一、牛体外受精卵5～10细胞期单一卵裂球染色体诊断（论文文献综述）
崔立欣[1]（2020）在《组蛋白甲基转移酶ASH1L在牛卵丘细胞及胚胎中的表达和功能》文中研究说明在哺乳动物中,表观遗传修饰对细胞增殖和胚胎的发育具有重要的调控作用,其中组蛋白的甲基化及乙酰化可改变染色体的构象,调控基因的表达与沉默,进而调节个体的发育。缺失的、小的、同源异形蛋白1（Absent small or homeotic 1,ASH1L）是一种组蛋白甲基转移酶,可通过甲基化H3K36、拮抗多梳蛋白的表达进而促进个体的生长与发育。本文研究ASH1L甲基转移酶在牛卵丘细胞及胚胎中的表达和功能,为进一步揭示其对胚胎的调控机制提供技术和理论基础。试验一:为探究ASH1L甲基转移酶在牛卵丘细胞中的表达与功能,对细胞中ASH1L表达进行检测。结果显示,ASH1L位于牛卵丘细胞的细胞核中,呈点状分布。成功筛选到能有效干扰牛Ash1L基因的siRNA-2,其干扰效率为6070%。将siRNA-2转染卵丘细胞后,该干扰组细胞中H3K36me1/2/3三种甲基化水平均显着低于对照组（P<0.05）;干扰Ash1L导致凋亡细胞数增多、凋亡相关基因Bax、Bcl-2及caspase-3表达水平显着上调,凋亡基因Bax和caspase-3表达量高于抗凋亡相关基因Bcl-2（1.311和1.179 vs 1.146）;同时干扰Ash1L基因表达也引起PRC2蛋白亚基基因的表达量显着升高（P<0.05）。说明ASH1L蛋白在细胞凋亡中具有一定的调节作用。试验二:为探究ASH1L甲基转移酶在牛体外受精胚胎中的表达与功能,对各发育阶段胚胎中ASH1L的表达进行检测。结果显示,ASH1L蛋白存在于牛卵母细胞的细胞核、2-、4-、8-、16-细胞期胚胎的细胞核中,而在桑椹胚与囊胚期间,ASH1L在细胞核中呈点状分布;H3K36me2/3在牛卵母细胞和各发育阶段的体外受精胚胎中均能检测到,且其在4-细胞期胚胎中较弱,从8-细胞开始信号开始增强,直到囊胚。Ash1L基因表达量在16-细胞和桑椹胚期显着高于其他各时期（P<0.05）。注射siAsh1L后,囊胚发育率和质量显着下降（P<0.05）。多能相关基因mRNA表达量显着下降（P<0.05）。PRC2相关亚基EZH2在2-细胞到桑椹胚期表达量均显着升高（P<0.05）;EED和Suz12在16-细胞和桑椹胚期表达量显着升高（P<0.05）。试验三:为预测ASH1L甲基转移酶的靶基因,揭示其对胚胎发育的调控机制,对其进行转录组测序,意在找出其靶基因。结果显示,共筛选出828个差异基因,其中上调基因514个,下调基因314个。GO注释共筛选出1723条GO条目,KEGG分析得出58条信号通路。ASH1L蛋白主要参与赖氨酸降解途径和紧密连接途径,其中差异倍数较大的为ACAT2及ZAK基因,两者均与细胞生长及胚胎发育相关,预测ASH1L酶的靶基因可能为ACAT2及ZAK,然而其与ASH1L甲基转移酶的作用机制和对胚胎发育的调控功能还需要进一步的研究。综上所述,ASH1L甲基转移酶存在于卵丘细胞、卵母细胞及早期胚胎的细胞核中;干扰Ash1L基因表达后,卵丘细胞的凋亡率显着增加,凋亡相关基因的表达水平升高,H3K36me1/2/3甲基化水平显着降低;抑制胚胎中Ash1L基因表达,胚胎发育率和囊胚质量显着下降,胚胎多能基因的表达水平降低,PRC2蛋白亚基基因表达量显着升高;通过转录组测序分析预测Ash1L甲基转移酶的靶基因为ACAT2和ZAK基因,为深入研究ASH1L酶在动物胚胎发育中的调控机制提供理论基础。
赵国丽[2]（2019）在《基于转录组学鉴定荷斯坦青年母牛繁殖力性状相关基因及机理研究》文中提出在过去的20年里中国荷斯坦奶牛在选择强度的加大下,单产水平急剧攀升而繁殖力缓慢下降,与其他奶业发达国家繁殖力发展规律基本一致,高产奶牛在生理和代谢方面都发生了极大变化来适应高产的生产环境,一般在规模奶牛场受精率在90%左右,而产犊率在60%左右,在生产中存在30%左右的胚胎丢失或胎儿死亡,因此,早期隐性流产是影响繁殖力的重要因素,基于上述背景,本研究开展了以下方面的工作:1.荷斯坦青年母牛孕酮分泌范型建立与早期隐性流产研究随机选取100头13月龄-14月龄中国荷斯坦青年奶牛作为研究对象,配种当天计作0天,其后每隔3天尾跟采血1次,直到配种后60天,同时在30天与60天B超妊娠检查时做好每头牛的繁殖记录,每头牛做好标记,采血后立即离心取血浆进行孕酮测定,孕酮测定采用放射免疫法测定,数据分析采用SAS软件单因素方差分析,结果显示了正常妊娠组56头牛孕酮分泌范型:第 3 天为 1.255ng/mL±0.554 ng/mL,第 6 天 2.973 ng/mL±1.241 ng/mL,第9天4.237ng/mL±1.590ng/mL,第3天到第9天孕酮水平急剧升高,第21天5.957 ng/mL±2.524 ng/mL,大于2ng/mL,随后孕酮水平保持在6ng/mL,符合早期胚胎发育所需的组织营养特别是孕酮的需求变化,根据孕酮分泌范型结合母牛个体孕酮曲线急剧下降节点判定早期隐性流产组牛17头:第18天3头,第21天3头,第33天3头,第39天3头;第45天2头,第51天3头;60天受胎率为70%,早期隐性流产率17%。2.荷斯坦青年母牛早期隐性流产转录组测序与候选基因筛选选取青年荷斯坦母牛早期隐性流产组第18天、第21天、第33天、第39天和第51天各3头,相对应天数正常发育组各3头为对照,采用RNA-Seq技术对其进行转录组测序研究,结果显示:第18天发现32个差异表达基因,其中15个基因上调,17个基因下调;第21天发现175个差异表达基因,102个上调,74个下调;第33天发现5个差异表达基因,1个基因上调,4个下调;第39天发现10个差异表达基因,2个上调,8个下调:第51天发现2个上调基因,0个下调基因。根据生物信息学相关分析共筛选出6个早期隐性流产相关候选基因:p38、Fas、CDH2、VCAM1、MMP14、EEF1A1。3.荷斯坦青年母牛繁殖力生物信息学分析通过生物信息学研究发现:p38和Fas可能调控了黄体细胞凋亡;CDH2基因表达产物作为钙离子依赖的细胞粘附素家族一员,可能在调节胚胎神经管的形成起到重要作用,基因的下调导致早期胚胎死亡;VCAM1基因表达的糖蛋白分子,可能介导了早期胚胎与子宫内膜的粘附作用;MMP14基因表达一种锌依赖型蛋白水解酶,在早期胚胎侵润子宫内膜起到关键作用,EEF1A1是真核生物翻译延长因子三者共同作用完成早期胚胎的附植准备工作。
张安然[3]（2018）在《食蟹猴胚胎操作中若干技术效率的分析》文中提出实验动物作为人类疾病动物模型的研究对象,为人类疾病的发病机制、新药物或新兴治疗方法提供大量的研究数据,有效规避了人类实验风险和伦理限制,为人类生物医学发展做出不可磨灭的贡献。灵长类动物与人类之间的遗传信息与生理生化方面高度相似,是制作人类重大疾病模型的重要对象。灵长类动物遗传疾病模型的制作有赖于转基因技术和辅助生殖技术,通过体外受精、体外培养获得胚胎,将基因编辑载体注射入胚胎并实施胚胎移植获得基因修饰灵长类动物,这将对人类重大疾病研究和新药研发提供重要疾病模型。本实验研究,以食蟹猴为研究对象。通过腹腔镜手术收集超数排卵母猴的卵母细胞,电刺激法获得公猴精子,卵胞质内单精子注射（ICSI）受精获得胚胎。通过胚胎冷冻保存,以及胚胎注射基因修饰载体等实验过程,分析取卵后MI卵母细胞受精及其胚胎发育潜能;分析基因编辑猴冷冻-复苏精子与正常新鲜精子在胚胎发育潜能上的差异;分析原核时期基因编辑载体胞质注射和原核注射对胚胎发育的影响;分析早期胚胎遗传诊断技术中4～8细胞胚胎透明带切割对胚胎后续囊胚发育的影响,以及分析囊胚滋养层细胞取材后冷冻-复苏胚胎与对照组胚胎对比复苏率和着床率。多方面为食蟹猴辅助生殖技术的有效性和安全性做出评估,为培育基因编辑猴提供重要数据支持。研究结果如下:（1）MI,MI-MII和MII卵母细胞的ICSI受精卵的原核率、卵裂率和囊胚率,两两差异不显着。MI卵母细胞体外成熟后ICSI受精后胚胎的发育潜能与MII卵母细胞相当,但是MI卵母细胞直接ICSI受精的胚胎发育的潜能较其它组低。（2）SHANK3基因编辑猴冷冻-复苏精子与正常新鲜精子分别进行ICSI体外受精,冷冻-复苏精子受精后的胚胎在原核率、卵裂率和囊胚率的平均值均稍低于新鲜精子,但差异不显着;利用SHANK3基因编辑猴冷冻-复苏精子体外受精和胚胎移植已经成功获得子代。（3）冻精和鲜精ICSI受精卵在原核时期胞浆内注射基因编辑载体,除了冻精受精卵注射载体胚胎的囊胚率显着降低,其它组受精卵的卵裂率和囊胚率与对照组（未注射载体）差异均不显着。（4）4～8细胞时期胚胎透明带切割的PGD操作对胚胎囊胚形成无影响,且促使囊胚孵出。（5）冷冻-复苏囊胚移植成功妊娠并获得新生猴。冷冻-复苏胚胎的移植妊娠成功率与对照鲜胚的差异不显着,但是PGD胚胎冷冻-复苏的移植妊娠成功率较对照组显着降低。
李凤[4]（2018）在《外源谷胱甘肽通过γ-谷氨酰循环促进牛早期胚胎内GSH的合成》文中认为哺乳动物的胚胎在体外培养过程中会产生大量的活性氧自由基（ROS）,引起胚胎的氧化应激,过量ROS会破坏细胞的氧化还原平衡,导致DNA、蛋白质损伤以及脂质过氧化。添加抗氧化剂谷胱甘肽（GSH）可以清除胚胎内ROS,从而提高胚胎发育率和囊胚质量。然而GSH是如何发挥其抗氧化作用,并促进胚胎发育的机制并不清楚。本文旨在揭示外源GSH促进胚胎内GSH合成和促进胚胎发育的机制,为提高体外胚胎的生产效率提供切实的理论基础。试验一:牛体外受精胚胎分别于3 mM GSH、GSX和不含GSH（对照组）的培养液中培养7d,统计两组的卵裂率、囊胚率和囊胚总细胞数;采用荧光染色法和LC/MS法检测不同发育阶段受精卵中ROS和GSH含量;在培养液中添加GSX,利用LC/MS对受精卵内GSX含量变化进行跟踪检测。结果表明,外源添加GSH可显着降低胚胎内ROS含量（P<0.05）,提高囊胚率和囊胚总细胞数（P<0.05）。荧光染色法和LC/MS法均检测到各发育阶段的处理组受精卵中GSH的含量显着高于对照组（P<0.05）,且两组受精卵中GSH含量均随发育进程而呈现下降趋势。外源添加GSX后,处理组受精卵中GSH的含量显着升高（P<0.05）,而GSX含量较低,仅为GSH含量的1/5;且培养液中GSX的含量随培养时间的延长而持续下降。可见,外源GSH可清除胚胎中部分ROS,提高胚胎发育率和囊胚质量;LC/MS是定量分析GSH及其同位素标记物的可靠方法,可用于外源GSH影响胞内GSH合成和促进胚胎发育的机制研究。试验二:牛体外受精卵分别于3 mM GSH（处理组）或不含GSH（对照组）的培养液中培养32 h,比较两组胚胎间GSH合成相关酶的基因表达水平及酶活性。添加GSH后,GSS、GGT和GCLM基因表达水平显着升高,GGT活性显着升高（P<0.05）。5-OPase和GCLC基因在精卵共孵育24 h的处理组受精卵中表达量均显着低于对照组,其他时间段的处理组和对照组胚胎中没有显着差异（P>0.05）。添加GSH可提高胚胎内γ-谷氨酰循环途径中GSH合成相关酶的基因表达水平和GGT酶活性。试验三:GSH合成相关关键酶GCL和GGT的抑制剂BSO和Acivicin活性分别处理对照组和GSX组的胚胎,统计胚胎发育率,并检测不同发育阶段受精卵中的GSX和GSH含量。结果两种抑制剂均显着降低胚胎的卵裂率和囊胚率,抑制剂Acivicin处理后,早期胚胎甚至不能发育至囊胚阶段。另外,受精卵中GSX和GSH含量均显着下降,表明抑制GCL酶和GGT酶的活性会阻碍外源GSH对胞内GSH合成的促进作用。因此,外源GSH通过γ-谷氨酰循环诱导胚胎中GSH的重新合成。本文在牛胚胎培养液中添加GSH同位素标记物GSX(GSH-(Glycine-13C215N)),利用LC/MS对胚胎中GSH及GSX水平进行定量和追踪检测;对GSH合成相关酶的基因的表达水平进行分析并检测受精卵中GGT酶活性,以及对关键酶的抑制多方面探究外源GSH对促进胚胎发育的作用途径。
刘帅[5]（2015）在《猪卵胞质注射及单精子胞质内注射介导的转基因方法研究》文中提出卵胞质注射转基因（CI-MGT）具有操作简单、胚胎损伤小和胚胎体外停留时间短等优点,结合体内受精胚胎和高效基因编辑技术,最近被广泛应用于转基因动物生产中。单精子胞质内注射转基因（ICSI-MGT）适于大片段外源基因转移,并能有效解决猪体外受精胚胎多精子受精等问题,特别适用于转基因猪的生产。广西地处高温高湿的亚热带地区,为优化此种环境下猪胚胎和转基因技术体系,本研究在优化猪卵母细胞体外成熟、激活及胚胎培养条件的基础上,系统探讨了体外受精及孤雌激活胚胎CI-MGT和ICSI-MGT的相关影响因素,并对CI-MGT体外受精胚胎及ICSI-MGT胚胎生产转基因猪可行性进行了研究。研究结果如下：1.探讨了成熟液和胚胎培养液组分对猪卵母细胞成熟及胚胎发育效果的影响。结果显示,成熟基础液为TCM-199核成熟率和胚胎发育效率显着高于NCSU-37和PZM-3（P<0.05）。以TCM-199为成熟基础液,不加额外能量底物（PMt）的核成熟率和孤雌囊胚发育率分别为74.1土2.4%和29.3+1.3%,显着高于添加0.91 mmol/L丙酮酸钠+3.05 mmol/L葡萄糖（PMtsg）或0.91 mmol/L丙酮酸钠+3.05 mmol/L葡萄糖+0.1mg/mL谷氨酰胺（PMtsgg, P<0.05）。在成熟液中添加10 IU/mL eCG+15 IU/mL hCG组的核成熟率和胚胎发育效率显着高于添加0.5μg/mL FSH+0.5μg/mLLH或0.5μg/mL FSH+10 UI/mL hCG。成熟液中添加50 ng/mL EGF+10 ng/mL IGF-I组囊胚率显着高于添加10 ng/mL EGF和不添加组（P<0.05）。对猪卵母细胞体外成熟过程中核相变化研究显示,成熟培养38 h的核成熟率为57%（105/184）,40 h为43%（82/189）,42 h为48%（75/155）,44 h为59%（208/354）,46 h为70%（59/84）,48 h为62%（51/82）,50 h为74%（154/207）。在以PZM-3为基础液的胚胎培养液中添加0.277 mmol/L肌醇（PZMi）,其囊胚率显着高于添加0.34 mmol/L柠檬酸钠（PZMc）或0.34 mmol/L柠檬酸钠+0.277 mmol/L肌醇（PZMci, P<0.05）;添加0.5 mg/mL透明质酸组的囊胚率显着高于未添加组（P<0.05）；添加3 mg/mL BSA-FAF组的囊胚率显着高于添加BSA-V组（41.4士4.1%vs 36.7±3.8%,P<0.05）。培养液中BSA浓度增加至5 mg/mL或在培养96 h后加入10%FBS的囊胚率和囊胚孵化率均有所增加,但差异不显着。添加50 ng/mL IGF-I的囊胚率和囊胚细胞数高于未添加组,但差异不显着。2.探讨了激活方法对猪卵母细胞孤雌胚胎发育效果的影响。结果显示,卵母细胞经5 μmol/L离子霉素（Ion）激活5 min后,再分别在含2 mmol/L6-二甲基氨基嘌呤（6-DMAP）,5μg/mL细胞松弛素B （CB）+10放线菌酮（CHX）,5μg/mL CB+2 mmol/L 6-DMAP,5μg/mL CB+10μg/mL CHX+2 mmol/L 6-DMAP培养4 h的囊胚率显着高于在10μg/mL CHX培养4 h的囊胚率（29.7±1.1%、29.8±1.2%、30.4±1.6%和30.2±2.7%vs 15.8土1.5%,P<0.05）,但四组间囊胚率、ICM细胞数、TE细胞数及ICM/TE均无显着差异。当电脉电压为1.25KV/cm时3次电脉冲电激活的囊胚发育率显着高于2次电脉冲（P<0.05）,当电脉冲为3次时电场强度为0.80和1.00KV/cm的胚胎碎裂率显着低于1.20 KV/cm,且1.00 KV/cm组的囊胚率显着高于0.80和1.20 KV/cm组（P<0.05）。卵母细胞电激活后分别用5μg/mL CB+10 μg/mL CHX,5μg/mL CB+2 mmol/L 6-DMAP培养处理4 h的囊胚率（55.4±1.2%和50.4±2.9%）显着高于用2 mmol/L 6-DMAP （37.9±2.4%）,5 μg/mL CB+10 μg/mL CHX+2 mmol/L 6-DMAP （36.9±3.1%）培养处理4 h的囊胚发育率,亦显着高于单纯电激活处理（40.7±1.7%）和Ion激活后用2 mmol/L 6-DMAP （30.6±0.8%）培养处理4 h的囊胚发育率(P<0.05。电激活后,用5μg/mLCB培养处理4 h的囊胚率显着高于用5μg/mLCB培养处理4 h（54.0±4.1%vs 37.9±2.4%,P<0.05）,与7.5μg/mLCB组差异不显着,但7.5μg/mLCB组的ICM细胞数和ICM/TE均显着高于5 μg/mLCB组（P<0.05）。对胚胎核型进行分析结果表明,电激活后用7.5μg/mL CB+10 μg/mL CHX培养处理4 h的囊胚细胞二倍体率显着高于单纯电激活处理组（84.6% vs 40.0%,P<0.05）。3.研究了猪卵胞质内注射转基因的影响因素。孤雌激活卵胞质注射（PA-CI）的研究结果显示,注射外源RNA、外源RNA+1-4 U/μL RNA酶抑制剂对孤雌激活卵的囊胚率、ICM细胞数、TE细胞数及ICM/TE均无显着影响,表明可同时注射外源RNA和RNA酶抑制剂。注射100 ng/μL EGFP-N1 DNA的孤雌囊胚阳性率显着高于50 ng/μL和空注组,但囊胚率显着低于其余两组（33.9士1.1%vs 46.4±2.1%和50.5±1.9%,P<0.05）；注射100 ng/μL Talen-BMP15 RNA的囊胚率与50 ng/μL注射组和空注组差异不显着,表明注射DNA对胚胎毒性大于注射RNA。孤雌激活后5-18 h注射的囊胚率均显着低于注射后立刻激活或激活后立刻注射的囊胚率（P<0.05）。注射EGFP-N1线性化DNA的囊胚阳性率显着高于环状DNA（15.8±1.4%vs11.7±1.0%,P<0.05）,但两者胚胎发育率差异不显着,并且外源RNA注射组的囊胚率普遍高于注射DNA载体。当采用体外受精卵进行胞质内注射时（IVF-CI）,精卵孵育后5-18 h注射线性化EGFP-N1载体的囊胚率和囊胚细胞数差异均不显着,但5-6、8-9和11-12 h注射组胚胎阳性率显着高于14-15和17-18 h（12.6±0.6%,11.8土0.5%和13.6±0.6%vs 8.7±0.8%和6.5±1.0%,P<0.05）,表明外源DNA在猪雌雄原核形成期（约13 h）前注射的外源基因整合效率较高。注射40和50 ng/μL EGFP-N1 DNA组囊胚率显着高于100 ng/μL,与10、20、30ng/μL和空注组差异不显着,同时40、50和100 ng/pL组阳性率显着高于其余各组（P<0.05）。IVF卵注射GDF8 Cas9 mRNA/sgRNA的囊胚率显着低于PA卵（13.7±0.8%vs 52.6+3.1%,P<0.05）,但注射IVF卵的胚胎基因突变效率显着高于注射PA卵（25.0% vs3.8%,P<0.05）,表明Cas9/sgRNA系统可以通过注射猪IVF卵对猪的基因组进行编辑。4.系统研究了猪单精子胞质内注射转基因的影响因素。结果显示,10和20 ng/μL EGFP-N1 DNA与精子共孵育的囊胚率显着高于50和100 ng/μL（33.8±2.4%和31.0±0.9% vs 24.4±2.7和16.1±0.8%,P<0.05）,但20ng/μL孵育组胚胎阳性率显着高于10ng/μL（30.5±1.5%vs 16.3±1.5,P<0.05）。精子与外源基因孵育5、30和60 min囊胚率显着高于孵育24 h,但30和60 min组阳性率和囊胚阳性率显着高于5 min（P<0.05）。采用不同冷冻液（DPBS、 BTS和mNIM）冷冻精子对ICSI-MGT胚胎发育率无显着影响,但精子孵育液DPBS+EDTA （10 mmol/L EDTA）的囊胚率显着高于DPBS（27.8±0.7%vs 22.2±1.6%, P<0.05）, mNIM （10 mmol/L EDTA+123.0 mmol/L KCl）组的囊胚率显着高于DPBS+EDTA组（33.2±1.3%vs 27.8±0.7%,P<0.05）,表明孵育液中的EDTA和K+对注射后的胚胎发育有影响。精子超声+冻融处理和NaOH处理的囊胚率显着高于鲜精、A23187、超声、冻融和三次冻融处理组,超声+冻融和NaOH处理组的胚胎外源基因阳性率亦显着高于鲜精和A23187处理组。此外,卵母细胞激活后注射超声+冻融和NaOH处理精子的囊胚率显着高于激活前注射组（35.7±2.4%vs 30.2+0.6%；34.5±0.3% vs28.5±0.9%,P<0.05）,表明精子破膜与激活影响ICSI-MGT胚胎的发育。卵母细胞激活后0-30 min注射的囊胚率显着低于60-90 min注射组,但阳性率和囊胚阳性率均显着高于60-90 min注射组。对ICSI后不同时间合子内的GSH含量分析显示,激活后0-30 min注射组的6 h合子GSH含量显着低于60-90 min注射组和孤雌激活组（3.22±0.06 vs 5.02±0.09和4.73±0.14,P<0.05）,而60-90 min注射组的6 h和12 h合子GSH含量与孤雌组均无显着差异。进一步原核分析发现,0-30 min注射组的雌雄双原核形成率显着高于60-90 min（56.9±3.7% vs 36.3±2.0%,P<0.05）,且0-30min注射组精子解聚率显着高于60-90min,表明延长激活以后的注射时间会造成更高的孤雌胚胎产生。采用不同外源基因载体（EGFP-N1、Anti-FMDV. PRL-EGFP和IFN-EGFP）的ICSI-MGT囊胚率差异不显着,但显着影响胚胎阳性率,其中EGFP-N1线性化载体阳性率显着高于环状载体（35.9±0.2%vs20.9±0.9%,P<0.05）,而Anti-FMDV RNAi载体阳性率和囊胚阳性率均显着低于其它载体（P<0.05）。将Cas-GDF8、Anti-FMDV和EGFP-N1的ICSI-MGT胚胎移植入6头自然发情受体内,4头未见返情,其中7557号受体流产获得3头胎猪,7645号受体妊娠到期得到4头仔猪,对仔猪耳朵皮肤EGFP和Neo双基因进行PCR鉴定均显示阳性,表明应用优化的ICSI-MGT技术可以获得转基因猪后代。
朱化彬[6]（2011）在《奶牛体外胚胎生产技术的研究》文中进行了进一步梳理体外受精和体细胞克隆技术是提供牛胚胎移植胚胎来源的重要技术方法。本试验（论文）研究了影响牛体外性控胚胎影响因素（试验一）和体细胞克隆的影响因素（试验二）,研究了不同冷冻方法对牛体外受精和体细胞克隆胚胎ATP含量和ROS水平的影响（试验三）,利用实时定量PCR研究了马-牛异种体细胞克隆胚胎线粒体DNA情况（试验四）,得到以下试验结果:试验一:本实验研究了卵母细胞体外成熟后卵丘细胞脱除程度、种公牛个体以及性控精液受精滴体积、性控精子密度等对牛体外性控胚胎生产的影响。试验结果表明:1、卵丘细胞部分脱除组的卵裂率（67±4.74%）显着性高于不脱除组（41±2.23%）、完全脱除组（37.50±2.88%）（P<0.05）;2、种公牛B的性控精液进行体外受精,囊胚率（26.53±3.31%）要显着高于A公牛（17.65±3.65%）和C公牛（16.67±2.36%）（P<0.05）;3、50μL～100μL受精滴囊胚率（20.41±4.33%～23.38±4.47%）无显着性差异（P>0.05）,但显着性高于40μL、30μL的囊胚率（13.79±2.02%、12.12±3.73%）（P<0.05）;4、精子密度0.5×106个/ mL～1×106个/mL的囊胚率（22.58±2.17%～27.27±3.49%）相比无显着性差异（P>0.05）,但显着性高于0.3×106个/mL-1组的囊胚率（16.13±3.46%）（P<0.05）。试验二:本试验研究了奶牛克隆重构胚不同化学激活方法、克隆重构胚体外培养条件和公牛和母牛供体细胞等对奶牛手工克隆和显微注射克隆效率的影响。试验结果表明:（1）建立了优秀种公牛体细胞系20个,高产奶牛体细胞系4个;（2）A23187+6-DMAP和A23187+放线菌酮组合处理激活体细胞克隆重构胚卵裂率（82.62% VS 78.15%）和囊胚率（34.15% VS 30.21%）差异不显着,但是A23187+6-DMAP囊胚质量较好;（3）克隆重构胚在mCR1aa培养液卵裂率（83.65%）和囊胚率（34.36%）,均显着高于SOF和CR1aa两种培养液;（4）血清饥饿处理供体细胞的克隆重构胚融合率（90.52%±2.62）、卵裂率81.27%±3.68和囊胚率（31.46%±2.42）和接触抑制的克隆重构胚（89.25%±1.92）、（82.44%±4.42）、（30.44%±2.77）差异不显着;（5）种牛克隆胚胎移植妊娠率37.0%（10/27）,其中青年荷斯坦母牛移植妊娠率（46.2%）显着高于经产西门塔尔杂交受体母牛（28.6%）。西门答尔杂交受体母牛移植克隆胚胎后分别在妊娠的70～90d内流产,1头荷斯坦母牛妊娠受体101天后屠宰,1头荷斯坦母牛妊娠155天流产2个胎儿,1头荷斯坦妊娠149天流产2个胎儿。试验三:本实验采用常规法或玻璃化法（OPS法）冷冻保存牛IVF囊胚和SCNT囊胚,利用ATP Bioluminescence Assay Kit HS II和GENMED ROS Assay Kit检测冷冻-解冻后囊胚ATP含量和ROS水平。试验结果表明:1、IVF和SCNT囊胚OPS法冷冻-解冻后存活率（92.24±4.54%,78.71±5.91%）均显着高于常规冷冻法（81.56±2.33%、47.89±5.83%）（P<0.05）;2、IVF囊胚和SCNT囊胚OPS法冷冻-解冻后ATP含量（0.62±0.04 pmol, 0.30±0.01 pmol）均显着高于常规冷冻法（0.43±0.06 pmol, 0.21±0.02 pmol）（P<0.05）;但是均显着低于相应的IVF或SCNT对照组新鲜囊胚（0.74±0.05 pmol,0.39±0.01 pmol）;3、玻璃化冷冻IVF囊胚（72.14±4.31 cps）、SCNT囊胚（40.11±5.73 cps）ROS水平高于新鲜IVF囊胚（47.33±3.56 cps）、SCNT囊胚（26.44±1.49 cps）（P<0.05）,常规冷冻组则与此相反（34.41±3.32 cps vs.47.33±3.56 cps;15.46±2.45 cps vs.26.44±1.49 cps）（P<0.05）。试验四:本试验研究了手工克隆和显微注射方法对马-牛异种克隆效率的影响,利用实时荧光定量RT-PCR方法检测马-牛异种克隆胚胎不同发育阶段线粒体编码基因细胞色素B的转录水平。试验结果表明:（1）手工方法克隆马-牛异种重构胚融合率（95.12%）、卵裂率（97.07%）显着高于显微注射法的融合率（70.25%）和卵裂率（85.21%）,但两者之间的囊胚率差异不显着（2.64%±1.68 vs2.36%±1.59）;（2）供体马CYBT基因的表达水平在1-细胞期的重构胚中表达量最高,而在囊胚期,却没有检测到该基因的转录本。牛CYBT基因,在1-细胞期到8-细胞期,其表达量逐渐下降,而在16-细胞期的异种克隆胚中,该基因的表达量急剧升高到最高值,比1-细胞期增加了11倍,随后囊胚期表达水平锐减到为起始水平的2倍。
梁素丽[7]（2011）在《牛体细胞核移植重编程研究》文中指出体细胞核移植是将高度分化的体细胞移入去核的卵母细胞内,成功的体细胞核移植需要在很短的时间内消除原有的供体细胞的分化记忆,将供体细胞核重编程为全能的、胚胎化的状态,并接受卵胞质内的信息,表现出一种新的与胚胎发育密切相关的基因表达模式,这其中包括了复杂的表观遗传的改变。已分化的供体细胞在很短的时间内很难完成如此大量的工作,因此也就造成了核移植效率的低下。本文以研究牛体细胞核移植重构胚的重编程为目标,进行了Ca2+在牛卵母细胞成熟、体外受精（IVF）、孤雌激活（PA）及核移植（SCNT）胚胎发育过程中的分布规律及其动态变化的研究;探讨了MG-132对重构胚重编程的作用,研究了核纤层蛋白（lamin A/C）在PA、IVF和NT胚胎的表达情况,对比了Oct-4在SCNT和IVF胚胎发育过程中的表达变化。1.南阳牛耳源组织成纤维细胞的培养?以南阳牛耳缘组织为研究材料,体外培养了成纤维细胞,并对其进行了形态学、细胞生长动力学观察、染色体核型和乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶的同工酶分析及,作为后续研究的实验材料。2.南阳牛卵母细胞成熟和早期胚胎发育过程中Ca2+分布规律及其动态变化?采用激光扫描共聚焦显微镜对南阳牛卵母细胞成熟、IVF、PA及SCNT胚胎发育过程中Ca2+分布规律及其动态变化进行了全面的研究。Ca2+在GV期主要分布在卵皮质区域;GVBD期开始向细胞中心扩散;MⅠ期到MII期Ca2+均匀分布于整个细胞。Ca2+浓度从GV期开始不断上升,MⅠ期时达到最大,随后开始下降。IVF胚胎原核形成前Ca2+主要分布在卵皮质区域;原核形成后,Ca2+在整个细胞中都分布;随后Ca2+均匀分布于整个卵裂球中,至到囊胚期Ca2+明显降低,且分布不均匀,Ca2+荧光强度有明显的规律性变化;PA胚胎024 h Ca2+主要分布在卵皮质区;48 h左右时Ca2+在整个卵裂球中都有分布,在核区荧光强度稍强;4-细胞、8-细胞、桑葚胚时,Ca2+均匀分布于卵裂球中;囊胚时Ca2+分布不均匀;整个过程中Ca2+荧光强度变化没有明显规律;核移植24 h后Ca2+分布于供体细胞并均匀分布于胞质中;2-细胞、4-细胞、8-细胞中Ca2+均匀分布于各卵裂球中;桑葚胚和囊胚期Ca2+分布不均匀。整个过程Ca2+荧光强度变化呈明显的规律性变化。3. MG-132对牛SCNT重构胚重编程的影响?通过MG-132作用于SCNT全过程所得重构胚的发育情况,研究MG-132的作用,并通过免疫组化方法进行验证。5μmol/mL MG-132作用于MI期卵母细胞可有效阻止MPF活性的下降。未添加MG-132组,融合4 h后lamin A/C着色显着,说明染色体凝集不完全,添加组融合4 h后,核膜不完全着色,明显发生了染色体凝集。说明5μmol/mL MG-132就能够促进重构胚的重编程。在SCNT整个过程中添加5μmol/mL MG-132,通过对比lamin A/C在孤雌激活、IVF和核移植重构胚的表达,首先确定lamin A/C可以作为表征重编程的一个因素,其次lamin A/C在核移植重构胚的早期胚胎发育中几乎不表达,8-细胞期开始表达,囊胚期滋养层细胞中正常表达,但内细胞团中表达减弱,这一模式同IVF胚胎的表达模式相近,进一步证明MG-132的添加能够促进重构胚的重编程。4. Oct-4在SCNT重构胚中的表达应用激光扫描共聚焦显微镜研究显示,添加MG-132后,Oct-4在2-4细胞期几乎不表达,到8-16细胞期开始表达;到桑葚胚期和致密桑葚胚期Oct-4强表达;囊胚期Oct-4在内细胞团和滋养层细胞中都持续强表达;孵化囊胚期Oct-4的表达同囊胚期,并未见滋养层细胞中表达明显减弱,这一结果与IVF胚胎中Oct-4起始表达相同,但孵化囊胚期的表达略有不同。以上研究分析了Ca2+在牛卵母细胞成熟、IVF、PA和SCNT胚胎中的分布规律及其动态变化,有望通过进一步研究提高核移植激活效率,最终达到提高核移植效率的目的;lamin A/C可以作为表征核移植重编程的一个因素,MG-132用于核移植过程,并对重构胚的重编程具有促进作用,添加MG-132后Oct-4的起始表达与IVF胚胎相同。通过上述研究有望提高核移植效率。
闫真[8]（2009）在《间隙连接蛋白在绵羊早期胚胎中的表达和作用研究》文中研究指明大量研究证明,哺乳动物的细胞间通讯在胚胎着床前已经建立。间隙连接通道是相邻细胞之间唯一可以直接进行信息交流的细胞通讯途径。间隙连接蛋白基因（connexins）作为组成间隙连接通道的基本单位,在哺乳动物早期胚胎发育过程中广泛存在。由于connexins的多样性和时空表达的特异性,到目前为止关于相关特定基因在胚胎发育早期过程中的功能知之甚少。本研究主要采用RT-PCR、Real-time PCR、免疫组织化学和Westernblot等分子生物学技术,结合体外受精技术,检测connexins在绵羊卵母细胞和体外受精早期胚胎中表达的多样性以及connexin43和connexin45的表达规律；同时通过在胚胎单个卵裂球内注入小分子染料,观察间隙连接通讯在绵羊体外受精早期胚胎中的形成时间；并采用RNAi技术,对绵羊体外受精卵进行dsRNA注射,观察connexin43和connexin45在绵羊体外受精胚胎发育过程中的作用。一、RT-PCR方法检测多种间隙连接蛋白在绵羊体外受精胚胎中的表达从NCBI中获取六种间隙连接蛋白基因的cDNA序列并合成引物,用RT-PCR方法获得目的基因的部分cDNA序列,然后进行测序并通过序列比对以确定所获得的cDNA序列的正确性。在此基础上收集绵羊未成熟卵母细胞、成熟卵母细胞、2-细胞、8-细胞、桑椹胚以及囊胚,通过RT-PCR方法检测connexin26、connexin31、connexin32、connexin40、connexin43和connexin45等基因在绵羊未成熟卵母细胞、体外成熟卵母细胞、体外受精2-细胞、8-细胞、桑椹胚以及囊胚中的mRNA表达水平。结果发现,connexin26、connexin32、connexin43及connexin45在绵羊卵母细胞和早期胚胎发育的各个时期均有表达；但未检测到connexin31和connexin40转录子。二、Connexin 43 （Cx43）和connexin45 （Cx45）在绵羊卵母细胞和体外受精早期胚胎中转录子表达规律以及蛋白水平的检测1、Real-time PCR方法检测Cx43、Cx45在绵羊卵母细胞和体外受精胚胎中的表达对Cx43和Cx45在绵羊未成熟卵母细胞、体外成熟卵母细胞、体外受精2-细胞、8-细胞、桑椹胚和囊胚期胚胎分别进行Real-time PCR检测,结果显示：Cx43在未成熟卵母细胞、体外成熟卵母细胞、2-细胞中表达量较低,分别是8-细胞含量的0.11、0.3、0.44倍；到达桑椹胚和囊胚期时达到最高,为8-细胞含量的2.44和2.32倍；而Cx45在8-细胞时表达量最高,未成熟卵母细胞、成熟卵母细胞和2-细胞期的表达量分别为8-细胞期的0.43、0.72和0.82倍,桑椹胚和囊胚期胚胎的表达量分别为8-细胞期的0.93和0.89倍。2、免疫组化方法检测Cx43、Cx45在绵羊卵母细胞和体外受精胚胎中的表达对Cx43和Cx45在绵羊卵母细胞和体外受精胚胎中的表达进行免疫组化检测,结果发现：在绵羊未成熟卵母细胞、体外成熟的卵母细胞、体外受精的2-细胞、8-细胞、桑椹胚和囊胚等各个发育时期的胚胎中,Cx43、Cx45蛋白均有表达,并主要分布在细胞膜区域,在细胞质中分布很少,而在细胞核中未检测到。在对照组体内受精的胚胎中,Cx43和Cx45从2-细胞期到早期囊胚均有表达,两者表达部位均靠近细胞膜区域。体内受精胚胎和体外受精胚胎的表达模式基本一致,而Cx43和Cx45蛋白在体内受精胚胎中的表达量相对高一些。体内受精胚胎中转录子的含量往往高于体外受精胚胎,这是否是导致体内外受精胚胎在质量上有所不同的原因之一,尚有待进一步研究。3、蛋白印迹检测Cx43在绵羊卵母细胞和体外受精胚胎中的表达对绵羊未成熟和体外培养成熟的卵母细胞分别进行蛋白印迹检测结果发现,在未成熟和体外成熟的卵母细胞中Cx43蛋白均有表达,且蛋白电泳表现出两种磷酸化形式（P1和P2）和一种非磷酸化形式（P0）。Cx43在体外成熟卵母细胞中的蛋白表达量要高于未成熟卵母细胞。而在早期胚胎中检测结果,Cx43在2-细胞期、8-细胞期、桑椹胚期和囊胚期胚胎中均得到阳性条带,与免疫荧光染色结果完全一致。免疫印迹在膜上显示出三条带,与Cx43常规表达模式相同。胚胎在2-细胞期和8-细胞期时Cx43蛋白的磷酸化形式表达量略高于非磷酸化形式,到达桑椹胚期时非磷酸化形式含量有所增加。三、绵羊体外受精早期胚胎中间隙连接通讯的检测本实验通过显微注射技术与激光扫描共聚焦观察方法,将小分子荧光染料Lucifer yellow注射到发育到不同时期胚胎的单个卵裂球中,观察荧光染料向其它相邻卵裂球扩散情况。结果发现,注射到2-细胞、4-细胞、8-细胞、16-细胞及桑椹胚期胚胎卵裂球中的染料没有向相邻卵裂球扩散。可以推测,绵羊体外受精早期胚胎在发育早期并未建立间隙连接通讯。四、Cx43dsRNA、Cx45 dsRNA对绵羊体外受精胚胎发育的影响1、Cx43dsRNA、Cx45 dsRNA对目的基因mRNA和蛋白水平的影响将Cx43 dsRNA、Cx45 dsRNA和水分别注入绵羊体外受精卵,与未注射的空白对照组一起继续培养。通过Real-time PCR方法观察到,与对照组相比,当胚胎发育到囊胚期时Cx43mRNA和Cx45mRNA含量分别下降了74%和44%；而注水组的Cx43和Cx45 mRNA含量与未注射的对照组基本一致。同时检测到作为对照的β-actin基因、E-cadherin基因和Catenin基因的mRNA水平则在各组中基本保持一致,表明体外合成的dsRNA并未对其它对照基因mRNA的表达产生影响,能够特异而有效的降低目的基因的mRNA水平。对囊胚期胚胎进行蛋白印迹实验表明,与未注射对照组相比,向体外受精卵中注射Cx43的dsRNA能够使得Cx43dsRNA注射组中的Cx43蛋白含量下降。免疫组织化学方法结果显示,与未注射对照组相比,注射Cx43 dsRNA和Cx45 dsRNA后一定时间后,目的基因的蛋白表达均有不同程度的下降,并能够维持到囊胚期。因此,向绵羊体外受精卵中注射Cx43和Cx45 dsRNA能够使目的基因的mRNA及蛋白含量下降并持续到囊胚期。2、Cx43dsRNA、Cx45 dsRNA对绵羊体外受精胚胎卵裂率的影响。Cx43dsRNA、Cx45 dsRNA注射48小时后胚胎发育情况是：在Cx43 dsRNA处理试验中dsRNA注射组、水注射组和未注射组的总卵裂率分别为83.7%、84.5%和81.5%；其中2-细胞期胚分别为5.6%、4.7%和4.6%,4-细胞期胚分别是14.6%、10.8%和10.3%,8-细胞期胚分别是64.5%、68.9和66.6%；在Cx45处理实验中dsRNA注射组、水注射组和未注射组的总卵裂率分别为81.7%、76.9%和77.5%;其中2-细胞期胚分别为7.6%、3.6%和3.8%；4-细胞期胚分别是13.9%、11.6%和7.2%；8-细胞期胚分别是60.3%、61.8%、66.5%。通过统计学方法分析以上结果可以看出,dsRNA处理组与水注射组和未注射组之间总卵裂率及8-细胞期发育率无显着差异（P＞0.05）,表明对Cx43或Cx45基因进行RNA干涉并不影响绵羊体外受精卵的早期发育。3、Cx43dsRNA、Cx45 dsRNA的注射对绵羊体外受精胚胎囊胚发育率的影响。Cx43dsRNA、Cx45 dsRNA注射后体外受精卵的囊胚发育情况是：在Cx43处理实验中dsRNA注射组、水注射组和未注射组的囊胚发育率分别为20.3%、21.7%和34.5%,囊胚孵化率分别是19.2%、37.5%、41.3%,囊胚细胞数分别为76、74、83,囊胚细胞死亡数和死亡率分别为18.7（24.6%）、11.7（15.4%）、15.1（18.2%）；在Cx45处理实验组dsRNA注射组、水注射组和未注射组的囊胚发育率分别为20.8%、19.4%和32.5%,囊胚孵化率分别是18.5%、25.0%和34.9%；囊胚细胞数分别为79、71和72；囊胚细胞死亡数和死亡率分别为16.7（21.1%）、12.7（17.9%）、11.3（15.7%）。通过统计学分析可以看出Cx43 dsRNA处理组的囊胚发育率和囊胚细胞数与未处理组相比差异不显着（P＞0.05）；而囊胚孵化率显着高于未处理组（P＜0.01）,且囊胚细胞死亡率也略高于未处理组。Cx45 dsRNA处理组的囊胚发育率、囊胚细胞数、囊胚孵化率与对照组相比差异不显着（P＞0.05）。表明Cx43 dsRNA处理并不能影响绵羊体外受精胚的囊胚发育率,但可能对囊胚质量有一定的影响；Cx45 dsRNA处理并不影响绵羊体外受精胚的囊胚发育率及囊胚质量。
丁向彬[9]（2008）在《牛体细胞核移植胚胎表观遗传修饰研究》文中指出体细胞核移植的成功说明了高度分化的细胞仍具有支持发育的全能性,卵母细胞胞质中存在着将分化体细胞重编程至多能胚胎细胞状态的全部因子。但是,体细胞核移植的成功率却非常低,而且克隆动物存在不同程度的发育缺陷。目前普遍认为,体细胞核移植的低成功率以及发育异常和供体细胞核的不完全表观遗传重编程有关。DNA甲基化和组蛋白乙酰化是哺乳动物主要的表观遗传修饰形式,是调节基因组功能的重要手段,在胚胎的正常发育过程中具有显着的调控作用。本文对牛体外受精（IVF）胚胎和体细胞核移植（SCNT）胚胎附植前各个发育阶段的DNA甲基化和组蛋白乙酰化状态进行分析,找出体细胞克隆胚胎在基因组甲基化和组蛋白乙酰化水平上与IVF胚胎的差异,研究表观遗传状态对克隆胚体外发育能力的影响。1.研究卵母细胞成熟培养液中添加表皮生长因子（EGF）和胰岛素（Insulin）对其体外发育的影响,精子的不同处理方法对卵泡卵母细胞体外受精的影响以及细胞共培养系统对体外受精胚胎体外发育的影响。结果表明,成熟培养液中添加30 ng/mL EGF可以显着提高卵母细胞的成熟率和受精后的卵裂率;精子经上浮法处理后可以得到较高的卵裂率和囊胚发育率;输卵管上皮细胞共培养可以显着提高受精后的囊胚发育率,可以用于牛IVF胚胎的体外培养。2.探讨了不同激活方法对牛核移植胚胎激活效果和体外发育的影响,以及细胞共培养体系对牛体细胞核移植胚胎体外发育的影响。结果表明,5μmol/L离子霉素联合2mmol/L 6-DMAP激活牛核移植胚胎的效果比较好,可以得到较高的卵裂率和囊胚发育率;输卵管上皮细胞饲养层共培养可以显着提高重构胚的囊胚发育率,比较适合作为体细胞核移植胚胎发育的共培养体系。3.采用免疫荧光染色技术,对牛IVF胚胎和SCNT胚胎附植前各个发育阶段的DNA甲基化和组蛋白乙酰化状态进行检测,研究克隆胚胎在基因组甲基化和组蛋白乙酰化水平上与IVF胚胎的差异。结果表明,克隆胚胎各个发育阶段DNA甲基化水平均高于体外受精胚胎,其中2-细胞到桑椹胚阶段甲基化水平显着高于IVF胚胎,从头甲基化时间提前;克隆胚胎4-细胞到囊胚阶段乙酰化水平低于体外受精胚胎,其中8-细胞阶段乙酰化水平显着低于体外受精胚胎。与体外受精胚胎相比,牛核移植胚胎附植前各阶段存在异常的DNA甲基化和组蛋白乙酰化模式。4.用DNA甲基化酶抑制剂（5-aza-dC）处理牛供体细胞和克隆胚胎,探讨DNA甲基化水平变化与克隆胚胎体外发育之间的关系。结果表明,低浓度的5-aza-dC（20nM,72h）处理供体细胞或者重构胚不能显着提高克隆胚胎的体外发育率,对克隆胚的表观遗传状态没有明显影响;而供体细胞和重构胚均用低浓度5-aza-dC（20nM,72h）处理可以显着提高囊胚发育率和囊胚细胞数,2-细胞阶段DNA甲基化水平降低,8-细胞阶段的DNA甲基化水平显着降低且与IVF胚胎相比差异不再显着,但组蛋白乙酰化水平没有明显改变。说明克隆胚胎DNA甲基化水平影响其体外发育,降低2-细胞和8-细胞阶段的DNA甲基化水平可以提高克隆胚胎的体外发育能力。5.用组蛋白去乙酰化酶抑制剂（TSA）处理牛供体细胞和克隆胚胎,探讨组蛋白乙酰化变化与克隆胚胎体外发育的关系。结果表明,供体细胞经50nM TSA处理12h可以显着提高克隆胚胎的囊胚发育率,而且2-细胞阶段的组蛋白乙酰化水平升高;TSA处理重构胚不能显着提高克隆胚胎的体外发育率,对重构胚的表观遗传状态没有显着影响;供体细胞和重构胚均用低浓度TSA（50nM,12h）处理可以显着提高克隆胚胎的囊胚发育率,8-细胞阶段的组蛋白乙酰化水平显着增加且与IVF胚胎相比差异不再显着,但TSA处理对DNA甲基化水平没有明显影响。说明克隆胚胎组蛋白乙酰化水平影响其体外发育,增加2-细胞和8-细胞阶段组蛋白乙酰化水平可以提高克隆胚胎的体外发育能力。6.联合应用5-aza-dC和TSA处理牛供体细胞和重构胚,研究两种试剂联合处理对重构胚发育的影响,以及对重构胚甲基化水平和乙酰化水平的影响。结果表明,5-aza-dC（20nM, 72h）联合TSA（50nM, 12h）处理供体细胞和重构胚可以更明显的提高克隆胚胎的体外发育能力,联合处理不但显着降低了2-细胞和8-细胞阶段DNA甲基化水平,而且显着增加了组蛋白的乙酰化水平,从而使克隆胚附植前各发育阶段的表观遗传状态更接近与体外受精胚胎。说明异常的DNA甲基化和组蛋白乙酰化模式不利于克隆胚的体外发育,消除这种异常可以提高克隆胚的体外发育能力。进一步的实验表明,5-aza-dC和TSA对核移植胚胎体外发育的影响没有供体细胞特异性。
易康乐[10]（2008）在《Figla和BDNF对猪和牛卵母细胞及早期胚胎生长发育的影响》文中提出本研究系统评述了目前哺乳动物卵泡和卵母细胞发生分子调控机制的研究进展,探讨了生殖系a因子（Figla）和脑源性神经生长因子（BDNF）在猪和牛卵母细胞和胚胎的表达情况,进一步优化了猪和牛早期胚胎的体外培养体系。研究中首次克隆获得牛生殖系a因子全长cDNA序列585bp,编码194个氨基酸的成熟蛋白,其功能保守区与小鼠、人和类人猿等哺乳动物的同源性达到了90%以上;优化了SYBR Green I实时荧光定量PCR技术,使之能对牛和猪卵母细胞和早期胚胎中相关基因的表达进行较为准确的检测分析,从而使对微量材料进行大量的基因表达分析成为现实;首次证实了Figla和BDNF在猪和牛的卵母细胞和早期胚胎中均有表达,且BDNF在牛体细胞核移植囊胚中的表达量要显着低于体外受精和孤雌激活的囊胚;以现有培养体系为基础,添加BDNF可促进猪和牛体外培养的早期胚胎的发育。而添加神经生长因子（NGF）可促进牛体外培养的早期胚胎的发育。
二、牛体外受精卵5～10细胞期单一卵裂球染色体诊断（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、牛体外受精卵5～10细胞期单一卵裂球染色体诊断（论文提纲范文）
（1）组蛋白甲基转移酶ASH1L在牛卵丘细胞及胚胎中的表达和功能（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 表观遗传修饰 |
| 1.1.1 DNA甲基化 |
| 1.1.2 组蛋白修饰 |
| 1.2 PRC2蛋白 |
| 1.3 三胸腔结构蛋白质组(TrxG) |
| 1.4 组蛋白甲基转移酶ASH1L |
| 1.4.1 ASH1L甲基转移酶的晶体结构 |
| 1.4.2 ASH1L甲基转移酶功能 |
| 1.5 研究目的与意义 |
| 第二章 ASH1L甲基转移酶在牛卵丘细胞中的表达与功能研究 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 设备及耗材 |
| 2.1.3 主要溶液及其配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 牛卵丘细胞培养 |
| 2.2.2 siRNA的设计与合成 |
| 2.2.3 牛卵丘细胞的转染 |
| 2.2.4 实时荧光定量PCR |
| 2.2.5 牛卵丘细胞的免疫荧光染色 |
| 2.2.6 蛋白质免疫印迹 |
| 2.2.7 数据分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 牛卵丘细胞的培养 |
| 2.3.2 Ash1L基因及其蛋白在牛卵丘细胞中的表达 |
| 2.3.3 牛卵丘细胞的H3K36甲基化修饰状态 |
| 2.3.4 牛Ash1L基因有效si RNA序列的筛选及干扰效率检测 |
| 2.3.5 干扰Ash1L基因对牛卵丘细胞中H3K36 甲基化状态的影响 |
| 2.3.6 干扰Ash1L基因对细胞凋亡的影响 |
| 2.3.7 干扰Ash1L基因对凋亡相关基因表达的影响 |
| 2.3.8 干扰Ash1L基因对PRC2 蛋白基因表达的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 ASH1L甲基转移酶在牛体外受精胚胎中的表达及功能研究 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 设备及耗材 |
| 3.1.3 主要溶液及其配制 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 牛早期胚胎的制备 |
| 3.2.2 牛早期胚胎siRNA注射 |
| 3.2.3 引物设计与荧光定量PCR |
| 3.2.4 免疫荧光染色 |
| 3.2.5 数据分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 Ash1L基因及其蛋白在牛卵母细胞及早期胚胎中的表达 |
| 3.3.2 牛卵母细胞及早期胚胎中H3K36甲基化修饰状态 |
| 3.3.3 牛胚胎中Ash1L siRNA干扰效果的验证 |
| 3.3.4 干扰Ash1L基因对牛早期胚胎发育的影响 |
| 3.3.5 干扰Ash1L基因对囊胚质量的影响 |
| 3.3.6 干扰Ash1L基因对牛早期胚胎多能性基因表达水平的影响 |
| 3.3.7 干扰Ash1L基因对PRC2 蛋白亚基基因的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 牛ASH1L甲基转移酶靶基因的预测 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 设备及耗材 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 RNA提取 |
| 4.2.2 建库测序 |
| 4.2.3 数据质量预处理及分析 |
| 4.2.4 引物设计与荧光定量PCR |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 测序数据质量统计与检测 |
| 4.3.2 参考基因组比对 |
| 4.3.3 干扰组与对照组相关性检验 |
| 4.3.4 两组之间差异基因可视化分析 |
| 4.3.5 差异基因的GO注释及KEGG分析 |
| 4.3.6 干扰组与对照组间差异基因表达 |
| 4.3.7 差异表达基因RT-qPCR验证 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（2）基于转录组学鉴定荷斯坦青年母牛繁殖力性状相关基因及机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 荷斯坦牛繁殖力研究进展 |
| 1.1.1影响荷斯坦牛繁殖力的相关因素 |
| 1.1.2 影响荷斯坦牛繁殖力的遗传因素 |
| 1.2 荷斯坦牛早期隐性流产机理 |
| 1.2.1 荷斯坦牛早期胚胎发育过程 |
| 1.2.2 影响早期隐性流产的因素 |
| 1.3 荷斯坦牛繁殖力性状分子育种研究进展 |
| 1.4 差异基因研究方法 |
| 1.4.1 mRNA差别显示技术 |
| 1.4.2 抑制性消减杂交技术 |
| 1.4.3 代表性差异分析 |
| 1.4.4 基因表达系列分析 |
| 1.4.5 转录组测序技术 |
| 1.5 本研究的内容、目的意义 |
| 第二章 荷斯坦青年母牛孕酮分泌范型建立 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 主要仪器设备及试剂 |
| 2.1.3 试验方法 |
| 2.1.4 荷斯坦青年母牛孕酮分泌范型建立 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 正常妊娠组孕酮分泌范型 |
| 2.2.2 其它典型孕酮分泌范型 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 荷斯坦青年母牛作为试验对象的稳定性 |
| 2.3.2 孕酮作为早期怀孕诊断指征的理论基础 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 荷斯坦青年母牛繁殖力分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 试验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 早期隐性流产0-23天判定 |
| 3.2.2 早期隐性流产30-60天判定 |
| 3.2.3 荷斯坦青年母牛繁殖力公牛因素分析 |
| 3.2.4 荷斯坦青年母牛繁殖力分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 公牛因素与母牛繁殖力 |
| 3.3.2 早期黄体发育与母牛繁殖力 |
| 3.3.3 母-胎界面对奶牛繁殖力的影响 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 早期隐性流产转录组研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验动物与分组 |
| 4.1.2 白膜层细胞的固定 |
| 4.1.3 主要仪器设备及试剂 |
| 4.1.4 总RNA提取、纯化与检测 |
| 4.1.5 cDNA文库建设与测序 |
| 4.1.6 生物信息学分析 |
| 4.1.7 差异基因荧光定量PCR验证 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 总RNA的提取与检测 |
| 4.2.2 生物信息学分析结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 外周血进行转录组学研究的可行性 |
| 4.3.2 黄体退化分子调控 |
| 4.3.3 荷斯坦牛神经胚阶段 |
| 4.3.4 荷斯坦牛早期胚胎的附植 |
| 4.3.5 早期隐性流产作为繁殖性状指标的可行性 |
| 4.4 小结 |
| 笫五章 结论 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 下一步工作 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录一 测序错误率分布图 |
| 个人简历 |
（3）食蟹猴胚胎操作中若干技术效率的分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词或符号表 |
| 1 前言 |
| 1.1 转基因动物制备目的及意义 |
| 1.2 动物转基因的研究方法 |
| 1.2.1 逆转录病毒感染法 |
| 1.2.2 显微注射法 |
| 1.2.3 胚胎干细胞法 |
| 1.2.4 精子载体法 |
| 1.2.5 体细胞核移植方法 |
| 1.3 转基因动物进展 |
| 1.3.1 转基因小鼠 |
| 1.3.2 转基因大鼠 |
| 1.3.3 转基因兔 |
| 1.3.4 转基因猪 |
| 1.3.5 转基因非人灵长类 |
| 1.4 基因修饰技术 |
| 1.4.1 锌指核酸酶技术 |
| 1.4.2 转录激活子样效应物核酸酶技术 |
| 1.4.3 CRISPR-Cas核酸酶技术 |
| 1.5 生殖细胞的冷冻保存 |
| 1.5.1 细胞冷冻基本原理 |
| 1.5.2 冷冻制冻剂 |
| 1.5.3 细胞冷冻损伤 |
| 1.5.4 冷冻保护剂 |
| 1.6 精液冷冻保存技术 |
| 1.6.1 精液冷冻意义 |
| 1.6.2 精液的采集方法 |
| 1.6.3 精子冷冻方法 |
| 1.6.4 精子冷冻程序 |
| 1.6.5 冷冻对精子的损伤 |
| 1.7 卵子冷冻保存技术 |
| 1.7.1 卵子冷冻意义 |
| 1.7.2 卵子冷冻方法 |
| 1.7.3 卵子冷冻损伤 |
| 1.8 胚胎冷冻保存技术 |
| 1.8.1 胚胎冷冻意义 |
| 1.8.2 胚胎冷冻损伤 |
| 1.8.3 胚胎冷冻保护剂 |
| 1.8.4 胚胎冷冻方法 |
| 1.8.5 胚胎复苏方法 |
| 1.9 辅助生殖技术 |
| 1.9.1 体外受精技术 |
| 1.9.2 胞质内单精子注射技术 |
| 1.9.3 胚胎植入前遗传学诊断或筛查 |
| 1.10 哺乳动物体细胞核移植技术 |
| 1.11 本论文研究目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 主要仪器与耗材 |
| 2.2.2 试剂 |
| 2.2.3 主要试剂的配制 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 食蟹猴超数排卵 |
| 2.3.2 腹腔镜微创手术取卵 |
| 2.3.3 卵母细胞的收集 |
| 2.3.4 精液采集 |
| 2.3.5 精子冷冻保存和解冻复苏 |
| 2.3.6 食蟹猴卵胞质内单精注射 |
| 2.3.7 原核时期显微注射基因修饰载体 |
| 2.3.8 食蟹猴胚胎培养 |
| 2.3.9 食蟹猴透明带切割及囊胚活检 |
| 2.3.10 食蟹猴胚胎冷冻 |
| 2.3.11 食蟹猴胚胎冻存及复苏 |
| 2.3.12 食蟹猴胚胎移植 |
| 3 数据统计分析 |
| 4 结果 |
| 4.1 MI卵母细胞成熟与受精的发育潜能 |
| 4.2 冷冻精子对胚胎发育的影响 |
| 4.3 原核期注射载体对胚胎的影响 |
| 4.3.1 鲜精ICSI受精原核时期注射载体对胚胎发育的影响 |
| 4.3.2 原核注射和胞浆注射载体对胚胎发育的影响 |
| 4.3.3 冻精ICSI受精胚胎原核时期注射载体对胚胎的发育影响 |
| 4.4 PGD和冷冻对胚胎的影响 |
| 4.4.1 透明带切割对囊胚形成的影响 |
| 4.4.2 PGD和冷冻对胚胎发育的影响 |
| 5 讨论 |
| 5.1 食蟹猴卵母细胞的资源利用 |
| 5.2 食蟹猴冷冻-复苏精子受精效率 |
| 5.3 载体注射对胚胎发育影响 |
| 5.4 透明带切割对胚胎发育进程的影响 |
| 5.5 PGD和冷冻技术对胚胎着床的影响 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
（4）外源谷胱甘肽通过γ-谷氨酰循环促进牛早期胚胎内GSH的合成（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 胚胎的早期发育 |
| 1.2 胚胎发育中的活性氧 |
| 1.3 谷胱甘肽的生物合成及代谢 |
| 1.3.1 谷胱甘肽的生物学作用 |
| 1.3.2 生物体内谷胱甘肽的合成途径 |
| 1.3.3 谷胱甘肽的转运途径 |
| 1.4 胚胎发育中谷胱甘肽的作用 |
| 1.4.1 胚胎发育中的谷胱甘肽 |
| 1.4.2 谷胱甘肽促进体外胚胎的发育 |
| 1.5 液相色谱-质谱联用技术 |
| 1.6 研究目的与意义 |
| 第二章 谷胱甘肽及其同位素标记物对牛体外胚胎发育的影响 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验仪器和设备 |
| 2.1.2 试验材料 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 主要溶液的配制 |
| 2.2.2 体外受精胚胎的制备 |
| 2.2.3 囊胚细胞染色 |
| 2.2.4 胚胎内ROS含量的检测 |
| 2.2.5 荧光染色法检测胚胎中GSH含量 |
| 2.2.6 液质联用仪检测胚胎中GSH和GSX含量 |
| 2.2.7 数据处理与统计分析 |
| 2.3 结果及分析 |
| 2.3.1 外源GSH和GSX对牛体外受精胚胎发育的影响 |
| 2.3.2 外源GSH对胚胎内ROS含量的影响 |
| 2.3.3 LC/MS法测定GSH或GSX的标准曲线的建立 |
| 2.3.4 外源GSH对受精卵及胚胎内GSH含量的影响 |
| 2.3.5 外源GSX对胚胎内GSH、GSX及培养液中GSX含量的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 牛胚胎中谷胱甘肽合成相关酶的mRNA表达水平和酶活性分析 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 试验仪器 |
| 3.1.2 试验材料及试剂 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 体外胚胎的制备方法同第二章。 |
| 3.2.2 实时荧光定量PCR |
| 3.2.3 GGT酶活的测定 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 GSH合成相关酶基因在对照组受精卵和胚胎中的mRNA表达 |
| 3.3.2 GSH合成相关酶基因在处理组受精卵和胚胎中的mRNA表达 |
| 3.3.3 GSH合成相关酶在对照组和处理组胚胎间的基因表达 |
| 3.3.4 GGT酶的活性分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 GCL和GGT抑制剂对胚胎内GSH合成的影响 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 牛体外受精胚胎的制备: |
| 4.2.2 抑制剂处理牛体外受精胚胎 |
| 4.3 结果及分析 |
| 4.3.1 GCL酶抑制剂BSO对胚胎体外发育的影响 |
| 4.3.2 抑制剂BSO对受精卵和胚胎中GSH和GSX含量的影响 |
| 4.3.3 GGT酶抑制剂Acivicin对胚胎体外发育的影响 |
| 4.3.4 抑制剂Acivicin对受精卵及胚胎中GSH和GSX含量的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（5）猪卵胞质注射及单精子胞质内注射介导的转基因方法研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 卵母细胞成熟、激活与胚胎培养 |
| 1.1 卵母细胞成熟 |
| 1.2 卵母细胞激活 |
| 1.3 早期胚胎发育 |
| 2 卵胞质注射转基因 |
| 2.1 卵胞质注射研究进展 |
| 2.2 卵胞质注射转基因机理 |
| 2.3 卵胞质注射影响因素 |
| 3 单精子胞质内注射转基因 |
| 3.1 精子载体法 |
| 3.2 单精子胞质内注射 |
| 4 本论文的研究意义 |
| 第二章 猪卵母细胞体外成熟与胚胎培养影响因素研究 |
| 摘要 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与试剂 |
| 1.2 仪器与设备 |
| 1.3 试剂配制 |
| 1.4 试验方法 |
| 1.5 试验设计 |
| 1.6 数据统计分析 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 猪卵母细胞体外成熟影响因素研究 |
| 2.2 猪胚胎培养影响因素研究 |
| 3 分析与讨论 |
| 3.1 猪卵母细胞体外成熟影响因素研究 |
| 3.2 猪胚胎培养影响因素研究 |
| 4 结论 |
| 第三章 猪卵母细胞孤雌激活方法研究 |
| 摘要 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与试剂 |
| 1.2 仪器与设备 |
| 1.3 试剂配制 |
| 1.4 试验方法 |
| 1.5 试验设计 |
| 1.6 数据统计分析 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 猪卵母细胞化学激活方法的初步研究 |
| 2.2 猪卵母细胞电激活方法的初步研究 |
| 2.3 猪卵母细胞电激活联合化学激活方法的初步研究 |
| 3 分析与讨论 |
| 3.1 猪卵母细胞化学激活方法的初步研究 |
| 3.2 猪卵母细胞电激活方法的初步研究 |
| 3.3 猪卵母细胞电激活联合化学激活方法的初步研究 |
| 4 结论 |
| 第四章 猪卵胞质注射转基因影响因素研究 |
| 摘要 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与试剂 |
| 1.2 仪器与设备 |
| 1.3 试剂配制 |
| 1.4 试验方法 |
| 1.5 试验设计 |
| 1.6 数据统计分析 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 孤雌激活和IVF方法的完善 |
| 2.2 孤雌卵胞质注射转基因方法的初步研究 |
| 2.3 受精卵胞质注射转基因方法的初步研究 |
| 3 分析与讨论 |
| 3.1 孤雌激活和IVF方法的完善 |
| 3.2 孤雌卵胞质注射转基因方法的初步研究 |
| 3.3 受精卵胞质注射转基因方法的初步研究 |
| 4 结论 |
| 第五章 猪单精子胞质内注射转基因影响因素研究 |
| 摘要 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与试剂 |
| 1.2 仪器与设备 |
| 1.3 试剂配制 |
| 1.4 试验方法 |
| 1.5 试验设计 |
| 1.6 数据统计分析 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 不同激活方法对猪ICSI胚胎发育的影响 |
| 2.2 不同外源基因浓度对猪ICSI胚胎发育能力及转基因效率的影响 |
| 2.3 精子与外源基因孵育时间对猪ICSI胚胎发育能力及转基因效率的影响 |
| 2.4 不同精子冷冻液和孵育液对猪ICSI胚胎发育能力及转基因效率的影响 |
| 2.5 不同精子处理方法和激活方法对猪ICSI胚胎发育能力及转基因效率的影响 |
| 2.6 激活后精子注射时间对猪ICSI胚胎发育能力及转基因效率的影响 |
| 2.7 激活后精子注射时间对不同发育时间合子内谷胱甘肽含量的影响 |
| 2.8 激活后精子注射时间对猪ICSI胚胎原核形成的影响 |
| 2.9 不同外源基因载体对ICSI胚胎发育能力及转基因效率的影响 |
| 2.10 单精子卵胞质注射胚胎的体内发育 |
| 3 分析与讨论 |
| 3.1 不同激活方法对猪ICSI胚胎发育的影响 |
| 3.2 不同外源基因浓度对猪ICSI胚胎发育能力及转基因效率的影响 |
| 3.3 精子与外源基因孵育时间对猪ICSI胚胎发育能力及转基因效率的影响 |
| 3.4 不同精子冷冻液和孵育液对猪ICSI胚胎发育能力及转基因效率的影响 |
| 3.5 精子处理和激活对猪ICSI胚胎发育能力及转基因效率的影响 |
| 3.6 激活后精子注射时间对猪ICSI胚胎发育能力及转基因效率的影响 |
| 3.7 不同外源基因载体对ICSI胚胎发育能力及转基因效率的影响 |
| 3.8 单精子卵胞质注射胚胎的体内发育 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（6）奶牛体外胚胎生产技术的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Summary |
| 引言 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 牛卵母细胞体外受精技术研究新进展 |
| 前言 |
| 1.1 影响牛卵母细胞体外受精效率的主要因素 |
| 1.2 牛卵母细胞体外受精技术研究新进展 |
| 1.3 奶牛体外性控胚胎生产 |
| 1.4 其他研究进展 |
| 1.5 牛卵母细胞体外受精存在的问题及对策 |
| 第二章 动物体细胞克隆研究进展 |
| 前言 |
| 2.1 体细胞克隆技术研究的主要成就 |
| 2.2 体细胞克隆技术程序与方法 |
| 结语 |
| 第二部分 试验研究部分 |
| 第一章 奶牛体外性控胚胎生产影响因素的研究 |
| 1.1 材料和方法 |
| 1.2 结果与分析 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 结论 |
| 第二章 奶牛体细胞克隆技术的研究 |
| 前言 |
| 2.1 试验材料与方法 |
| 2.2 试验结果与分析 |
| 2.3 讨论 |
| 结论 |
| 第三章 不同冷冻方法对牛体外胚胎ATP 含量与ROS 水平的影响 |
| 3.1 试验材料与试验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 结论 |
| 第四章 马-牛异种克隆胚胎线粒体遗传分析 |
| 前言 |
| 4.1 试验材料与试验方法 |
| 4.2 试验结果 |
| 4.3 讨论 |
| 结论 |
| 第五章 全文结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
| 导师简介 |
（7）牛体细胞核移植重编程研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 体细胞核移植技术的研究进展 |
| 1.1 哺乳动物胚胎细胞核移植研究进展 |
| 1.2 体细胞核移植研究进展 |
| 1.3 核移植程序研究 |
| 1.3.1 供体细胞的选择 |
| 1.3.2 受体细胞的准备和去核 |
| 1.3.3 体细胞核移植 |
| 1.3.4 重构胚激活 |
| 1.3.5 重构胚培养与移植 |
| 第二章 体细胞核移植重编程 |
| 2.1 DNA 甲基化及其在胚胎发育中的作用 |
| 2.1.1 DNA 甲基化 |
| 2.1.2 DNA 甲基化在胚胎发育中的作用 |
| 2.2 组蛋白修饰作用 |
| 2.2.1 组蛋白甲基化 |
| 2.2.2 组蛋白乙酰化 |
| 2.3 Ca~(2+)在卵母细胞成熟、激活及胚胎发育中的作用 |
| 2.3.1 Ca~(~(2+))与卵母细胞成熟 |
| 2.3.2 Ca~(2+)与卵母细胞激活 |
| 2.4 核移植过程中核重编程的蛋白酶 |
| 2.5 核移植重构胚中核纤层蛋白变化 |
| 2.6 核移植重构胚中Oct-4 的表达 |
| 试验研究 |
| 第三章 南阳牛耳缘成纤维细胞的体外培养及其生物学特性研究 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 样品来源 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 主要试剂配制 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 原代培养 |
| 3.2.2 传代培养 |
| 3.2.3 细胞冻存与复苏 |
| 3.2.4 细胞活率计算 |
| 3.2.5 生长曲线 |
| 3.2.6 染色体分析 |
| 3.2.7 同工酶酶谱分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 原代和传代细胞形态学观察 |
| 3.3.2 细胞冻存前及复苏后细胞活率 |
| 3.3.3 细胞生长的动态观察 |
| 3.3.4 细胞染色体分析 |
| 3.3.5 细胞同工酶酶谱分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 成纤维细胞的体外培养 |
| 3.4.2 染色体分析 |
| 3.4.3 同工酶分析 |
| 3.5 小结 |
| 第四章Ca~(2+)在牛卵母细胞成熟和早期胚胎发育过程的动态变化 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 主要试剂 |
| 4.1.2 主要实验仪器 |
| 4.1.3 主要试剂配制 |
| 4.2 试验方法和设计 |
| 4.2.1 卵巢的采集 |
| 4.2.2 卵母细胞的采集和培养 |
| 4.2.3 成熟卵母细胞的孤雌激活及培养 |
| 4.2.4 精子获能及体外受精 |
| 4.2.5 卵母细胞或胚胎Ca~(2+)的测定 |
| 4.2.6 供体细胞准备 |
| 4.2.7 核移植 |
| 4.2.8 核移植胚激活及培养 |
| 4.2.9 试验设计及数据分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 卵母细胞发育过程中Ca~(2+)分布 |
| 4.3.2 体外受精不同时间胚胎Ca~(2+)分布 |
| 4.3.3 成熟卵母细胞孤雌激活后Ca~(2+)分布 |
| 4.3.4 体细胞核移植重构胚发育各时期Ca~(2+)分布观察 |
| 4.3.5 体外胚胎Ca~(2+)浓度对比分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 Ca~(2+)在卵母细胞成熟和激活过程中的作用 |
| 4.4.2 Ca~(2+)在卵母细胞成熟过程中的分布 |
| 4.4.3 Ca~(2+)浓度升高引起卵母细胞激活 |
| 4.4.4 体外胚胎Ca~(2+)变化 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 蛋白酶抑制剂MG-132 对牛核移植重构胚重编程的影响 |
| 5.1 试验材料 |
| 5.1.1 主要试剂 |
| 5.1.2 主要实验仪器 |
| 5.1.3 主要试剂配制 |
| 5.2 试验方法和设计 |
| 5.2.1 卵母细胞的采集及培养 |
| 5.2.2 成熟卵母细胞的孤雌激活 |
| 5.2.3 供体细胞的准备 |
| 5.2.4 核移植 |
| 5.2.5 核移植胚激活及培养 |
| 5.2.6 免疫组化 |
| 5.2.7 试验设计 |
| 5.2.8 数据分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 不同浓度MG-132 作用于MⅠ期卵母细胞对孤雌激活胚胎发育的影响 |
| 5.3.2 MG-132 作用于成熟卵母细胞后对孤雌激活胚胎发育的影响 |
| 5.3.3 核移植过程中添加5 μmol/mL MG-132 重构胚发育情况 |
| 5.3.4 Lamin A/C 在成纤维细胞和融合胚胎中的表达 |
| 5.3.5 Lamin A/C 在牛孤雌激活胚胎中的表达 |
| 5.3.6 Lamin A/C 在牛卵母细胞和IVF 胚胎中的表达 |
| 5.3.7 Lamin A/C 在核移植重构胚中的表达 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 MPF 在核移植过程中的作用 |
| 5.4.2 MG-132 在体细胞核移植中的应用. |
| 5.4.3 核纤层的组成和作用 |
| 5.4.4 Lamin A/C 在不同物种IVF 和SCNT 过程中的表达. |
| 5.5 小结 |
| 第六章 Oct-4 在牛核移植胚胎中的表达. |
| 6.1 试验材料 |
| 6.1.1 主要试剂 |
| 6.1.2 主要实验仪器 |
| 6.1.3 主要试剂配制 |
| 6.2 试验方法和设计 |
| 6.2.1 卵母细胞的采集及培养 |
| 6.2.2 供体细胞的准备 |
| 6.2.3 核移植 |
| 6.2.4 核移植胚激活及培养 |
| 6.2.5 精子获能及体外受精 |
| 6.2.6 免疫组化 |
| 6.2.7 试验设计 |
| 6.2.8 数据分析 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 Oct-4 在IVF 胚胎中的表达 |
| 6.3.2 Oct-4 在核移植重构胚中的表达 |
| 6.4 讨论 |
| 6.4.1 Oct-4 在核移植过程中的作用 |
| 6.4.2 Oct-4 在核移植胚胎的表达 |
| 6.5 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 进一步研究内容 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（8）间隙连接蛋白在绵羊早期胚胎中的表达和作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 目录 |
| 缩略词表 |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 实验研究 |
| 第一章 六种间隙连接蛋白在绵羊卵母细胞和体外受精早期胚胎中转录水平的检测 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 Cx43和Cx45在绵羊卵母细胞和胚胎中的表达及间隙连接通道建立时期的确立 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 通过注射Cx43、Cx45 dsRNA研究间隙连接蛋白对绵羊早期胚胎的影响 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 第二部分 文献综述 |
| 第一章 间隙连接蛋白的结构以及间隙连接蛋白家族的多样化表达 |
| 1 间隙连接通道的发现及结构 |
| 2 间隙连接蛋白基因的命名方式 |
| 3 多种信号分子调控connexin蛋白磷酸化形成间隙连接通道 |
| 第二章 间隙连接蛋白在生殖发育过程中的作用 |
| 1 间隙连接蛋白在卵母细胞成熟过程中的作用 |
| 1.1 间隙连接蛋白在卵母细胞成熟过程中的表达 |
| 1.2 促性腺激素调控间隙连接蛋白在卵母细胞成熟过程中起作用 |
| 2 间隙连接蛋白在早期胚胎发育过程中的作用 |
| 3 间隙连接蛋白在妊娠及分娩过程中的作用 |
| 4 间隙连接蛋白在雄性生殖系统中的表达与功能 |
| 第三章 Connexins和间隙连接通道与细胞生长、凋亡的关系 |
| 1 间隙连接通讯与细胞生长 |
| 2 间隙连接通讯与细胞凋亡 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
（9）牛体细胞核移植胚胎表观遗传修饰研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 哺乳动物卵母细胞体外成熟与体外受精的研究进展 |
| 1.1 卵泡卵母细胞体外成熟 |
| 1.1.1 卵母细胞成熟的机理 |
| 1.1.2 卵母细胞成熟的特征 |
| 1.1.3 卵母细胞成熟的判断 |
| 1.1.4 卵母细胞的获取与分级 |
| 1.1.5 影响卵母细胞体外成熟的因素 |
| 1.2 精子的体外获能与体外受精 |
| 1.2.1 受精作用机制 |
| 1.2.2 精子体外获能 |
| 1.2.3 体外受精 |
| 1.2.4 体外受精的影响因素 |
| 1.3 受精卵的体外培养 |
| 1.3.1 受精卵体外发育阻断 |
| 1.3.2 受精卵体外培养系统 |
| 1.3.3 影响体外受精卵体外发育的因素 |
| 1.4 小结与展望 |
| 第二章 哺乳动物细胞核移植的研究进展 |
| 2.1 哺乳动物胚胎细胞核移植研究进展 |
| 2.2 哺乳动物体细胞核移植研究进展 |
| 2.3 哺乳动物异种细胞核移植研究进展 |
| 2.4 哺乳动物细胞核移植的方法和程序 |
| 2.4.1 受体细胞的选择与去核 |
| 2.4.2 供体细胞的选择 |
| 2.4.3 细胞核的移植 |
| 2.4.4 重组胚的激活 |
| 2.4.5 重构胚的培养 |
| 2.5 哺乳动物核移植相关机理的研究进展 |
| 2.5.1 MPF 与核移植的关系 |
| 2.5.2 体细胞供体核的表观遗传重编程 |
| 2.6 影响哺乳动物核移植成功率的因素 |
| 2.6.1 核受体胞质对核移植的影响 |
| 2.6.2 核供体对核移植的影响 |
| 2.6.3 融合-激活方案对核移植的影响 |
| 2.6.4 核移植胚胎的体外培养对发育的影响 |
| 2.7 细胞核移植技术存在的问题和应用前景 |
| 2.7.1 细胞核移植技术存在的问题 |
| 2.7.2 细胞核移植技术的应用前景 |
| 第三章 牛卵泡卵母细胞体外受精的研究 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 成熟液中添加EGF、Insulin 对牛卵母细胞体外成熟和体外受精的影响 |
| 3.2.2 不同精液处理方法对牛卵泡卵母细胞体外受精的影响 |
| 3.2.3 体细胞共培养对牛体外受精卵体外发育的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 EGF、Insulin 对牛卵母细胞体外成熟和体外受精的影响 |
| 3.3.2 精液处理方法对牛卵泡卵母细胞体外受精的影响 |
| 3.3.3 体细胞共培养对牛体外受精卵体外发育的影响 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 激活方法和共培养系统对牛核移植胚胎体外发育的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 不同激活方法对牛核移植胚胎体外发育的影响 |
| 4.2.2 不同共培养系统对牛核移植胚胎体外发育的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 不同激活方法对牛核移植胚胎体外发育的影响 |
| 4.3.2 不同共培养系统对牛核移植胚胎体外发育的影响 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 牛体细胞克隆胚胎DNA 甲基化和组蛋白乙酰化分析 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 抗5－甲基胞嘧啶抗体和抗组蛋白H3(acetyl K18)抗体特异性检测 |
| 5.2.2 牛体外受精胚胎和核移植胚胎各发育阶段单细胞核DNA 甲基化水平比较 |
| 5.2.3 牛体外受精胚胎和核移植胚胎各发育阶段单细胞核组蛋白乙酰化水平比较 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 DNA 甲基转移酶抑制剂对牛核移植胚胎体外发育及其表观遗传状态的影响 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 材料 |
| 6.1.2 方法 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 5-aza-dC 处理供体细胞对核移植胚胎体外发育及其表观遗传状态的影响 |
| 6.2.2 5-aza-dC 处理重构胚对核移植胚胎体外发育及其表观遗传状态的影响 |
| 6.2.3 体细胞和重构胚均用5-aza-dC处理对核移植胚胎体外发育及其表观遗传状态的影响 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 组蛋白脱乙酰化酶抑制剂对牛核移植胚胎体外发育及其表观遗传状态的影响 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 材料 |
| 7.1.2 方法 |
| 7.2 结果与分析 |
| 7.2.1 TSA 处理供体细胞对核移植胚胎体外发育及其表观遗传状态的影响 |
| 7.2.2 TSA 处理重构胚对核移植胚胎体外发育及其表观遗传状态的影响 |
| 7.2.3 体细胞和重构胚均用TSA 处理对核移植胚胎体外发育及其表观遗传状态的影响 |
| 7.3 讨论 |
| 7.4 小结 |
| 第八章 5-aza-dC 联合 TSA 对牛核移植胚胎体外发育 及其表观遗传状态的影响 |
| 8.1 材料与方法 |
| 8.1.1 材料 |
| 8.1.2 方法 |
| 8.2 结果与分析 |
| 8.2.1 5-aza-dC＋TSA 处理对核移植胚胎体外发育及其表观遗传状态的影响 |
| 8.2.2 不同个体来源成纤维细胞作核供体，供体细胞和重构胚均用5-aza-dC＋TSA 处理后对核移植胚胎体外发育的影响 |
| 8.3 讨论 |
| 8.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（10）Figla和BDNF对猪和牛卵母细胞及早期胚胎生长发育的影响（论文提纲范文）
| 提要 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 卵泡和卵母细胞发生的分子调控机制 |
| 1 生殖系a 因子 |
| 2 新生卵巢同源盒基因 |
| 3 Oct4、Sox2 和 Nanog |
| 4 KIT 配体（KITL）和 KIT |
| 5 抗苗勒激素 |
| 6 叉头转录因子2 |
| 7 神经营养因子和它们的受体 |
| 8 生长分化因子9 和骨形态发生蛋白15 |
| 9 成纤维细胞生长因子2 和成纤维细胞生长因子7 |
| 10 白血病抑制因子 |
| 11 胰岛素样生长因子家族 |
| 12 类固醇 |
| 第二章 哺乳动物体外受精、孤雌激活和核移植技术的研究进展 |
| 1 体外受精 |
| 1.1 研究概况 |
| 1.2 研究方法及进展 |
| 2 孤雌生殖 |
| 2.1 研究概况 |
| 2.2 卵母细胞孤雌激活的方法 |
| 3 细胞核移植 |
| 3.1 研究进展 |
| 3.2 哺乳动物核移植的基本操作程序 |
| 第三章 哺乳动物卵母细胞的成熟和早期胚胎的体外培养 |
| 1 卵母细胞体外成熟 |
| 1.1 研究简史 |
| 1.2 卵母细胞体外成熟的主要环节 |
| 1.3 影响卵母细胞体外成熟的因素 |
| 2 胚胎的培养 |
| 2.1 胚胎的培养历史概况 |
| 2.2 培养液的种类，培养液的基本成分及其功用 |
| 第二篇 试验部分 |
| 第一章 Figla 基因的克隆 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 Figla 基因的 PCR 扩增 |
| 2.2 克隆片断测序结果 |
| 2.3 基因结构分析 |
| 2.4 磷酸化位点和激酶特异磷酸化位点的预测 |
| 2.5 Figla 基因序列二级结构预测 |
| 2.6 三级结构预测 |
| 2.7 保守结构域预测 |
| 2.8 Figla 基因m RNA 在各组织间的表达情况 |
| 3 讨论 |
| 3.1 SMART 技术 |
| 3.2 Figla 及其相关基因序列分析 |
| 3.3 Figla 基因功能预测分析 |
| 4 小结 |
| 第二章 牛和猪卵母细胞和早期胚胎中相关基因表达的检测方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 内参引物的鉴定与选择 |
| 2.2 比较不同方法提取卵母细胞和胚胎total RNA |
| 2.3 比较不同细胞保存方法对total RNA 提取的影响 |
| 2.4 比较不同保存方法对cDNA 品质的的影响 |
| 2.5 实时荧光定量 PCR 条件的优化 |
| 3 讨论 |
| 3.1 荧光染料法在哺乳动物卵母细胞和早期胚胎发育相关基因研究中的应用 |
| 3.2 从微量细胞中提取 RNA 技术 |
| 3.3 引物对实时荧光定量 PCR 的影响 |
| 3.4 模板、引物模板配比关系对实时荧光定量 PCR 的影响 |
| 3.5 内参基因的选择对基因表达相对定量结果的影响 |
| 4 小结 |
| 第三章 Figla 基因和BDNF 基因在猪和牛卵母细胞和早期胚胎中定量表达的研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 牛 IVF、PA 和 NT 胚胎的制备和培养 |
| 1.2 猪 PA 胚胎的制备和培养 |
| 1.3 囊胚冷冻 |
| 1.4 荧光定量 PCR 分析 |
| 1.5 BDNF 荧光染色 |
| 1.6 统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 NT 胚胎的获得 |
| 2.2 猪和牛卵母细胞和早期胚胎的获得 |
| 2.3 引物的鉴定与选择 |
| 2.4 Figla 和 BDNF 基因表达水平 |
| 2.5 BDNF 在牛囊胚中的定位表达研究 |
| 3 讨论 |
| 3.1 基因表达的相对定量 |
| 3.2 Figla基因和BDNF基因在哺乳动物卵母细胞和早期胚胎中的表达 |
| 3.3 不同类型的胚胎在 mRNA 水平中表达差异的研究 |
| 4 小结 |
| 第四章 BDNF、NGF 对猪和牛早期胚胎发育的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 试验设计 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 培养液中添加 BDNF 对牛 IVF 胚胎体外发育的影响 |
| 2.2 培养液中添加 BDNF 对牛 PA 胚胎体外发育的影响 |
| 2.3 培养液中添加 NGF 对牛 IVF 胚胎体外发育的影响 |
| 2.4 培养液中添加 NGF 对牛 PA 胚胎体外发育的影响 |
| 2.5 培养液中添加 BDNF 对猪 PA 胚胎体外发育的影响 |
| 2.6 培养液中添加 NGF 对猪 PA 胚胎体外发育的影响 |
| 2.7 培养液中添加 BDNF 对牛颗粒细胞体外生长的影响 |
| 2.8 培养液中添加 NGF 对牛颗粒细胞体外增生的影响 |
| 2.9 颗粒细胞生长情况分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 BDNF 与生殖系统的关系 |
| 3.2 NGF 与生殖系统的关系 |
| 3.3 颗粒细胞与胚胎发育的关系 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 致谢 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
四、牛体外受精卵5～10细胞期单一卵裂球染色体诊断（论文参考文献）
- [1]组蛋白甲基转移酶ASH1L在牛卵丘细胞及胚胎中的表达和功能[D]. 崔立欣. 中国农业科学院, 2020
- [2]基于转录组学鉴定荷斯坦青年母牛繁殖力性状相关基因及机理研究[D]. 赵国丽. 宁夏大学, 2019(02)
- [3]食蟹猴胚胎操作中若干技术效率的分析[D]. 张安然. 华南农业大学, 2018(02)
- [4]外源谷胱甘肽通过γ-谷氨酰循环促进牛早期胚胎内GSH的合成[D]. 李凤. 中国农业科学院, 2018(12)
- [5]猪卵胞质注射及单精子胞质内注射介导的转基因方法研究[D]. 刘帅. 广西大学, 2015(01)
- [6]奶牛体外胚胎生产技术的研究[D]. 朱化彬. 甘肃农业大学, 2011(04)
- [7]牛体细胞核移植重编程研究[D]. 梁素丽. 西北农林科技大学, 2011(03)
- [8]间隙连接蛋白在绵羊早期胚胎中的表达和作用研究[D]. 闫真. 内蒙古大学, 2009(04)
- [9]牛体细胞核移植胚胎表观遗传修饰研究[D]. 丁向彬. 西北农林科技大学, 2008(12)
- [10]Figla和BDNF对猪和牛卵母细胞及早期胚胎生长发育的影响[D]. 易康乐. 吉林大学, 2008(11)