富集在细胞识别、解毒、毒素分解过程、次级代谢过程、类黄酮代谢过程等GO功能中,下调的DEGs主要富集在细胞壁多糖代谢过程、细胞壁组织或生物发生、多糖代谢过程、膜固有成分、膜组成部分等GO功能中。从叶中共鉴定到6705个DEGs,上调的DEGs主要富集在氧化还原过程、内肽酶活性的调节、核酸模板转录的调控等GO功能中,下调的DEGs主要富集在微管运动、叶绿体类囊体膜、光合作用膜等GO功能中。3.对DEGs（TPM≥10,fold change≥2）进行分析,从根中获得7413个DEGs,主要归为转录因子、信号物质、防御系统、细胞分裂、细胞壁、载体蛋白相关基因,表明这些基因在根响应Cd胁迫中发挥重要作用。从茎中获得3838个DEGs,其中大量的载体蛋白编码基因显着上调,表明其参与茎对Cd胁迫的响应;谷胱甘肽转移酶（GST）和过氧化物酶（POD）编码基因是茎响应胁迫的关键基因;次级代谢途径黄酮类生物合成、类苯基丙烷生物合成、莨菪碱、哌啶和吡啶生物碱的生物合成、异喹啉生物碱生物合成途径在茎响应Cd胁迫中也起最重要作用。从叶中获得2959个DEGs,其中大量蛋白质合成和修饰相关蛋白编码基因显着上调,Cd胁迫导致光反应系统蛋白编码基因和CO2固定酶编码基因显着下调,并发现乙醛酸循环途径的关键酶异柠檬酸裂合酶和苹果酸合酶的编码基因差异表达倍数高达1024以上,表明Cd胁迫严重影响植物光合作用,乙醛酸循环在绿豆叶对镉胁迫的响应中发挥重要作用。4.以肽基脯氨酰顺反异构酶（peptidyl-prolyl cis-trans isomerase）基因FKBP20-1为内参基因,用q RT-PCR法对水通道蛋白的编码基因TIP、非特异性脂质转运蛋白的编码基因SCP1、质膜阳离子结合蛋白的编码基因PCAP1、富含脯氨酸的细胞壁蛋白的编码基因PRP1、液泡加工酶的编码基因VPE、转录因子的编码基因MYB24、脱落酸受体的编码基因PYL4、生长素响应蛋白的编码基因IAA14共8个已知编码蛋白的基因进一步分析。结果表明,q RT-PCR与转录组数据结果具有显着一致性（R2>0.87）。TIP和PYL4的表达在根、茎、叶中均显着性下调。MYB24的表达在根、茎、叶中均显着性上调,SCP1的表达在根中差异表达不显着,在茎和叶中均显着性上调。PRP1的表达在根和茎中稳定上调,在叶中先上调后下调。IAA14的表达在根和茎中稳定下调,在叶中先下调后上调。VPE和PCAP1的表达在不同器官中、不同胁迫时期有各自的调控模式。
黄聪聪[6]（2020）在《拟南芥钙离子依赖蛋白激酶CPK5/6磷酸化几丁质受体调控免疫反应的研究》文中研究指明植物病害是人类面对的一个严峻的挑战,严重影响粮食产量以及人类的健康。利用植物自身的抗性基因抵抗病原菌的入侵,不仅可以保护植物自身,更可以减少农药的使用从而有利于保护环境。几丁质作为真菌细胞壁的主要成分之一,是一种典型的微生物相关的分子模式。在拟南芥中,几丁质被位于细胞膜上的两个Lys M受体—CERK1和LYK5识别,从而激发植物的免疫反应。前期的研究表明LYK5的功能主要是识别几丁质,CERK1主要通过胞内激酶传递免疫信号。LYK5的胞内结构域是一个假激酶,但在几丁质引起的免疫信号传递中不可缺少。为了研究LYK5胞内结构域在几丁质引起的免疫信号通路中的功能,我们开展了如下研究:1. 在拟南芥中过表达LYK5-Myc融合蛋白,并筛选稳定表达的LYK5-Myc转基因株系。使用几丁质处理前处前和处理后的LYK5-Myc转基因拟南芥幼苗进行蛋白亲和纯化,纯化出的LYK5受体复合体应用于蛋白组分析,鉴定到48个可能与LYK5互作的蛋白;2. 钙离子依赖的蛋白激酶CPK5和CPK6是LYK5蛋白复合物中两个组分。我们使用双分子荧光互补试验（Bi FC）验证了CPK5和CPK6与LYK5互作,使用Bi FC试验进一步验证了CPK5和CPK6与几丁质的受体CERK1,LYK5和LYK4互作。体内免疫共沉淀实验表明几丁质处理增强了CPK5与LYK5互作,这些实验表明CPK5和CPK6都能与几丁质受体CERK1和LYK5互作;3. 在拟南芥cpk5突变体和cpk5/6双突变体中,我们使用几丁质处理检测了植物防御反应的生理生化特征。结果表明在cpk5突变体和cpk5/6双突变体中,几丁质诱导的WRKY33和NHL10早期防御相关基因的表达、胼胝体沉淀、活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）产生以及MPK3/MPK6磷酸化水平显着低于比野生型拟南芥,这表明CPK5和CPK6是几丁质信号通路中的关键组分;4. 由于CPK5/6与几丁质受体CERK1和LYK5都属于蛋白激酶。我们使用体外磷酸化方法验证了二者之间的相互磷酸化关系。结果表明CPK5和CPK6能够磷酸化LYK5和LYK4的胞内结构域,然而CPK5与CERK1之间并没有检测到相互磷酸化反应;通过蛋白质谱分析体外磷酸化的LYK5胞内域,鉴定到LYK5胞内域第323位丝氨酸残基和第542位丝氨酸残基是CPK5磷酸化LYK5的位点;在体外磷酸化实验中,323位丝氨酸和542位丝氨酸的突变都抑制了CPK5磷酸化LYK5的信号强度,这表明323位和542位丝氨酸残基是LYK5被CPK5磷酸化的主要位点;5. 我们将LYK5第542位丝氨酸突变成突变丙氨酸,并将LYK5S542A转化进lyk5-2突变体中进行功能互补分析。我们使用几丁质处理后发现下游防御相关基因WRKY53的诱导以及MAPK级联通路的激活均受到影响,这近一步说明S542位点在几丁质信号传导通路中起重要作用。6. 我们将CPK5在野生型拟南芥中进行过量表达研究。在转基因植株中,我们发现使用几丁质处理能够诱导CERK1进行降解,同时CPK5过表达的转基因株系中CERK1的转录水平比野生型高,这表明CPK5在CERK1蛋白稳定性中起正调控作用以上研究表明,几丁质促进CPK5与LYK5和CERK1互作,并且磷酸化LYK5以及增加CERK1的蛋白水平从而增强几丁质诱导的免疫反应。以上结果对于解析几丁质受体传递免疫信号的分子机制具有潜在的意义,为提高植物对于病原菌的抗性具有理论指导。
魏丽茵[7]（2020）在《拟南芥IQM基因家族多突变体构建及其表型分析》文中研究表明IQM家族由6位成员组成,从IQM1到IQM6,是不依赖Ca2+的钙调素结合蛋白（Ca MBP）。近年来,本研究组专门对IQM家族基因的功能进行了深入研究。不过,由于缺乏相应突变体而未能对该家族多基因同时突变所产生的生长发育改变进行研究。因此,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建IQM家族多基因突变体,并进行初步表型分析,得到以下主要结果:1分别在IQM家族6个成员的基因组上设计靶点接头,通过同源重组构建成相应小载体sg RNA表达盒:Laz At U3d-At U3b-At U3d-At U3b-At U6-1-At U6-29,并整合成p YLCRISPR/Cas9Pubi-N表达载体后转入野生型拟南芥Col-0。经抗生素抗性筛选,共获得70株T0代植株。最后经过编辑靶点测序,得到1个IQM1～IQM4的四突变体株系iqm（1,2,3,4）-1。2对四突变体iqm（1,2,3,4）-1进行了初步表型分析及相关的基因表达分析的主要结果如下:1)缺糖胁迫对种子萌发的影响:在1/2MS培养基上,iqm（1,2,3,4）-1与Col的萌发无显着性差异;在无糖1/2MS培养基上,从第2天至第7天均显示iqm（1,2,3,4）-1比Col的种子萌发率高,推测iqm（1,2,3,4）-1的种子萌发对缺糖比Col更不敏感;在无维生素B5(VB5)的1/2MS培养基上,iqm（1,2,3,4）-1对比Col的萌发无显着性差异。2)缺糖胁迫对根长的影响:在1/2MS培养基上,iqm（1,2,3,4）-1的平均根长较Col短一些,且在第4、第5天有显着性差异;而在无糖垂直培养基中,iqm（1,2,3,4）-1的平均根长与Col较为相近,无显着性差异,说明iqm（1,2,3,4）-1的根生长对缺糖不敏感。3)多效唑对种子萌发的影响:多效唑（PAC）是植物赤霉素（GA）合成的抑制剂。在1/2MS培养基添加PAC,抑制iqm（1,2,3,4）-1和Col的萌发,且四突变体的萌发率显着低于野生型;在1/2MS培养基添加PAC和GA3,Col的萌发率基本恢复成其在1/2MS培养基上的萌发率,但是iqm（1,2,3,4）-1的萌发率却不能完全恢复,说明其对GA的减少与增加非常敏感。分别观察4个相关的单突变体在上述两种处理中的表型,只有iqm3-2呈现出与四突变体一致的表型,说明iqm（1,2,3,4）-1和iqm3-2对GA含量减少或增加的敏感性相似,推测四突变体的这些表型决定于IQM3基因的突变。4)赤霉素合成与反应关键基因的表达分析:以Actin2为内参基因,对从萌动种子提取的RNA的反转录产物进行q PCR定量分析。结果表明,在iqm（1,2,3,4）-1与iqm3-2中,GA合成关键基因GA20ox1和GA2ox1的表达均下调;GA受体基因GID1a和GID1b、GA反应的关键基因家族Dellas（GAI、RGA、RGL1、RGL2、RGL3）、与Della降解相关的F-box蛋白基因SPY的表达均不同程度上调;其他3个相关单突变体中这些基因的表达均不与前二者一致。以上结果说明,在GA调控种子萌发信号通路中IQM3可能位于IQM1、IQM2、IQM4的下游,进一步印证iqm（1,2,3,4）-1的种子萌发表型可能主要是由IQM3突变决定的结果。5)成花表型分析:观察统计了长日照和短日照条件下的开花时间和开花时的莲座叶数量,结果表明,与Col相比,四突变体iqm（1,2,3,4）-1在长日照条件下开花推迟,莲座叶增多。总之,通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了IQM基因家族的四突变体iqm（1,2,3,4）-1,这为进一步研究IQM家族基因功能提供了新材料;通过表型和基因表达分析,发现四突变体在PAC处理下的种子萌发表型可能决定于IQM3基因的突变,提示在赤霉素调控种子萌发的信号通路中,IQM3可能活动在IQM1、IQM2、IQM4的下游。
杨菊[8]（2020）在《拟南芥、羊草根响应低Ca2+环境的生理、细胞和分子机制研究》文中提出钙(Ca2+)是植物体生长发育必需的矿质营养元素,参与组成细胞壁及细胞膜的结构;同时又是细胞内的重要第二信使,参与各类外界环境刺激诱导的信号通路。但近年来的生态证据表明,酸雨等使得土壤表面植物可利用的Ca2+含量减少,植物生理性缺Ca2+现象普遍存在,而缺Ca2+会导致植物多样性下降、植物对外界环境压力的适应能力下降。但是缺Ca2+导致植物出现这些现象的生理、细胞和分子机制未知。本文首次对低Ca2+环境下拟南芥及羊草根细胞中的胞吞反应及细胞膜脂质代谢进行了研究,并将拟南芥及羊草根细胞中的脂质分子进行详细比较,深入分析了二者响应低Ca2+环境的生理、细胞和分子机制。本研究希望帮助人们了解Ca2+在维持植物细胞膜稳定性及选择性过程中的重要作用,并期望从细胞分子层面为拟南芥和羊草对低Ca2+环境响应的差异性提出科学的解释。具体的实验结果如下:1.低Ca2+特异性诱导拟南芥根细胞中胞吞增多。CK(1 mM Ca2+)及其他缺素(缺Mg2+、缺Zn2+、缺Fe2+、缺Mn2+、缺N、缺P以及缺K)处理下拟南芥根细胞中无胞吞发生,仅缺Ca2+会诱导拟南芥根细胞中胞吞增多;且这种胞吞的发生途径是相对保守的,主要包括细胞质膜的内陷、早期囊泡的形成、囊泡脱离细胞质膜进入细胞内、多囊泡的聚合、最后是囊泡与液泡的相互融合。2.低Ca2+诱导拟南芥根细胞中的胞吞是一个基于非选择性液相流动的过程。膜不通透性荧光染料Alexa Fluor 488能够随着胞吞反应进入细胞,表明低Ca2+处理使得拟南芥根细胞膜选择性降低;低Ca2+诱导拟南芥根细胞中发生的胞吞对受体介导的胞吞反应抑制剂Tyr A23不敏感,说明其不受受体介导。低Ca2+诱导拟南芥根细胞中发生的胞吞对Ca2+内流信号转导通路抑制剂GdCl3不敏感,但对钙调蛋白拮抗剂W7敏感;低Ca2+诱导拟南芥根细胞中发生的胞吞对IP3K的抑制剂Wortmannin不敏感,但对IP3信号转导通路抑制剂Neomycin敏感。3.低Ca2+显着改变拟南芥根细胞膜脂质分子的合成及代谢。通过对拟南芥根脂质组学中15类、379种脂质分子数据分析,发现低Ca2+诱导拟南芥根细胞中的PC、PE、PI、TAG、LPC、LPE含量显着增多,PA、DAG含量显着减少,且PC/PE的比值显着升高。这些结果均被认为是拟南芥根细胞在受到低Ca2+胁迫时,为了维持细胞膜结构稳定及膜脂平衡所采取的一系列举措。4.羊草幼苗不具有Ca2+依赖性生长的表型,且羊草根细胞中胞吞是一种不受受体介导的具有选择性的细胞反应,不受低Ca2+环境的影响。本文研究发现羊草幼苗在不同Ca2+浓度培养基上生长状态基本一致,不受外界Ca2+环境的影响,但植物体内Ca含量的积累依赖于外界Ca2+浓度。细胞生物学研究发现CK条件下羊草根细胞中就有丰富的胞吞反应,且这种胞吞具有选择性,同样不受低Ca2+环境的影响。羊草根细胞胞吞反应同样不受受体介导,同样对Ca2+内流信号转导通路抑制剂GdCl3不敏感,但对钙调蛋白拮抗剂W7敏感。随后实验证明沙生冰草和老芒麦的根细胞具有和羊草一致的胞吞反应,且同样不受低Ca2+影响。5.低Ca2+对羊草根细胞膜脂质分子的合成及代谢无显着影响。通过对羊草根脂质组学16类、352种脂质分子数据分析,发现低Ca2+仅诱导羊草根细胞中的FFA含量升高,但对其他的脂类物质的影响较小,其中低Ca2+处理后含量发生显着变化的脂质分子数量仅为43个,且PC/PE的比值也未发生显着变化。使用4种FFA药物处理羊草幼苗,其中FFA18:0和FFA18:1会抑制羊草幼苗根的生长,FFA18:2会部分抑制羊草根毛的生长。6.低Ca2+诱导羊草体内SOD酶活升高、MDA含量减少。低Ca2+对羊草和拟南芥幼苗体内氧化代谢物的影响不一致,其中低Ca2+会诱导羊草叶、根中SOD酶活均升高,而MDA含量减少;相反,低Ca2+会诱导拟南芥叶、根中SOD酶活均降低,而MDA含量增多。同时,低Ca2+对于羊草叶片中H2O2的含量无影响,但会诱导羊草根组织中积累更多的H2O2。7.羊草和拟南芥根细胞膜脂质组成成分存在极大差异性。除PA在二者中所占比例不存在显着差异外,其他14种脂质物质所占比例都具有显着性差异;其中PC、PI、MGDG、PG、CL、DGDG、LPC属于在羊草中所占比例显着高于在拟南芥中所占比例,而PE、DAG、TAG、PS、LPA、LPE、LPS属于在羊草中所占比例显着低于在拟南芥中所占比例。羊草中含有、但拟南芥中不含有的脂质分子总计31种;拟南芥中含有、但羊草中不含有的脂质分子总计66种。通过以上研究得出的结论:在拟南芥中,低Ca2+特异性诱导根细胞中非选择性的胞吞增多,同时显着改变其膜脂分子的合成及代谢;羊草与拟南芥对低Ca2+环境的生理响应不同,低Ca2+对羊草根细胞中的胞吞、膜脂分子的合成及代谢影响较小。
吕晶[9]（2020）在《拟南芥钙依赖蛋白激酶（CPKs）的结构与活力调控机制研究》文中提出在真核生物中,蛋白激酶参与调节细胞功能的许多关键方面,包括细胞分裂、细胞代谢和对外界信号的反应等。钙依赖蛋白激酶CPKs/CDPKs（Ca2+-dependent protein kinases）是一类依赖Ca2+的蛋白激酶,是植物和某些原生动物Ca2+信号转导过程中主要的传递者,能识别发育和环境刺激引发的Ca2+信号,将其转化为蛋白质磷酸化事件。在植物中,CPKs/CDPKs是一个多基因家族,其调控机制非常复杂。近年来,对植物CPKs/CDPKs在免疫和应激信号网络中触发多样的下游反应的功能有很多研究,但其活力调控机制仍不清楚。本论文对拟南芥钙依赖蛋白激酶（AtCPKs）和原生动物弓形虫CDPK1（TgCDPK1）的活力调控机制进行了初步研究。CPKs/CDPKs大多由N端可变区域、丝/苏氨酸激酶结构域KD（Kinase Domain）、连接区域J（Junction）以及C端的类钙调蛋白结构域CLD（Calmodulin-like Domain）构成。不同亚组的AtCPKs基因由拟南芥cDNA文库克隆获得,TgCDPK1基因经密码子优化后合成。在此基础上,我们克隆了多个AtCPKs及TgCDPK1的全长和不同片段,在大肠杆菌体系中表达,经过一系列的纯化步骤,获得高浓度、高纯度的重组蛋白。运用NADH-LDH偶联酶测活方法和蛋白印迹法,我们得到以下初步结果:1)由大肠杆菌表达体系获得的AtCPKs和TgCDPK1重组蛋白具有蛋白激酶活力,且有磷酸化丝/苏氨酸信号;2)拟南芥不同亚组的AtCPKs对Ca2+的依赖性不同;3)比较磷酸化和去磷酸化状态AtCPKs的激酶活力,发现磷酸化对AtCPKs活力没有影响;4)测定AtCPK3、AtCPK4及TgCDPK1不同片段的活力,发现拟南芥CPK-KD有活力,但KD+J没有活力,而TgCDPK1的KD和KD+J片段均没有活力,说明AtCPKs和TgCDPK1的活化调控机制可能存在很大差异;5)开展AtCPKs的结构生物学研究,尝试阐明拟南芥CPKs活力调控的分子机制。
张洁[10]（2020）在《珍稀泌盐植物长叶红砂RtCML42和RtCDPK16的克隆与功能分析》文中研究指明钙是植物胞内第二信使,参与植物体内多种生理活动调节,同时在抵御环境胁迫时,通过调节细胞内钙浓度变化,激活一些蛋白质或酶,从而引发胁迫应答反应。长叶红砂（Reaumuria trigyna）,隶属于柽柳科（Tamarieaceae）琵琶柴属（Reaumuria）,是第三纪古地中海孑遗植物,强旱生泌盐盐生小灌木,为东阿拉善-西鄂尔多斯特有种。本研究基于转录组测序分析,克隆了长叶红砂2个Ca2+调控基因RtCML42和RtCDPK16的全长cDNA片段,并构建双元表达载体转化拟南芥,通过对其表达特性和基因功能开展研究,探讨RtCML42和RtCDPK16在植物抵抗逆境胁迫中的作用,进一步解析钙信号调控植物响应逆境的机制。主要研究结果如下:1.生物信息学分析表明,RtCML42的ORF长度为657bp,编码218个氨基酸,RtCDPK16基因的ORF长度为1689bp,编码562个氨基酸,两种蛋白均属亲水性蛋白,具有4个与Ca2+结合的EF-hand-Hand型结构域。RtCML42与蓖麻的CBL3同源性最高;RtCDPK16与葡萄CDPK16同源性最高。2.利用qRT-PCR进行基因表达特性分析,结果显示,RtCML42和RtCDPK16的表达可被高温、低温、NaCl、PEG等非生物胁迫和ABA、CaCl2处理显着诱导。亚细胞定位结果表明RtCML42和RtCDPK16分别定位于内质网和细胞膜。同时Ca2+等温滴定实验证明,RtCML42可通过EF-Hand区域与Ca2+结合发挥作用。3.构建pPZP221-RtCML42和pPZP221-RtCDPK16真核表达载体转化拟南芥,对野生型和T3代转基因株系进行干旱、盐和ABA胁迫,发现胁迫处理下转基因拟南芥的根长、侧根数、鲜重和叶绿素含量等表型指标均显着高于野生型,表明过表达RtCML42和RtCDPK16基因提高了植物抗逆性。4.检测不同胁迫处理下转基因和野生型拟南芥中抗氧化酶活性以及活性氧、渗透调节物质和离子含量,结果发现转基因株系中SOD、POD、CAT等抗氧化酶活性、脯氨酸含量均显着高于野生型,H2O2、O2-、MDA的含量显着低于野生型,表明超表达RtCML42和RtCDPK16基因,能够提高转基因拟南芥抗氧化能力,减轻膜损伤程度,从而改善转基因植株在干旱、盐及ABA胁迫下的生长状况。此外,外施一定浓度的CaCl2更有利于提高转基因拟南芥的抗氧化酶活性,降低ROS积累,提高其抗逆性。5.对转基因和野生型拟南芥进行Na+、K+、Ca2+三种离子含量测定,结果表明,与野生型株系相比,胁迫条件下转基因拟南芥K+、Ca2+含量明显上升,Na+含量以及Na+/K+显着降低,表明转基因株系通过调控拟南芥中Na+、K+、Ca2+三种离子含量、维持较低Na+/K+,进而调控转基因拟南芥体内离子稳态平衡。此外,外施一定浓度的CaCl2更有利于提高转基因拟南芥体内Na+含量和Ca2+/Na+,提高其抵抗逆境胁迫的能力。6.qRT-PCR检测干旱、盐和ABA胁迫下,过表达RtCML42和RtCDPK16基因的拟南芥,相比野生型,抗氧化酶基因AtSOD1、AtPOD1、AtAPX1、AtCAT1,离子转运相关基因AtSOS1,ABA合成相关基因AtNCED3,以及其他抗逆相关基因AtRD29A、AtABF4、AtRD22的表达均被显着诱导,表明RtCML42和RtCDPK16可能通过调节转基因植物氧化、渗透、离子平衡,提高植物的耐受性。
二、Characterization of a calmodulin binding protein kinase from Arabidopsis thalian（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Characterization of a calmodulin binding protein kinase from Arabidopsis thalian（论文提纲范文）
（1）番茄BAG8和BAG9在响应温度胁迫中的作用（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1 引言 |
| 1.1 低温胁迫对植物生长发育的影响 |
| 1.1.1 低温胁迫对植物光合作用的影响 |
| 1.1.2 低温胁迫对植物抗氧化酶活性的影响 |
| 1.1.3 低温胁迫与植物自噬的关系 |
| 1.1.4 植物响应低温胁迫的分子机制 |
| 1.2 高温胁迫对植物生长发育的影响 |
| 1.2.1 高温胁迫对植物光合作用的影响 |
| 1.2.2 高温胁迫对植物抗氧化酶活性的影响 |
| 1.2.3 高温胁迫与植物自噬的关系 |
| 1.2.4 植物响应高温胁迫的分子机制 |
| 1.3 分子伴侣蛋白BAG家族概述 |
| 1.3.1 BAG家族蛋白的发现 |
| 1.3.2 BAG家族蛋白的研究进展 |
| 1.3.3 BAG家族蛋白的生物学功能 |
| 1.4 研究目的与意义 |
| 2 番茄BAG家族基因的鉴定及生物信息学分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 番茄BAG家族基因的鉴定与命名 |
| 2.1.2 番茄、拟南芥、水稻和烟草的系统进化树构建 |
| 2.1.3 番茄BAG家族蛋白结构域预测及三维模型构建 |
| 2.1.4 番茄BAG家族基因的顺式作用元件分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 番茄BAG家族成员的系统进化和氨基酸序列分析 |
| 2.2.2 番茄BAG家族蛋白结构分析 |
| 2.2.3 番茄BAG家族基因启动子的顺式作用元件分析 |
| 2.3 讨论 |
| 3 番茄BAG家族在响应低温胁迫中的作用 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 植物材料与实验处理 |
| 3.1.2 病毒诱导的基因沉默(VIGS)实验 |
| 3.1.3 总RNA提取、反转录和基因表达水平检测 |
| 3.1.4 叶绿素荧光成像及测定 |
| 3.1.5 叶片相对电导率测定 |
| 3.1.6 光合相关参数测定 |
| 3.1.7 抗氧化酶活性测定 |
| 3.1.8 MDC染色和TEM观察自噬体 |
| 3.1.9 总蛋白提取与泛素化水平检测 |
| 3.1.10 数据分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 低温胁迫下番茄BAG家族基因表达量的变化 |
| 3.2.2 BAG家族基因沉默对番茄低温抗性的影响 |
| 3.2.3 低温胁迫下BAG8和BAG9影响番茄的光合作用 |
| 3.2.4 低温胁迫下BAG8和BAG9影响番茄的抗氧化酶系统 |
| 3.2.5 低温胁迫下BAG8和BAG9影响番茄的自噬和泛素化水平 |
| 3.3 讨论 |
| 4 番茄BAG8和BAG9 在响应高温胁迫中的作用 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 植物材料与实验处理 |
| 4.1.2 病毒诱导基因沉默技术(VIGS)实验 |
| 4.1.3 总RNA提取、反转录和基因表达水平检测 |
| 4.1.4 叶绿素荧光成像及测定 |
| 4.1.5 叶片相对电导率测定 |
| 4.1.6 光合相关参数测定 |
| 4.1.7 MDC染色和TEM观察自噬体 |
| 4.1.8 总蛋白提取与泛素化水平检测 |
| 4.1.9 数据分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 高温胁迫下番茄BAG家族基因表达量的变化 |
| 4.2.2 BAG8和BAG9基因沉默对番茄高温抗性的影响 |
| 4.2.3 高温胁迫下BAG8和BAG9影响番茄的光合作用 |
| 4.2.4 高温胁迫下BAG8和BAG9影响番茄的自噬和泛素化水平 |
| 4.3 讨论 |
| 5 番茄BAG8和BAG9蛋白功能的初步鉴定 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 植物材料 |
| 5.1.2 亚细胞定位 |
| 5.1.3 酵母文库筛选 |
| 5.1.4 GO富集分析 |
| 5.1.5 酵母双杂交实验 |
| 5.1.6 双分子荧光互补(BiFC)实验 |
| 5.1.7 数据分析 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 番茄BAG8和BAG9定位于细胞核和细胞质 |
| 5.2.2 番茄BAG8和BAG9互作蛋白的筛选 |
| 5.2.3 番茄BAG8和BAG9互作蛋白的验证 |
| 5.2.4 番茄BAG8、BAG9与HSP20家族互作的初步探究 |
| 5.3 讨论 |
| 6 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附表 |
（2）番茄钙依赖蛋白激酶CPK28在植物响应高温胁迫中的功能及机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1.引言 |
| 1.1 植物对高温的响应和耐性机制 |
| 1.1.1 植物对高温逆境的响应机制 |
| 1.1.2 植物对高温逆境的耐性机制 |
| 1.2 植物钙依赖性蛋白激酶在植物中的作用 |
| 1.2.1 植物钙依赖性蛋白激酶家族 |
| 1.2.2 植物钙依赖性蛋白激酶在逆境抗性中的作用 |
| 1.3 本文的研究目的和意义 |
| 2.番茄CPK28 在植物响应高温胁迫中的作用 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料与处理 |
| 2.1.2 叶绿素荧光测定 |
| 2.1.3 叶片中电解质渗透率测定 |
| 2.1.4 丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量测定 |
| 2.1.5 数据分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 番茄cpk28 突变体的构建和鉴定 |
| 2.2.2 CPK28 突变对番茄植株高温抗性的影响 |
| 2.2.3 CPK28 突变对番茄最大光化学效率的影响 |
| 2.2.4 CPK28 突变对细胞膜透性和膜质过氧化的影响 |
| 2.3 讨论 |
| 3.高温胁迫下CPK28 突变对番茄抗氧化系统的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料与处理 |
| 3.1.2 植物过氧化物检测DAB和 NBT染色以及H_2O_2和 O_2.~-含量测定 |
| 3.1.3 可溶性/不可溶蛋白的分离和测定及Western检测 |
| 3.1.4 抗氧化酶活性的测定 |
| 3.1.5 谷胱甘肽及抗坏血酸含量的测定 |
| 3.1.6 数据分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 CPK28 突变对植株H_2O_2含量及O_2.~-含量的影响 |
| 3.2.2 CPK28 突变对植株氧化蛋白含量的影响 |
| 3.2.3 CPK28 突变对多种高温响应蛋白表达的影响 |
| 3.2.4 CPK28 突变对叶片抗氧化酶活性的影响 |
| 3.2.5 CPK28 突变对番茄As A-GSH循环的影响 |
| 3.2.6 外源As A对番茄高温抗性和电解质渗透率的影响 |
| 3.2.7 外源As A对番茄As A-GSH循环的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 4.CPK28与APX的蛋白互作及其在高温抗性中的作用 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验材料及处理 |
| 4.1.2 Co-IP |
| 4.1.3 叶片中电解质渗透率测定 |
| 4.1.4 叶绿素荧光测定 |
| 4.1.5 APX活性 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 CPK28与APX互作 |
| 4.2.2 番茄apx2 突变体的构建和鉴定 |
| 4.2.3 APX2 突变对番茄植株高温抗性的影响 |
| 4.2.4 APX2 突变对番茄最大光化学效率的影响 |
| 4.2.5 APX2 突变对APX活性的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 5.APX2 磷酸化位点鉴定及其在高温抗性中的调控作用 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试验材料与处理 |
| 5.1.2 体外磷酸化试验 |
| 5.1.3 体内磷酸化试验 |
| 5.1.4 APX酶活性 |
| 5.1.5 叶绿素含量测定 |
| 5.1.6 体外APX活性测定 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 CPK28 磷酸化APX2 |
| 5.2.2 模拟去磷酸化抑制了CPK28 的磷酸化。 |
| 5.2.3 模拟去磷酸化对烟草高温抗性和APX活性的影响 |
| 5.2.4 模拟去磷酸化对番茄高温抗性的影响 |
| 5.2.5 模拟去磷酸化对番茄最大光化学效率的影响 |
| 5.2.6 模拟去磷酸化对番茄APX活性的影响 |
| 5.2.7 模拟去磷酸化对体外APX活性的影响 |
| 5.3 讨论 |
| 6.总结 |
| 参考文献 |
| 附表 |
| 作者简历 |
（3）外源独脚金内酯对黄瓜盐胁迫耐受性的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 植物对盐胁迫的响应 |
| 1.1.1 盐胁迫对植物膜脂质过氧化和渗透调节的影响 |
| 1.1.2 盐胁迫对植物活性氧代谢的影响 |
| 1.1.3 盐胁迫对植物光合作用的影响 |
| 1.1.4 盐胁迫对植物离子稳态的调节 |
| 1.1.5 盐胁迫对植物钙信号传导的影响 |
| 1.1.6 植物耐盐性相关基因表达的分子机制 |
| 1.2 独脚金内酯 |
| 1.2.1 独脚金内酯的合成、代谢及其调控 |
| 1.2.2 独脚金内酯信号转导 |
| 1.2.4 独脚金内酯对非生物胁迫的响应 |
| 1.3 转录组测序分析 |
| 1.3.1 转录组简介 |
| 1.3.2 植物耐盐性研究的转录组测序分析 |
| 1.4 研究的目的、意义及内容 |
| 1.4.1 研究的目的和意义 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 1.4.3 技术路线图 |
| 第2章 外源独脚金内酯缓解黄瓜幼苗胁迫过程光合作用的影响 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.1.3 数据分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 外源GR24对盐胁迫下黄瓜幼苗生长和MDA含量的影响 |
| 2.2.2 外源GR24对盐胁迫下黄瓜幼苗ASA、GSH、GSSG含量和GSH/GSSG的影响 |
| 2.2.3 外源GR24对盐胁迫下黄瓜幼苗叶片干重、鲜重和相对含水量(RWC)影响 |
| 2.2.4 外源GR24对盐胁迫下黄瓜幼苗叶片气孔开度的影响 |
| 2.2.5 外源GR24对盐胁迫下黄瓜幼苗叶片细胞色素的影响 |
| 2.2.6 外源GR24对盐胁迫下黄瓜幼苗叶片蒸腾速率(Tr)、气孔导度(Gs)、净光合速率(Pn)和胞间CO_2浓度(Ci)的影响 |
| 2.2.7 外源GR24对盐胁迫下黄瓜幼苗叶片光合参数的影响 |
| 2.3 讨论与小结 |
| 2.3.1 讨论 |
| 2.3.2 小结 |
| 第3章 H_2O_2和Ca~(2+)参与外源独脚金内酯对黄瓜幼苗耐盐性的调节 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 胁迫处理 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.1.3 数据分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 外源GR24对盐胁迫下黄瓜幼苗叶片电解质渗漏(EL)、脯氨酸含量影响 |
| 3.2.2 外源GR24对盐胁迫下黄瓜幼苗叶片细胞活性和O_2~(·-)、·OH的影响 |
| 3.2.3 外源GR24对盐胁迫下黄瓜幼苗叶片Ca~(2+)和H_2O_2含量的影响 |
| 3.2.4 外源GR24对盐胁迫下黄瓜幼苗叶片离子(Na~+、Cl~-和K~+)含量的影响 |
| 3.2.5 外源独脚金内酯对盐胁迫下黄瓜抗氧化酶活的影响 |
| 3.2.6 外源GR24对盐胁迫下黄瓜幼苗叶片钙传蛋白(CaMK、CaM、CDPK和Ca~(2+)-ATPase)的影响 |
| 3.2.7 外源GR24对盐胁迫下黄瓜幼苗叶片抗氧化酶基因表达的影响 |
| 3.2.8 外源GR24对盐胁迫下黄瓜幼苗叶片MAPK信号途径基因表达的影响 |
| 3.2.9 外源GR24对盐胁迫下黄瓜幼苗叶片NADPH氧化酶相关基因的影响 |
| 3.2.10 外源GR24对盐胁迫下黄瓜幼苗叶片CDPK基因的影响 |
| 3.2.11 外源GR24对盐胁迫下黄瓜幼苗叶片SOS途径基因的影响 |
| 3.3 讨论与小结 |
| 3.3.1 讨论 |
| 3.3.2 小结 |
| 第4章 外源独脚金内酯调控黄瓜幼苗耐盐性的转录组分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.1.3 数据分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 RNA-Seq测序的定位和定量评估 |
| 4.2.2 差异表达基因(DEGs)的分析 |
| 4.2.3 GO分类和KEGG途径分析 |
| 4.2.4 与光合作用和细胞色素有关的DEGs |
| 4.2.5 与Ca~(2+)信号和MAPK级联信号相关的DEGs |
| 4.2.6 与膜脂过氧化和谷胱甘肽代谢相关的DEGs |
| 4.2.7 与激素代谢和转录因子相关的DEGs |
| 4.2.8 与糖酵解途径、甘油磷脂代谢、三羧酸(TCA)循环和氧化磷酸化代谢途相关的DEGs |
| 4.2.9 转录因子(TFs)相关的DEGs |
| 4.2.10 qRT-PCR验证DEGs分析结果 |
| 4.3 讨论与结论 |
| 4.3.1 讨论 |
| 4.3.2 小结 |
| 第5章 总结与展望 |
| 5.1 主要结论 |
| 5.2 问题与展望 |
| 5.2.1 问题分析 |
| 5.2.2 前景展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历、在校期间发表的学术论文 |
（4）拟南芥钙调蛋白结合蛋白60b调控植物免疫的机理研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 植物的免疫系统 |
| 1.1.1 PTI途径 |
| 1.1.1.1 PRRs与 PAMPs |
| 1.1.1.2 PRRs下游的免疫途径 |
| 1.1.2 病原菌释放效应因子破坏PTI途径 |
| 1.1.3 ETI途径 |
| 1.1.3.1 植物中R蛋白的数目、结构和分类 |
| 1.1.3.2 R蛋白的作用机制 |
| 1.1.3.3 R蛋白下游的免疫途径 |
| 1.1.4 SA途径和SAR途径 |
| 1.1.4.1 SA的生物合成及其受体 |
| 1.1.4.2 SAR途径关键代谢物的合成以及与SA途径互相反馈调控 |
| 1.1.5 免疫响应的转录重编程 |
| 1.1.5.1 MAPK级联途径调控转录重编程 |
| 1.1.5.2 转录因子调控SA的生物合成 |
| 1.2 CBP60 家族成员在免疫中的作用 |
| 1.2.1 CBP60g/SARD1 正调控免疫响应 |
| 1.2.2 CBP60g/SARD1 在转录水平和蛋白水平受到调控 |
| 1.2.3 CBP60g/SARD1 在免疫信号正反馈调控中发挥关键作用 |
| 1.2.4 CBP60g的其它功能以及CBP60a负调控免疫响应 |
| 1.3 植物的自免疫突变体 |
| 1.3.1 自免疫突变体的类型 |
| 1.3.1.1 由免疫受体功能获得性突变导致的自免疫 |
| 1.3.1.2 由免疫负调控基因突变导致的自免疫 |
| 1.3.1.3 由R蛋白监控的效应因子靶点基因突变导致的自免疫 |
| 1.3.1.4 其它类型的自免疫突变体 |
| 1.3.2 研究自免疫突变体的意义 |
| 1.4 本研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 植物材料及生长条件 |
| 2.1.2 菌株和质粒 |
| 2.1.3 酶、试剂盒与各种生化试剂 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 突变体的鉴定 |
| 2.2.1.1 突变体的选择与订购 |
| 2.2.1.2 突变体鉴定引物的设计 |
| 2.2.1.3 植物基因组DNA提取 |
| 2.2.1.4 基因组水平鉴定突变体 |
| 2.2.1.5 植物总RNA的提取(试剂盒法) |
| 2.2.1.6 反转录 |
| 2.2.1.7 RNA水平鉴定突变体 |
| 2.2.2 表达载体的构建 |
| 2.2.2.1 PCR引物设计 |
| 2.2.2.2 目的片段的克隆 |
| 2.2.2.3 PCR产物回收(试剂盒法) |
| 2.2.2.4 克隆载体及入门载体的构建 |
| 2.2.2.5 大肠杆菌转化及质粒提取(试剂盒法) |
| 2.2.2.6 克隆载体及入门载体的测序 |
| 2.2.2.7 LR反应 |
| 2.2.2.8 T4 连接反应 |
| 2.2.2.9 载体质粒的酶切鉴定 |
| 2.2.3 CRISPR-Cas9 系统基因编辑载体引物的设计及载体的构建 |
| 2.2.4 农杆菌介导的拟南芥遗传转化及转基因植株的鉴定 |
| 2.2.4.1 冻融法转化根癌农杆菌 |
| 2.2.4.2 花序侵染法转化拟南芥 |
| 2.2.4.3 转基因拟南芥的筛选鉴定 |
| 2.2.5 RT-qPCR |
| 2.2.5.1 RT-qPCR引物设计 |
| 2.2.5.2 RT-qPCR反应体系及数据分析 |
| 2.2.6 酵母双杂交实验(Y2H) |
| 2.2.7 GUS染色分析 |
| 2.2.8 SAM石蜡包埋切片 |
| 2.2.8.1 取材固定 |
| 2.2.8.2 脱水、透明、浸蜡、包埋 |
| 2.2.8.3 钌红染色及树胶封片 |
| 2.2.9 台盼蓝染色 |
| 2.2.10 DAB染色 |
| 2.2.11 叶脉结构的观察 |
| 2.2.12 激光共聚焦显微镜观察及图像处理 |
| 2.2.13 染色质免疫共沉淀Ch IP(试剂盒法) |
| 2.2.13.1 抗体与带孔底部检测板结合 |
| 2.2.13.2 组织收集与蛋白-DNA交联 |
| 2.2.13.3 组织研磨与DNA碎片化 |
| 2.2.13.4 抗体-蛋白质-DNA免疫沉淀反应 |
| 2.2.13.5 DNA-蛋白解交联与DNA纯化 |
| 2.2.14 拟南芥叶肉原生质体的制备及转化 |
| 2.2.15 双荧光素酶报告系统转录激活实验 |
| 2.2.16 丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000 的培养及接种实验 |
| 2.2.17 转录组测序的材料及数据分析 |
| 2.2.18 植物蛋白免疫沉淀(IP)及蛋白免疫印迹(Western Blot) |
| 2.2.18.1 植物蛋白免疫沉淀 |
| 2.2.18.2 蛋白免疫印迹 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 CBP60 家族成员蛋白结构及表达模式分析 |
| 3.1.1 CBP60s蛋白序列、结构域以及同源性分析 |
| 3.1.2 CBP60 亚家族成员CBP60b-f的表达模式分析 |
| 3.1.2.1 TAIR转录组数据表明CBP60b-f表达模式既相似又有不同 |
| 3.1.2.2 CBP60b组成型高量表达 |
| 3.1.2.3 CBP60c-f表达量低 |
| 3.2 CBP60s突变体的获取及表型分析 |
| 3.2.1 CBP60s突变体的获取及鉴定 |
| 3.2.2 cbp60c;d;e;f四突发育正常 |
| 3.2.3 cbp60b发育缺陷 |
| 3.2.3.1 cbp60b的叶片及植株发育异常 |
| 3.2.3.2 cbp60b的茎尖分生组织发育异常 |
| 3.2.3.3 cbp60b的生长素积累异常 |
| 3.3 cbp60b为自免疫突变体 |
| 3.3.1 cbp60b转录组数据分析 |
| 3.3.2 cbp60b中免疫基因组成型高量表达 |
| 3.3.3 CBP60b表达受DC3000 诱导 |
| 3.3.4 cbp60b中 SA含量升高 |
| 3.3.5 cbp60b叶片中H_2O_2积累增加且细胞程序性死亡增多 |
| 3.3.6 cbp60b对病原菌DC3000 抗性增强 |
| 3.4 CBP60b作为转录激活因子正调控免疫 |
| 3.4.1 CBP60b定位于细胞核 |
| 3.4.2 CBP60b结合免疫基因启动子 |
| 3.4.3 CBP60b激活免疫基因表达 |
| 3.4.4 过表达CBP60b导致组成型免疫响应 |
| 3.4.5 CBP60b的 DNA结合结构域和Ca M结合结构域对其功能是必需的 |
| 3.5 CBP60b受到R蛋白监控 |
| 3.5.1 TNL型 R蛋白监控CBP60b |
| 3.5.1.1 EDS-PAD4-ADRs突变完全恢复cbp60b自免疫表型 |
| 3.5.1.2 SNC1 突变部分恢复cbp60b自免疫表型 |
| 3.5.2 CNL型 R蛋白监控CBP60b |
| 3.5.3 cbp60b中转录水平升高的R蛋白不参与监控CBP60b |
| 3.5.4 阻断 SAR途径或阻断 SA途径不能恢复cbp60b自免疫表型 |
| 3.6 CBP60b与 CBP60g/SARD1 功能冗余又有差异 |
| 3.6.1 CBP60b与 CBP60g/SARD1 功能冗余 |
| 3.6.2 CBP60b与 CBP60g/SARD1 的转录调控不同 |
| 3.6.3 CBP60b与 CBP60g/SARD1 功能差异 |
| 3.6.3.1 CBP60b调控CBP60g和 SARD1 表达 |
| 3.6.2.2 pro CBP60b:CBP60g或 pro CBP60b:SARD1 不能恢复cbp60b自免疫表型 |
| 3.7 工作模型 |
| 4 讨论 |
| 4.1 CBP60b正调控植物免疫响应 |
| 4.2 CBP60b突变导致植物免疫响应组成型激活 |
| 4.3 CBP60b与 CBP60g/SARD1 功能冗余又有差异 |
| 4.4 CBP60b及 CBP60s途径被R蛋白监控 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（5）绿豆幼苗响应镉胁迫的分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 重金属污染概述 |
| 1.2 重金属污染对植物的危害 |
| 1.2.1 重金属Cd在植物中的吸收、转运和积累 |
| 1.2.2 Cd对植物的毒害机制 |
| 1.3 植物对重金属胁迫的响应机制 |
| 1.3.1 植物根系对重金属的吸收和吸附 |
| 1.3.2 抗氧化系统清除重金属产生的活性氧(ROS) |
| 1.3.3 载体蛋白参与重金属离子在植物组织中的转运 |
| 1.3.4 金属结合蛋白结合重金属子 |
| 1.3.5 植物信号途径对重金属胁迫的响应 |
| 1.3.6 转录因子参与重金属胁迫的响应 |
| 1.4 本研究的意义及内容 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 植物材料及培养 |
| 2.2 主要仪器与试剂 |
| 2.3 主要分析软件 |
| 2.4 植物形态指标的测定 |
| 2.5 总RNA提取与cDNA合成 |
| 2.6 cDNA文库构建与测序 |
| 2.7 生物信息学分析 |
| 2.7.1 基因功能注释 |
| 2.7.2 基因表达量分析及基因表达差异分析 |
| 2.7.3 基因表达时序分析 |
| 2.8 基因表达定量分析 |
| 3 绿豆根响应Cd胁迫的分子机制 |
| 3.1 Cd胁迫对绿豆幼苗形态指标的影响 |
| 3.2 Cd胁迫对绿豆根基因表达水平的影响 |
| 3.3 Cd胁迫下绿豆根差异表达基因(DEGs)功能注释与富集 |
| 3.3.1 DEGs变化特征 |
| 3.3.2 DEGs功能注释与分类 |
| 3.3.3 DEGs的 GO与 KEGG富集 |
| 3.4 绿豆根响应Cd胁迫的重要基因和通路 |
| 3.4.1 参与Cd胁迫响应的转录因子 |
| 3.4.2 Cd胁迫对植物根信号途径相关基因的影响 |
| 3.4.3 Cd胁迫对根防御系统相关基因的影响 |
| 3.4.4 Cd胁迫对根细胞分裂相关基因的影响 |
| 3.4.5 Cd胁迫对细胞壁相关基因的影响 |
| 3.4.6 Cd胁迫对根载体蛋白相关基因的影响 |
| 3.5 Cd胁迫下绿豆根基因表达的时序变化 |
| 3.6 小结 |
| 4 绿豆茎响应Cd胁迫的分子机制 |
| 4.1 Cd胁迫对绿豆茎基因表达水平的影响 |
| 4.2 Cd胁迫下绿豆茎差异表达基因(DEGs)功能富集 |
| 4.2.1 DEGs变化特征 |
| 4.2.2 DEGs的 GO与 KEGG富集 |
| 4.3 绿豆茎响应Cd胁迫的重要基因和通路 |
| 4.3.1 解毒相关基因参与绿豆茎对Cd胁迫的响应 |
| 4.3.2 次级代谢参与茎对Cd胁迫的响应 |
| 4.3.3 载体蛋白在Cd胁迫响应中发挥重要作用 |
| 4.3.4 植物激素信号和MAPK信号途径参与茎对Cd胁迫的响应 |
| 4.4 Cd胁迫下绿豆茎基因表达的时序变化 |
| 4.5 小结 |
| 5 绿豆叶响应Cd胁迫的分子机制 |
| 5.1 Cd胁迫对绿豆叶基因表达水平的影响 |
| 5.2 Cd胁迫下绿豆叶差异表达基因(DEGs)功能富集 |
| 5.2.1 DEGs变化特征 |
| 5.2.2 DEGs的 GO与 KEGG富集 |
| 5.3 绿豆叶响应Cd胁迫的重要基因和通路 |
| 5.3.1 Cd胁迫对绿豆叶片光合作用相关基因的影响 |
| 5.3.2 乙醛酸途径参与叶片对Cd胁迫的响应 |
| 5.3.3 蛋白质合成和修饰参与叶片对Cd胁迫的响应 |
| 5.4 Cd胁迫下绿豆叶基因表达的时序变化 |
| 5.5 小结 |
| 6 Cd胁迫下已知功能基因的定量表达研究 |
| 6.1 已知基因及其功能 |
| 6.2 已知基因定量表达与RNA-Seq数据的相关性 |
| 6.3 Cd胁迫对根茎叶中已知基因表达量的影响 |
| 6.4 已知基因在响应Cd胁迫中的意义 |
| 7 讨论与结论 |
| 7.1 绿豆通过复杂的分子调控机制响应Cd胁迫产生的毒性 |
| 7.2 根最先参与Cd胁迫的响应,是植物最重要的解毒器官 |
| 7.3 茎主要通过抗氧化系统和次级代谢途径实现对地上部分Cd的解毒 |
| 7.4 光合作用和乙醛酸循环是叶片响应Cd胁迫的主要生物途径 |
| 7.5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
（6）拟南芥钙离子依赖蛋白激酶CPK5/6磷酸化几丁质受体调控免疫反应的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略表 |
| 第一章 植物免疫系统的研究综述 |
| 1.植物PTI免疫系统 |
| 1.1 模式识别受体 |
| 1.1.1 PRRs及对应PAMPs |
| 1.1.2 PRRs受体复合体及下游信号组分 |
| 1.2 植物PTI其他免疫反应 |
| 1.2.1 MAPK级联反应 |
| 1.2.2 ROS,Ca~(2+)爆发 |
| 1.3 植物PTI反应调控 |
| 1.3.1 磷酸化和去磷酸化在PTI中的功能 |
| 1.3.2 泛素化修饰在PTI信号通路中的影响 |
| 2.植物的ETI调控系统 |
| 2.1 效应蛋白对植物PTI的影响 |
| 2.1.1 效应蛋白对PRRs的抑制作用 |
| 2.1.2 效应蛋白对MAPK级联反应的影响 |
| 2.2 植物体内的R基因及对应的效应蛋白识别 |
| 3.钙调蛋白的功能研究 |
| 3.1 植物中受钙离子调节的蛋白激酶 |
| 3.2 CDPKs在植物中的功能研究 |
| 4.研究目的和意义 |
| 第二章 材料和方法 |
| 1.1 质粒载体和菌株 |
| 1.2 拟南芥的种植和生长管理 |
| 1.2.1 材料 |
| 1.2.2 方法 |
| 1.3 拟南芥稳定转化 |
| 1.3.1 材料和试剂 |
| 1.3.2 载体构建 |
| 1.3.3 拟南芥稳定转化 |
| 1.4 亲和纯化LYK5-Myc受体复合体蛋白 |
| 1.4.1 试剂和材料 |
| 1.4.2 实验方法 |
| 1.5 双分子荧光互补实验 |
| 1.5.1 载体构建 |
| 1.5.2 在烟草叶片中瞬时表达分析 |
| 1.6 蛋白免疫印迹实验 |
| 1.6.1 SDS-PAGE凝胶制备 |
| 1.6.2 转膜 |
| 1.6.3 孵育抗体和曝光 |
| 1.7 免疫共沉淀实验 |
| 1.7.1 试剂与材料 |
| 1.7.2 方法与步骤 |
| 1.8 体外蛋白纯化实验 |
| 1.8.1 载体构建 |
| 1.8.2 转化E.coli BL21 Condon Plus(DE3)菌株 |
| 1.8.3 蛋白诱导表达检测 |
| 1.8.4 体外亲和纯化标签蛋白质 |
| 1.9 体外磷酸化实验 |
| 1.9.1 试剂和材料 |
| 1.9.2 步骤 |
| 1.10 荧光定量分析基因相对表达 |
| 1.10.1 RNA提取 |
| 1.10.2 RNA反转录c DNA |
| 1.10.3 q RT-PCR反应 |
| 1.10.4 q RT-PCR数据分析 |
| 1.11 活性氧测定 |
| 1.11.1 试剂及材料 |
| 1.11.2 步骤 |
| 1.12 胼胝体沉淀染色 |
| 1.12.1 试剂和材料 |
| 1.12.2 实验步骤 |
| 第三章 结果与分析 |
| 1.鉴定与LYK5互作的蛋白 |
| 2.CPK5缺失突变影响几丁质引起的免疫反应 |
| 3.几丁质受体LYK5和LYK4 胞内结构域受CPK5和CPK6 磷酸化调控 |
| 4.CPK5 磷酸化LYK5 胞内结构域位点的鉴定 |
| 5.LYK5磷酸化位点突变体表型鉴定 |
| 6.CPK5 稳定CERK1 蛋白水平的研究 |
| 第四章 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录一 本课题所用引物序列 |
| 附录二 |
| 附录三 在读期间发表论文 |
| 致谢 |
（7）拟南芥IQM基因家族多突变体构建及其表型分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 Ca~(2+)是植物细胞中重要的第二信使 |
| 1.2 Ca~(2+)传感蛋白 |
| 1.2.1 Ca M和 Ca MBP |
| 1.2.2 IQ基序与Ca MBP家族 |
| 1.2.3 钙调素信号与种子萌发 |
| 1.2.4 赤霉素的合成及信号通路 |
| 1.2.5 GA与种子萌发 |
| 1.3 IQM基因家族研究现状 |
| 1.3.1 IQM1(AT4g33050) |
| 1.3.2 IQM2(AT3G13600) |
| 1.3.3 IQM3(AT3G52870) |
| 1.3.4 IQM4(AT2G26190) |
| 1.3.5 IQM5(AT5G57010) |
| 1.3.6 IQM6(AT3G58480) |
| 1.4 CRISPR/Cas9 基因编辑技术 |
| 1.5 研究目的及意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 菌种和质粒 |
| 2.1.3 试剂 |
| 2.1.4 溶液和培养基 |
| 2.1.5 大肠杆菌感受态的制备与转化 |
| 2.1.6 农杆菌感受态细胞的制备和转化 |
| 2.2 CRISPR/Cas9 操作方法 |
| 2.2.1 IQM基因组靶位点选择和双链接头设计 |
| 2.2.2 靶标gRNA表达盒排列和扩增引物使用方法 |
| 2.2.3 IQM六个靶点的CRISPR/Cas9-DN载体构建详细操作方法 |
| 2.2.4 构建IQM5,IQM6 双元CRISPRE/Cas9-DH潮霉素载体 |
| 2.3 生理生化学实验方法 |
| 2.3.1 叶片DNA的粗提 |
| 2.3.2 种子RNA提取 |
| 2.3.3 RT-PCR和 RT-q PCR |
| 2.3.4 质粒DNA的提取 |
| 2.3.5 DNA片段的回收 |
| 2.3.6 DNA片段的纯化 |
| 2.3.7 农杆菌介导的遗传转化 |
| 2.3.8 成花表型观察 |
| 2.3.9 种子萌发实验 |
| 2.3.10 幼苗根长实验 |
| 2.4 统计学方法 |
| 2.5 实验所用引物 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 IQM(1~6)CRISPR/Cas9 六突变体的构建及鉴定 |
| 3.2 基因编辑成功的突变体的筛选和鉴定 |
| 3.2.1 四突变体iqm(1,2,3,4)的筛选和鉴定 |
| 3.2.2 三突变体iqm(2,5,6)的筛选和鉴定 |
| 3.2.3 六突变体iqm(1,2,3,4,5,6)的筛选 |
| 3.3 缺糖胁迫对种子萌发的影响 |
| 3.4 缺糖胁迫对幼苗根长的影响 |
| 3.5 多效唑对种子萌发的影响 |
| 3.5.1 最适浓度的探究 |
| 3.5.2 iqm(1,2,3,4)-1对PAC的敏感性 |
| 3.5.3 赤霉素合成与反应关键基因的表达分析 |
| 3.6 iqm(1,2,3,4)-1的成花表型分析 |
| 第四章 讨论与结论 |
| 4.1 iqm(1,2,3,4)-1种子萌发表型形成的机制 |
| 4.2 iqm(1,2,3,4)-1对缺糖不敏感的机制 |
| 4.3 iqm(1,2,3,4)-1的长日照晚花表型的形成机制 |
| 4.4 优化基因编辑系统、丰富IQM家族多突变体类型 |
| 4.5 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（8）拟南芥、羊草根响应低Ca2+环境的生理、细胞和分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 Ca~(2+)与细胞膜、羊草的研究进展及植物响应低Ca~(2+)环境的研究意义 |
| 1 植物Ca~(2+)与细胞膜系统 |
| 1.1 Ca~(2+)作为营养物质在植物体中发挥作用 |
| 1.2 Ca~(2+)作为第二信使在植物体中发挥作用 |
| 1.3 植物细胞膜系统 |
| 1.3.1 细胞膜结构 |
| 1.3.2 细胞膜的生理特性 |
| 1.3.3 细胞膜的囊泡运输 |
| 1.4 Ca~(2+)对细胞膜的调控作用 |
| 2 羊草的研究进展 |
| 3 植物响应低Ca~(2+)环境的生理、细胞和分子机制的研究意义 |
| 第二章 拟南芥、羊草根响应低Ca~(2+)环境的生理、细胞和分子机制的研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.1.3 相关试剂及溶液的配制 |
| 2.1.4 拟南芥T-DNA突变体鉴定相关引物 |
| 2.2 实验原理及方法 |
| 2.2.1 种子消毒 |
| 2.2.2 植物的培养条件 |
| 2.2.3 低Ca~(2+)诱导拟南芥根细胞发生胞吞的细胞学实验方法 |
| 2.2.4 低Ca~(2+)对拟南芥根组织的脂质代谢影响研究原理及方法 |
| 2.2.5 拟南芥T-DNA插入突变体种子纯合鉴定及表型分析 |
| 2.2.6 羊草不同Ca~(2+)浓度培养基生理表型分析 |
| 2.2.7 低Ca~(2+)对羊草根细胞内胞吞反应的影响 |
| 2.2.8 低Ca~(2+)对羊草根细胞脂质代谢的影响 |
| 2.2.9 不同FFA药物对羊草根生长的影响 |
| 2.2.10 羊草低Ca~(2+)处理下生理指标测定原理及方法 |
| 2.2.11羊草低Ca~(2+)处理下DAB染色实验 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 拟南芥根细胞响应低Ca~(2+)的生理、细胞、分子机制研究 |
| 3.1.1 降低细胞外Ca~(2+)浓度特异性诱导拟南芥根细胞中胞吞增多 |
| 3.1.2 低Ca~(2+)诱导的胞吞是一个基于液相流动的过程 |
| 3.1.3 低Ca~(2+)诱导的拟南芥根细胞中胞吞发生途径是保守的 |
| 3.1.4 低Ca~(2+)诱导的拟南芥根细胞中胞吞发生途径对GdCl3 不敏感,但对W7敏感 |
| 3.1.5 低Ca~(2+)诱导的拟南芥根细胞中胞吞发生途径对Wortmannin不敏感,但对Neomycin敏感 |
| 3.1.6 低Ca~(2+)显着改变拟南芥细胞膜脂质分子的合成及代谢 |
| 3.1.7 低Ca~(2+)对拟南芥根细胞中PI、DAG的影响 |
| 3.1.8 低Ca~(2+)对拟南芥脂质分子相关突变体生长的影响 |
| 3.2 羊草根细胞响应低Ca~(2+)的生理、细胞、分子机制研究 |
| 3.2.1 羊草不具有Ca~(2+)浓度依赖性生长的表型 |
| 3.2.2 降低细胞外Ca~(2+)浓度对羊草根细胞胞吞反应无影响 |
| 3.2.3 羊草根中胞吞是一个有选择性的基于液相流动的过程。 |
| 3.2.4 羊草根细胞中的胞吞发生途径对GdCl3不敏感,但对W7敏感 |
| 3.2.5 降低细胞外Ca~(2+)浓度对羊草根细胞脂质代谢无显着影响 |
| 3.2.6 低Ca~(2+)条件下羊草根细胞内含量显着变化的脂质分子 |
| 3.2.7 降低细胞外Ca~(2+)浓度诱导羊草根细胞中FFA含量升高 |
| 3.2.8 降低细胞外Ca~(2+)浓度诱导羊草中MDA含量降低,SOD酶活升高 |
| 3.3 羊草与拟南芥根细胞中脂质分子差异性比较 |
| 3.3.1 羊草及拟南芥根细胞中脂质成分分析 |
| 3.3.2 羊草及拟南芥根细胞中特有脂质分子分析 |
| 3.4 降低细胞外Ca~(2+)浓度对沙生冰草、老芒麦根细胞胞吞反应无影响 |
| 4 讨论与结论 |
| 4.1 低Ca~(2+)诱导拟南芥根细胞中胞吞增多,细胞膜脂质代谢发生显着改变 |
| 4.2 低Ca~(2+)对羊草根细胞中胞吞及细胞膜脂质代谢无显着影响 |
| 4.3 羊草及拟南芥根细胞内脂质分子具有较大的差异性 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 博士期间论文发表情况 |
| 附录 |
| 附录一:英文缩略词 |
| 附录二:拟南芥根脂质组学数据 |
| 附录三:羊草根脂质组学数据 |
（9）拟南芥钙依赖蛋白激酶（CPKs）的结构与活力调控机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 蛋白激酶的概述 |
| 1.2 CDPKs简介 |
| 1.3 CDPKs家族 |
| 1.3.1 CDPKs的分类与定位 |
| 1.3.2 CDPKs的结构域组成 |
| 1.4 CDPKs蛋白在信号通路中的功能 |
| 1.4.1 第一组蛋白成员的功能 |
| 1.4.2 第二组蛋白成员的功能 |
| 1.4.3 第三组蛋白成员的功能 |
| 1.4.4 第四组蛋白成员的功能 |
| 1.5 CDPKs家族蛋白激酶的活力调控机制 |
| 1.6 本论文的主要研究目标与研究意义 |
| 第二章 CDPKs重组蛋白的克隆构建及表达纯化 |
| 2.1 实验仪器与材料 |
| 2.1.1 实验仪器 |
| 2.1.2 实验材料 |
| 2.2 实验操作方法 |
| 2.2.1 分子克隆实验方法 |
| 2.2.2 蛋白表达纯化实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 CDPKs重组蛋白的克隆构建 |
| 2.3.2 CDPKs重组蛋白的表达与纯化 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 CDPKs的活力调控机制研究 |
| 3.1 实验材料与仪器 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 蛋白印迹法 |
| 3.2.2 偶联酶测活方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 Ca~(2+)对CDPKs的激酶活力的影响 |
| 3.3.2 CDPKs的磷酸化对激酶活力的影响 |
| 3.3.3 CDPKs的不同蛋白片段的活力状态 |
| 3.4 本章总结 |
| 第四章 拟南芥CPKs蛋白的结构生物学研究 |
| 4.1 蛋白结晶材料与方法 |
| 4.1.1 蛋白结晶材料 |
| 4.1.2 蛋白结晶方法 |
| 4.2 蛋白结晶条件筛选 |
| 4.2.1 结晶条件初筛 |
| 4.2.2 结晶条件优化 |
| 4.3 蛋白结晶结果 |
| 4.4 本章总结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 论文总结 |
| 5.2 研究展望 |
| 参考文献 |
| 主要中英文缩略词对照表 |
| 附录 |
| 致谢 |
（10）珍稀泌盐植物长叶红砂RtCML42和RtCDPK16的克隆与功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 钙对植物生长发育的调控 |
| 1.1.1 细胞内钙信号的传递 |
| 1.1.2 钙作为信使参与植物非生物胁迫的响应 |
| 1.2 植物CaM/CML研究进展 |
| 1.2.1 钙调素(CaM)及钙调素类蛋白(CML)的结构特征 |
| 1.2.2 CaM/ CML介导植物的生长发育 |
| 1.2.3 CaM/ CML参与植物非生物胁迫响应的调控 |
| 1.3 植物CDPK研究进展 |
| 1.3.1 CDPK的结构特征 |
| 1.3.2 CDPK的表达特性及调控机制 |
| 1.3.3 CDPK介导的植物对非生物胁迫响应的调控 |
| 1.4 长叶红砂研究进展 |
| 1.4.1 长叶红砂生物学特征 |
| 1.4.2 长叶红砂抗逆性研究进展 |
| 1.5 研究意义和技术路线图 |
| 1.5.1 研究意义 |
| 1.5.2 技术路线图 |
| 第二章 长叶红砂RtCML42基因的克隆和功能分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物种子、菌种和质粒 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 长叶红砂幼苗的培养 |
| 2.2.2 幼苗RNA提取 |
| 2.2.3 RtCML42基因的生物信息学分析 |
| 2.2.4 RtCML42基因表达特性分析 |
| 2.2.5 cDNA第一链合成 |
| 2.2.6 长叶红砂基因RtCML42的克隆 |
| 2.2.7 RtCML42基因的亚细胞定位分析 |
| 2.2.8 RtCML42 基因EF-Hand区域的原核表达载体构建及大肠杆菌转化 |
| 2.2.9 体外获得Pet32a-RtCML42-EF重组蛋白 |
| 2.2.10 RtCML42基因真核表达载体的构建 |
| 2.2.11 RtCML42转基因拟南芥的筛选与鉴定 |
| 2.2.12 转基因拟南芥RtCML42的抗逆性分析 |
| 2.2.13 非生物胁迫下RtCML42转基因拟南芥抗逆响应基因表达量检测 |
| 2.2.14 数据处理与分析 |
| 2.3 结果分析 |
| 2.3.1 RtCML42基因的克隆 |
| 2.3.2 RtCML42基因的生物信息学分析 |
| 2.3.3 RtCML42基因表达特性分析 |
| 2.3.4 RtCML42基因的亚细胞定位 |
| 2.3.5 RtCML42-EF-Hand结构域与Ca~(2+)特异性结合 |
| 2.3.6 RtCML42转基因拟南芥的获得及抗逆性分析 |
| 2.3.7 RtCML42转基因拟南芥对非生物胁迫的耐受性分析 |
| 2.3.8 非生物胁迫下RtCML42转基因拟南芥抗氧化能力检测 |
| 2.3.8.1 H_2O_2和O~(2-)的含量及积累速率检测 |
| 2.3.8.2 抗氧化酶活性及膜损伤程度检测 |
| 2.3.9 非生物胁迫下RtCML42转基因拟南芥中离子含量测定 |
| 2.3.10 非生物胁迫下RtCML42转基因拟南芥中基因表达量的检测 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 长叶红砂RtCDPK16 基因的克隆和功能分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 长叶红砂RtCDPK16 基因的克隆与生物信息学分析 |
| 3.2.2 RtCDPK16 基因表达特性分析 |
| 3.2.3 RtCDPK16 基因的亚细胞定位分析 |
| 3.2.4 RtCDPK16 转基因拟南芥的筛选与鉴定 |
| 3.2.5 RtCDPK16 转基因拟南芥的抗逆性分析 |
| 3.2.6 非生物胁迫下RtCDPK16 转基因拟南芥相关抗逆响应基因表达量分析 |
| 3.2.7 数据处理与分析 |
| 3.3 结果分析 |
| 3.3.1 RtCDPK16 基因的克隆 |
| 3.3.2 RtCDPK16 基因的生物信息学分析 |
| 3.3.3 RtCDPK16 基因表达特性分析 |
| 3.3.4 RtCDPK16 基因的亚细胞定位 |
| 3.3.5 RtCDPK16 真核表达载体构建 |
| 3.3.6 RtCDPK16 转基因拟南芥纯合体的获得 |
| 3.3.7 RtCDPK16 转基因拟南芥对非生物胁迫的耐受性分析 |
| 3.3.8 非生物胁迫下RtCDPK16 转基因拟南芥抗氧化能力检测 |
| 3.3.8.1 H_2O_2和O~(2-)的含量及积累速率检测 |
| 3.3.8.2 抗氧化酶活性及膜损伤程度检测 |
| 3.3.9 非生物胁迫下RtCDPK16 转基因拟南芥中胁迫相关基因表达量的检测 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、Characterization of a calmodulin binding protein kinase from Arabidopsis thalian（论文参考文献）
- [1]番茄BAG8和BAG9在响应温度胁迫中的作用[D]. 杨晨. 浙江大学, 2021(01)
- [2]番茄钙依赖蛋白激酶CPK28在植物响应高温胁迫中的功能及机制研究[D]. 李建鑫. 浙江大学, 2021(01)
- [3]外源独脚金内酯对黄瓜盐胁迫耐受性的影响[D]. 张小花. 西北师范大学, 2021(12)
- [4]拟南芥钙调蛋白结合蛋白60b调控植物免疫的机理研究[D]. 李鲁申. 山东农业大学, 2021(01)
- [5]绿豆幼苗响应镉胁迫的分子机制研究[D]. 冷艳. 兰州交通大学, 2021(01)
- [6]拟南芥钙离子依赖蛋白激酶CPK5/6磷酸化几丁质受体调控免疫反应的研究[D]. 黄聪聪. 华中农业大学, 2020(02)
- [7]拟南芥IQM基因家族多突变体构建及其表型分析[D]. 魏丽茵. 广州大学, 2020(02)
- [8]拟南芥、羊草根响应低Ca2+环境的生理、细胞和分子机制研究[D]. 杨菊. 内蒙古大学, 2020(01)
- [9]拟南芥钙依赖蛋白激酶（CPKs）的结构与活力调控机制研究[D]. 吕晶. 苏州大学, 2020(02)
- [10]珍稀泌盐植物长叶红砂RtCML42和RtCDPK16的克隆与功能分析[D]. 张洁. 内蒙古大学, 2020(01)