一、胃癌单克隆抗体MG7的噬菌体呈现型抗独特型单链抗体ScFv的制备（论文文献综述）
陈秀秀[1]（2020）在《靶向免疫检查点LAG-3全人源抗体的研制及生物特性的鉴定》文中研究指明背景:近年来,随着现代医学的发展及对肿瘤的研究逐渐深入,肿瘤免疫疗法受到广泛关注。特别是以程序性死亡受体-1（programmed cell death protein 1,PD-1）/程序性死亡配体1（programmed cell death ligand protein 1,PD-L1）为代表针对免疫检查点的治疗性抗体,在治疗晚期恶性肿瘤方面取得了重大突破。因此,寻找新的免疫检查点,并研制针对其的治疗性抗体成为一种新的趋势。抑制性免疫检查点淋巴细胞活化基因3（Lymphocyte-activation gene 3,LAG-3）可以抑制T细胞活化和细胞因子分泌,从而确保免疫稳态。它对各种类型的淋巴细胞产生不同的抑制作用,并与PD-1具有协同作用,成为具有巨大的治疗潜力的免疫检测点候选靶点。目前,临床试验正在积极地开展靶向LAG-3的免疫抑制剂疗法,抗LAG-3和抗PD-1的联合免疫疗法在对抗PD-1耐药性方面显示出较好的临床效果。本文中我们成功制备出了靶向免疫检查点LAG-3的新型全人源单克隆抗体,并对其生物活性进行鉴定,为后续研究奠定基础。目的:通过实验室自行构建的大容量全人源噬菌体抗体库筛选得到特异性抗LAG-3的单链（sc Fv）抗体,并利用同源重组技术获得全人源抗LAG-3的完整抗体并鉴定其生物活性。方法:利用本实验室自行构建并优化的全人源噬菌体抗体库,经过多轮的“吸附-洗脱-扩增”过程,筛选全人源抗LAG-3单链噬菌体抗体,采用ELISA实验、DNA序列分析方法初步鉴定后,获得特异性抗LAG-3的全人源单链抗体,采用表面等离子共振技术（Surface Plasmon Resonance,SPR）测定抗LAG-3噬菌体源单链抗体的亲和力常数,随后进行噬菌体单链抗体的可溶性表达,再通过PCR技术和同源重组技术及真核表达系统获得全人源抗LAG-3的完整抗体,采用protein A亲和层析的方法分离纯化抗体,进一步采用SDS-PAGE电泳鉴定完整抗体纯度,用ELISA方法鉴定抗LAG-3完整人源抗体与不同来源蛋白的特异性,利用流式细胞术的方法鉴定抗LAG-3完整人源抗体与激活T细胞的结合能力。结果:1.通过3轮筛选富集,经ELISA鉴定及序列分析,获得了29个阳性克隆与人LAG-3重组蛋白结合,其中有16个克隆具有特异性,在16个阳性克隆中有4种基因型,亲和力测定结果按照从高到低排列依次为2号、8号、14号、13号。其中2号单链抗体的亲和力最好,为3.48×10-10。2.成功构建了完整的抗LAG-3全人源单克隆抗体,真核转染经亲和纯化后鉴定,完整抗LAG-3全人源单克隆抗体纯度达到90%以上。3.采用ELISA方法鉴定完整抗LAG-3全人源单克隆抗体的特异性,结果显示LAG-3-2、LAG-3-8、LAG-3-13完整全人源抗体具有特异性,流式细胞术结果表明LAG-3-2、LAG-3-8、LAG-3-13三种完整全人源单克隆抗体都可与激活T细胞结合,其中LAG-3-2完整全人源单克隆抗体结合活性最好。结论:利用大容量全人源噬菌体抗体库,筛选出了4种不同基因型的抗LAG-3的特异性人源单链抗体。随后通过真核表达系统构建出完整的抗LAG-3全人源单克隆抗体,生物学活性鉴定其中完整的LAG-3-2、LAG-3-8、LAG-3-13全人源单克隆抗体具有高特异性,且都可与激活的T细胞结合。
陆礼[2]（2017）在《抗CD40×HER2双特异性单链抗体的构建及抑制肿瘤增殖的实验研究》文中指出目的采用基因重组及蛋白原核表达技术获取抗CD40×HER2双特异性单链抗体（CD40×HER2 Single chain Diabody,CD40×HER2 Sc Db）,并检测其激活肿瘤特异性免疫及HER2分子靶向的功能。方法使用固相筛选法对抗CD40噬菌体展示免疫文库进行筛选,并通过噬菌体ELISA最终筛选获取高亲和力抗CD40 Sc Fv克隆。以此为模板,PCR扩增获取CD40 Sc Fv的重链可变区（heavy chain variable,VH）及轻链可变区（light chain variable,VL）序列,通过重叠PCR（Overlap Extension OE-PCR）将CD40 Sc Fv的VH及VL分两步与HER2 Sc Fv基因片段进行拼接获取CD40×HER2 Sc Db序列全长,DNA电泳及测序检测拼接序列的正确性。使用Nde I及Sal I进行CD40×HER2Sc Db序列及p ET28a原核表达载体的酶切并构建p ET28a-CD40×HER2 Sc Db原核表达载体。将构建的重组质粒转化Rosetta（DE3）感受态细胞,IPTG诱导蛋白表达,超声裂解诱导菌体,Ni-NTA琼脂糖纯化获取CD40×HER2 Sc Db,并对其进行理化性质的分析及分子结构预测。体外诱导培养小鼠骨髓源树突状细胞,流式细胞术检测CD40×HER2 Sc Db对树突状细胞表面CD80/CD86及MHC-II表达的影响。依据给予的干预不同,实验分为:生理盐水（Normal Saline,NS）对照组;单纯肿瘤抗原负载（Ag）组;Ag+CD40×HER2 Sc Db组以及Ag+TNF-α组4组。ELISA检测CD40×HER2 Sc Db对树突状细胞分泌IL-12的影响以及对T淋巴细胞分泌IFN-γ的影响。体外培养小鼠乳腺癌细胞系4T1,CCK8检测CD40×HER2 Sc Db诱导的肿瘤特异性T淋巴细胞对4T1增殖的抑制作用。构建4T1细胞系的BALB/c小鼠肿瘤模型,依据给予的不同干预,将模型小鼠随机分为:NS组;HER2 Sc Fv组;CD40×HER2 Sc Db1组（750μg/kg）;CD40×HER2 Sc Db2组（1.5mg/kg）及CD40m Ab（5mg/kg）组。记录并描绘各组肿瘤生长曲线,ELISA检测肿瘤组织中IL-12、IFN-γ的表达水平。对肿瘤组织进行石蜡包埋切片,HE染色检测肿瘤组织淋巴细胞浸润,免疫组织化学（Immunohistochemistry,IHC）检测肿瘤细胞Caspase-3的表达水平。体外培养小鼠成纤维瘤细胞系T6-17细胞系,细胞免疫荧光检测CD40×HER2 Sc Db对HER2的靶向功能,CCK8实验检测CD40×HER2 Sc Db对T6-17细胞的体外杀伤。依据给予的干预不同,实验分组为:NS组;CD40 Sc Fv组（2.5μg/m L）;HER2 Sc Fv组（2.5μg/m L）;CD40×HER2Sc Db1组（2.5μg/m L）;CD40×HER2 Sc Db2组（5μg/m L）;曲妥珠单抗组（15μg/m L）。 构建T6-17细胞的BALB/c-Nude小鼠肿瘤模型,依据给予的干预不同,将模型小鼠随机分为:NS组;CD40 Sc Fv组（150μg/kg）;HER2 Sc Fv组（150μg/kg）;CD40×HER2 Sc Db1组（150μg/kg）;CD40×HER2 Sc Db2组（300μg/kg）;曲妥珠单抗组（1mg/kg）。记录小鼠皮下肿瘤的体积的变化,对肿瘤组织进行石蜡包埋并切片,HE染色观察T6-17肿瘤组织细胞形态的变化。结果固相筛选法对噬菌体展示文库克隆的序列多样性发挥了收敛效果。第三轮筛选克隆的测序结果100%匹配的克隆占总克隆数的3.2%,并筛选获取了8个潜在阳性克隆,梯度噬菌体ELISA检测各潜在克隆的亲和力表明,8#克隆与CD40的亲和力最佳,其与BSA亲和力的比值>3,符合阳性克隆筛选的标准。PCR扩增CD40 Sc Fv的VH及VL片段,DNA电泳及测序结果表明CD40 Sc Fv的VH及VL碱基长度分别为345bp及324bp,与预期大小相符,重叠PCR拼接获取的CD40×HER2 Sc Db基因序列长度为1464bp,与预期相符。使用0.5mmol/L IPTG可获得最佳蛋白诱导效果,蛋白变性电泳结果可于55Kd左右见一明显条带,其大小与预期相符,对His-tag进行Western Blot检测同样可于55Kd左右见一明显条带,BCA检测纯化后蛋白浓度为2.7mg/ml。流式细胞术检测Ag+CD40×HER2Sc Db组DC表面CD80、CD86及MHC-II的表达率分别为93.5±3.1%86.00±3.2%92.3±2.8%,与Ag+TNF-α组相比,差异无统计学意义（P>0.05）,与NS组及Ag组相比,差异有统计学意义（P<0.05）。ELISA检测Ag+CD40×HER2 Sc Db组DC细胞上清中的IL-12浓度为659.90±61.28 pg/m L,与Ag+TNF-α组相比,差异无统计学意义（P>0.05）,与NS组及Ag组相比,差异有统计学意义（P<0.05）。Ag+CD40×HER2 Sc Db组T淋巴细胞对4T1细胞增殖的抑制率为75.65±2.53%,与Ag+TNF-α组相比,差异无统计学意义（P>0.05）,与Ag组及NS组相比,差异有统计学意义（P<0.05）。ELISA检测CD40×HER2 Sc Db2组4T1肿瘤组织内IL-12及IFN-γ表达水平分别为448.85±51.10 pg/m L,273.44±44.60 pg/m L,与NS组及HER2 Sc Fv组相比,差异有统计学意义（P<0.05）,与CD40 m Ab组相比,无统计学差异（P>0.05）。观察不同组小鼠4T1肿瘤体积的变化表明,CD40×HER2 Sc Db2组（1.5mg/kg）及CD40 m Ab（5mg/kg）均可显着抑制4T1肿瘤的体内增殖,二者的抑制效果无统计学差异（P>0.05）。免疫组化检测肿瘤组织Cleaved-Caspase-3的表达水平,结果表明,CD40×HER2Sc Db组4T1肿瘤细胞内Cleaved-Caspase-3的表达显着上调。CCK8检测CD40×HER2 Sc Db对T6-17细胞增殖的抑制结果表明,CD40×HER2 Sc Db（5μg/m L）对T6-17的抑制率为86.89±6.35%,其与曲妥珠单抗（15μg/m L）的抑制率85.56±1.73%相比,差异无统计学意义（P>0.05）。Western Blot检测不同干预组Akt、p-Akt、ERK1/2及p-ERK1/2的表达水平,结果表明,CD40×HER2Sc Db、HER-2 Sc Fv及曲妥珠单抗均可抑制Akt、p-Akt、ERK1/2及p-ERK1/2的表达,与NS组相比,差异具有统计学意义（P<0.05）。小鼠肿瘤组织HE染色结果表明,NS组细胞形态正常,细胞核完整,部分细胞可见核仁,细胞生长活跃,CD40×HER2 Sc Db和曲妥珠单抗组肿瘤组织细胞失去正常形态,核固缩核碎裂现象明显。结论通过对抗CD40噬菌体展示免疫文库的筛选,可成功获取抗CD40高亲和力单链抗体克隆。通过重叠PCR可成功获取CD40×HER2 Sc Db基因序列全长,通过IPTG诱导可成功于原核蛋白表达系统表达获取CD40×HER2 Sc Db蛋白,并通过蛋白复性获得功能性蛋白。CD40×HER2 Sc Db可通过促进DC细胞成熟,激活肿瘤特异性免疫,体外杀伤肿瘤,也可通过促进肿瘤特异性CTL在肿瘤组织巢集,通过激活肿瘤细胞内Caspase-3诱导肿瘤细胞凋亡,并通过上调组织内激活型免疫细胞因子激活肿瘤特异性免疫反应。CD40×HER2 Sc Db可通过与T6-17表面的HER2结合,抑制Akt、ERK1/2的磷酸化,抑制T6-17的体外增殖,同时也可在体内通过HER2靶向功能抑制T6-17细胞的增殖。
李本强[3]（2015）在《鸡源性抗新城疫病毒磷蛋白胞内抗体的研究》文中指出新城疫目前仍是大多数养禽国危害最严重的禽病之一,不仅对养禽业造成危害,还对哺乳动物和人类健康具有潜在的威胁。新城疫由于传染性强,传播速度快,给国家和地区的贸易限制和封锁造成了巨大的经济损失。我国将其列为一类动物疾病。病毒性传染病目前尚没有特异性药物治疗,只能依靠疫苗免疫等进行预防。因此,研究特异高效的抗病毒药物是防治病毒性疫病所面临的一项紧迫课题。近年来出现的反义RNA、RNAi等基因治疗技术,都试图在细胞内对感染的病毒在核酸水平上进行干预,从而达到抑制病毒合成的治疗目的。随着细胞生物学和抗体工程技术的发展,出现了一种新兴细胞内免疫及治疗技术——胞内抗体技术。胞内抗体技术是将小分子抗体导入细胞内引起细胞的一系列生物过程发生改变的技术,该技术通过特异性干扰或阻断细胞内特定生物大分子合成、加工和分泌过程而发挥作用。鉴于新城疫病毒转录复合体蛋白在病毒复制增殖过程中所处的关键环节,本研究拟研制能够与新城疫病毒转录复合体蛋白之一的磷蛋白结合的胞内抗体。通过胞内抗体与P蛋白在NDV感染的细胞内特异性结合,从而对病毒转录复合物形成进行干扰及对病毒增殖进行抑制,为新城疫病毒特效药物的研发以及病毒复制机制的研究提供一种新的思路。为此,本论文从以下几个方面开展研究。1、鸡源性抗新城疫病毒磷蛋白的单链抗体（sc Fv）的筛选及鉴定（1）鸡源性单链抗体基因表达文库的建立单链抗体是将抗体的轻链可变区（VL）和重链可变区（VH）通过一段柔性的连接肽（linker）连接所形成的两个可变区首尾相连的单一肽链。通过用NDV VG/GA型疫苗免疫鸡,提取其脾脏总m RNA。设计鸡抗体编码基因特异性引物,采用RT-PCR和PCR技术扩增出抗NDV单链抗体的轻链可变区和重链可变区基因,利用重叠延伸PCR将VH和VL通过一条linker连接起来（VH-linker-VL）构建sc Fv。将sc Fv基因克隆于原核表达载体p OPE101-XP,该载体主要用于单链抗体的表达和筛选。将构建的重组质粒p OPE101-XP-sc Fv转化感受态细胞E.coli JM109,PCR鉴定为阳性的克隆送检测序。挑选测序正确的阳性克隆经IPTG诱导表达,提取周质腔可溶性sc Fv,SDS-PAGE检验表达结果证明成功构建了鸡源性单链抗体表达文库。经计算单链抗体库库容量为3.8×106,可用于下一步单链抗体的筛选。（2）抗新城疫病毒磷蛋白（P）单链抗体的筛选及鉴定根据Genbank中已经发表的禽源性新城疫病毒F48E9磷蛋白的基因序列,设计了一对特异性引物,运用RT-PCR方法从基因组中扩增出P蛋白编码基因的c DNA。P蛋白编码基因全长1287 bp,编码429个氨基酸。同时将测序正确的P蛋白基因序列连接原核表达载体构建重组原核表达质粒p ET-28a-P,进而表达出P蛋白,为筛选针对磷蛋白的单链抗体提供抗原。以纯化后的新城疫病毒磷蛋白为抗原,建立并优化可用于筛选抗NDV磷蛋白sc Fv的间接ELISA方法。从上述构建的单链抗体库中进行筛选,获得两株亲和力较高的阳性克隆sc Fv ZL.17和sc Fv ZL.103。对鸡源性抗新城疫病毒磷蛋白单链抗体的基因序列分析,结果表明高变区主要集中于CDR区,碱基变化很大。Western blot分析表明两株单链抗体都能够与病毒的磷蛋白特异性结合。2、抗新城疫病毒磷蛋白胞内抗体在细胞中的表达及生物活性分析为获得针对NDV磷蛋白的细胞内抗体,本研究将上述两个单链抗体编码基因克隆到真核表达载体pc DNA3.1（+）,成功构建了针对磷蛋白的胞浆型胞内抗体表达质粒pc DNA3.1-sc Fv ZL103和pc DNA3.1-sc Fv ZL17。采用脂质体分别将pc DNA3.1-sc Fv ZL103和pc DNA3.1-sc Fv ZL17导入细胞内,通过RT-PCR和Western blot分析证明,在细胞内,其编码胞内抗体的m RNA获得转录,胞内抗体成功表达,间接免疫荧光技术也进一步证实胞内抗体在细胞内获得表达。流式细胞证明重组胞内抗体对宿主细胞活性无显着影响;并且通过Western blot和免疫共沉淀实验评估了表达的胞内抗体在细胞内与新城疫病毒磷蛋白的结合能力,证明胞内抗体能够在细胞内与磷蛋白能够特异性结合。通过亚细胞定位实验发现胞内抗体主要分布于细胞质,与磷蛋白的分布区域正好重叠。抗磷蛋白胞内抗体与新城疫病毒相互作用后,血凝实验检测病毒滴度,结果表明转染细胞内的胞内抗体pc DNA3.1-sc Fv ZL103和pc DNA3.1-sc Fv ZL17能够阻断病毒对细胞的侵染,因而对NDV感染的细胞具有保护效果,依次是p CDNA3.1-sc Fv ZL103>p CDNA3.1-sc Fv ZL17>BHK21。通过荧光定量PCR证明,胞内抗体具有干扰c RNA、v RNA和m RNA合成的效果,具有抑制病毒产生的功能。3、可穿膜的重组胞内抗体融合蛋白的表达及生物活性研究上述抗体需要通过脂质体才能导入细胞,既繁琐,效率也不高。为了探索能顺利将抗体导入细胞的方法及构建穿膜型胞内抗体,本研究选择报道的融合穿膜肽HIV-TAT衍生片段CTP512,将其分别和上述筛选的两个单链抗体表达基因融合,导入原核表达载体p ET28a（+）,构建穿膜型胞内抗体表达质粒p ET28a-sc Fv ZL-CTP。进行了穿膜抗体生物学特性研究,设计不同穿膜抗体浓度进行穿膜实验,筛选出最佳的穿膜浓度为3μM;MTT法检测CTP融合穿膜抗体对细胞活性的影响,检测发现与对照组相比,穿膜抗体蛋白对细胞的增殖和活力无明显影响;间接免疫荧光实验分析显示,穿膜抗体定位于细胞浆,能与磷蛋白分布区域重叠;TCID50检测穿膜抗体对DNV感染细胞的保护效果,结果显示,穿膜抗体对细胞有明显保护效果,依次是p ET28a-sc Fv ZL103-CTP>p ET28a-sc Fv ZL17-CTP>Control,与空白对照相比差异显着（P≤0.05）;荧光定量PCR检测穿膜抗体对细胞内NDV复制及转录的影响,结果显示,穿膜抗体显着降低了NDV的c RNA、v RNA和m RNA的含量,表明其具有抑制NDV复制的功能。本研究结果不仅为跨膜型胞内抗体研究提供了一种新思路,也为研究外源蛋白导入细胞膜的转膜技术提供了有益借鉴。本研究利用基因重组技术,首先成功构建了库容量为3.8×106鸡源性单链抗体库,并从库中筛选到针对磷蛋白的两株单链抗体;根据胞内抗体构建策略,研制了针对新城疫病毒磷蛋白的胞内抗体,实验证实胞内抗体对细胞具有保护效果及干扰新城疫病毒基因在细胞内的复制及转录;成功构建跨膜型胞内抗体导入质粒,使胞内抗体与蛋白跨膜转运区域融合表达,实验证实穿膜抗体定位于细胞浆,且对细胞具有保护效果;荧光定量PCR鉴定穿膜抗体能够干扰新城疫病毒感染细胞后的复制及转录。本研究为研究NDV在细胞内复制增殖机制,筛选细胞内有效抗NDV抗体,进而探索细胞内治疗NDV等病毒感染新途径进行了有益探索。
陈荫楠[4]（2015）在《基于展示技术筛选抗硝基呋喃类化合物单链抗体》文中指出水产品中呋喃唑酮的残留具有致癌、致畸、致突变作用,对于人类的健康构成极大的危害。因此,研发具有自主知识产权的快速、准确、灵敏的呋喃唑酮免疫检测技术具有重要的意义。本实验提取小鼠杂交瘤细胞总RNA,并逆转录合成第一链cDNA,利用抗体可变区简并引物扩增全套重、轻链可变区基因VH-linker、linker-VL,经重叠PCR合成VH-linker-VL型单链抗体基因。包被用重氮法偶联成的FZD-OVA作为筛选抗原,通过核糖体展示技术筛选特异于呋喃唑酮的单链抗体,将筛选到的单链抗体基因进行表达、纯化,并研究其特异性与亲和力,建立了基于单链抗体的呋喃唑酮间接竞争ELISA检测方法。主要研究结果如下:（1）采用重氮法制备偶联抗原,对偶联产物进行紫外扫描检测和HPLC分析,结果表明呋喃唑酮和蛋白载体偶联成功。（2）提取小鼠杂交瘤细胞RNA,经RT-PCR构建的单链抗体文库,轻链片段的大小为600 bp左右,重链片段的大小为400 bp左右,经连接肽连接后得到的完整的单链抗体大小约为1 kb,对其进行测序分析,结果表明成功构建完整的单链抗体基因片段。（3）将构建的ScFv文库经体外转录翻译后,用FZD-OVA对产生的ARM三元复合体进行亲和筛选,经过洗涤后能够特异性结合的三元复合体被保留下来,回收复合体解离后释放的mRNA,进行RT-PCR扩增获得筛选后的单链抗体文库,重复上述过程,获得经过三轮筛选后的ScFv文库。（4）将经过三轮筛选的ScFv文库与表达载体pET-28a（+）连接后,转入大肠杆菌中表达。然后通过间接ELISA分析单链抗体与FZD-OVA的结合活性。经过三轮筛选后的文库中随机挑取的克隆子有20%与FZD-OVA有较好的结合能力,并获得1株高亲和的单链抗体FZD-ScFv1,用于下一步的表达、纯化及分析。（5）建立基于单链抗体的呋喃唑酮间接竞争ELISA检测方法。FZD单链抗体在浓度为10～100 ng/mL范围具有较好的线性,IC50值为13.01 ng/mL,最低检测限为1.28 ng/mL,对于其他硝基呋喃类抗生素及其代谢物均不存在交叉反应。该方法重现性较好,平均误差为3.83%。样品的加标回收率为73.38～84.52%,变异系数为6.81～9.41%。
王莹[5]（2012）在《伏马菌素B1和赭曲霉毒素A噬菌体单链抗体库的构建及重组抗体蛋白的原核表达》文中认为真菌毒素（Mycotoxin）是各种真菌产生的一系列有毒次级代谢产物,广泛存在于自然界中,并污染粮食谷物及各种农产品。真菌毒素对人类健康和畜牧业发展已经构成潜在威胁,它不仅降低产品质量,而且可带来严重的食源性中毒问题,引起人或动物的急性、慢性中毒。动物试验表明,摄入被真菌毒素污染的饲料后,就会引起人或动物免疫抑制、组织坏死、肝肾损伤、繁殖障碍、致癌致畸等病理变化,影响人和动物的身体健康。自然界存在的真菌毒素种类繁多、毒性复杂,由于其污染广泛、毒害范围广,在全球食品安全中受到高度关注。为了防止污染真菌毒素的食品及农畜产品直接或间接的进入人类食物链,加强对真菌毒素的检测是十分必要的。近年来,真菌毒素的检测技术快速发展,主要是以高效液相色谱法（HPLC）为主的色谱学检测技术及以酶联免疫吸附法（ELISA）为主的免疫学检测技术。色谱法检测灵敏度高,但样品质量要求较高、前处理操作复杂；而以抗原抗体为基础的免疫学方法,由于其操作简便、快速的优点一直被人们所青睐。现今,专家学者专注于优化和改良ELISA方法,以提高ELISA方法的检测性能。基因工程抗体技术是在充分认识抗体的基因结构和功能的基础上,应用DNA重组技术和蛋白质工程技术发展起来的第三代抗体。基因工程抗体的研究意义在于可以有目的的对抗体基因进行切割、拼接、修饰等一系列操作,获得具有特异功能的改造抗体。与多克隆抗体和单克隆抗体相比,基因工程抗体制备具有时间周期短、操作简便、规模生产成本低廉等优点。单链抗体（ScAb）是基因工程抗体中的一种,它的基因不易丢失,容易保存,作为传统单克隆抗体的改良品,ScAb的具有较好的应用前景,已成为免疫检测技术发展的一个方向。本研究以两种常见的真菌毒素,赭曲霉毒素A（OTA）和伏马菌素Bl（FB1）为对象,应用分子生物学技术及噬菌体展示技术,制备两种真菌毒素的单链抗体,为其免疫学应用与发展奠定基础。试验I伏马菌素B1和赭曲霉毒素A完全抗原的合成与鉴定为了获得FB1和OTA的抗体基因,本试验采用戊二醛一步法将FBl与牛血清白蛋白（BSA）和卵清蛋白（OVA）两种载体蛋白偶联,制备FBl完全抗原FB1-BSA和FB1-OVA;同时用碳二亚胺法合成OTA完全抗原OTA-BSA和OTA-OVA。随后,分别采用紫外吸收光谱法（UV）、凝胶电泳法、傅里叶红外光谱法（IR）、基质辅助激光分析电离飞行时间质谱法（MALDI-TOF-MS）四种方法鉴定人工抗原偶联效果并测定偶联比。将FB1-BSA和OTA-BSA分别作为免疫抗原免疫BALB/c小鼠,采用间接酶联免疫吸附法（i-ELISA）, FB1-OVA和OTA-OVA分别作为固相包被抗原,测定小鼠抗血清滴度。结果表明,OTA和FBl完全抗原合成成功。MALDI-TOF-MS测定完全抗原FB1-BSA、FB1-OVA. OTA-BSA和OTA-OVA偶联比分别为10：1、5：1、3：1和9：1。i-ELISA测定经FB1-BSA和OTA-BSA免疫的小鼠血清效价均可达到1：1.024×105。试验制备的完全抗原以及经免疫的小鼠可用于下一步试验。试验Ⅱ伏马菌素B1单链抗体可变区基因克隆与噬茵体抗体蛋白表达提取FB1杂交瘤细胞F3细胞总RNA,反转录合成cDNA第一条链,应用PCR技术分别将FB1鼠源抗体重链可变区基因（VH）和轻链可变区基因（VL）克隆出来,并经过重叠延伸PCR （SOE-PCR）,通过柔性多肽Linker接头（Gly4Ser）3,按VH-Linker-VL方式拼接成FBl单链抗体可变区基因（ScFv）片段。随后将ScFv基因重组入pCANTAB5E载体中,转化至大肠杆菌（E. coli）宿主菌TGl中,应用噬菌体展示技术,以FB1-OVA为固相包被抗原进行免疫亲和筛选,应用Phage-ELISA和ScFv-ELISA鉴定和筛选阳性噬菌体重组单链抗体。将阳性pCANTAB5E-FB1ScFv质粒转化入表达菌株E. coli HB2151中,经IPTG诱导,获得FB1特异性噬菌体抗体（ScAb）.结果显示,设计鼠源单克隆抗体的重链、轻链可变区基因引物,成功扩增获得FB1鼠源抗体的重链、轻链基因片段,大小为300～400bp。SOE-PCR将VH和VL由Linker拼接成FB1ScFv,大小为700～800bp。随后将ScFv基因重组入pCANTAB5E载体中,转化至E. coli TG1中,经过辅助噬菌体M13K07感染,构建得到的FBl噬菌体重组单链抗体库,抗体滴度约为2.1×1015cfu·mL-1。经过五轮免疫亲和富集和筛选,成功筛选得到5株可分泌FBl特异性噬菌体单链抗体的菌株。核苷酸序列鉴定显示该序列为717bp,编码239个氨基酸。在M13K07辅助噬菌体的辅助下,pCANTAB5E噬菌体质粒可产生含有FBl单链噬菌体基因组的噬菌体颗粒,并以融合的形式表达在噬菌体表面。在E.coli HB2151中,FB1ScFv基因在翻译过程中形成独立的抗体蛋白,以胞周间质形式形成可溶性蛋白。试验Ⅲ赭曲霉毒素A单链抗体可变区基因克隆与噬茵体抗体蛋白表达用OTA-BSA免疫BALB/c小鼠,免疫效价达到要求后,提取小鼠脾总RNA,反转录合成cDNA第一条链,应用PCR技术分别克隆OTA鼠源抗体VH和VL,并经过SOE-PCR,通过柔性多肽Linker接头,按VH-Linker-VL方式拼接成OTA ScFv片段。随后将ScFv基因重组入pCANTAB5E载体中,转化至E. coli TG1中,应用噬菌体展示技术,以OTA-OVA为固相包被抗原进行免疫亲和筛选,应用Phage-ELISA和ScFv-ELISA鉴定和筛选阳性噬菌体重组单链抗体。将阳性pCANTAB5E-OTA ScFv质粒转化入表达菌株E. coli HB2151中,经IPTG诱导,获得OTA特异性ScAb。结果显示,设计鼠源单克隆抗体的重链、轻链可变区基因引物,成功扩增获得OTA鼠源抗体的VH和VL,大小为300～400bp。SOE-PCR将VH和VL由Linker拼接成ScFv,大小为700～800bp。随后将ScFv基因重组入pCANTAB5E载体中,转化至E. coli TG1中,经过辅助噬菌体M13K07感染,构建得到的OTA噬菌体重组单链抗体库,抗体滴度约为2.65×1016cfu·mL-1。经过三轮免疫亲和富集和筛选,成功筛选得到3株可分泌OTA特异性噬菌体单链抗体的菌株。核苷酸序列鉴定显示该序列为738bp,共编码246个氨基酸。在pCANTAB5E噬菌体质粒中,OTA ScFv以胞周间质形式形成可溶性蛋白。试验Ⅳ伏马菌素B1和赭曲霉毒素A单链抗体特性鉴定应用蛋白免疫印迹（WB）和i-ELISA方法分别鉴定OTA与FB1两种真菌毒素ScAb的免疫活性。应用i-ELISA分别测定OTA与FB1ScAb的效价。应用间接竞争酶联免疫吸附试验（ci-ELISA）建立竞争抑制标准曲线。分别测定OTA和FB1ScAb的灵敏度,并测定OTA, FB1ScAb与参试毒素FB2、FB3、AFB1、ZEA和DON交叉反应率,以反映其特异性。结果显示,WB和i-ELISA均显示OTA与FB1ScAb具有良好的免疫活性。FB1-OVA抗原最佳工作浓度为5μg·mL-1, ScAb最佳稀释度为1:1600; OTA-OVA抗原最佳工作浓度为10μg-mL-1, ScAb最佳稀释度为1：800；FB1ScAb抗体滴度达到104; OTA ScAb抗体滴度达到103; ci-ELISA法绘制FB1竞争抑制曲线,FB1浓度为0.31～20μg-mL-1范围内曲线线性关系良好,线性方程为y=-16.663x+117.98（R2=0.9674）, FB1ScAb对FB150%抑制浓度4.08μg·mL-1;同样方法绘制OTA竞争抑制曲线,OTA浓度为0.31～10μgmL-1范围内线性关系良好,线性方程为y=-16.075x+116.84（R2=0.9797）,OTA ScAb对OTA的50%抑制浓度4.16μg·mL-1。FB1ScAb对FB1同种属的FB2、FB3的交叉反应抑制率分别为71.7%和87.6%,而与DON、AFB1、OTA和ZEA交叉反应抑制率较小,说明该FB1ScAb对FB1具有较好的特异性；OTA ScAb对FBi、DON、AFB1和ZEA交叉反应抑制率较小,说明该OTA ScAb对OTA具有较好的特异性。
刘霖[6]（2009）在《人胃癌相关抗原MG7与COX-2在胃癌前病变组织中的表达及应用价值》文中认为胃癌发生是一个多步骤、多因素的进行性发展过程。从正常的胃粘膜细胞转变为胃癌细胞并不是一步完成的,其间可能经历多次细胞转化的过程,从而产生了胃粘膜的肠上皮化生及不典型增生这两种病理学改变,我们将它们统称为胃癌前病变。MG7是我院通过胃癌细胞株MKN-46-9作为免疫原免疫小鼠制备的胃癌单克隆抗体,它可与胃癌组织及患者血清中的抗原特异性结合,其所识别的抗原是一种有别于已知胃肠道肿瘤标志物的新抗原。由于其对胃癌组织具有较高的特异性,因而被视为一种有前途的胃癌诊断指标,另有证据表明MG7抗原在胃癌预警及早期诊断方面具有临床价值。环氧合酶（COX）是前列腺素（PG）合成的限速酶,COX至少有两种亚型,即COX-1和COX-2。其中COX-2在炎症以及肿瘤中的作用已成为研究的热点。国内外的研究表明,COX-2与胃癌的发生密切相关。已有报道指出,COX-2与MG7在胃癌组织中的表达具有组织分布一致性和相关性,然而,在胃癌出现之前的胃癌前病变中,COX-2与MG7-Ag的共表达情况及两者的相关性尚不明确。因此,本研究通过免疫组化方法对334例胃癌前病变患者的胃粘膜标本进行了MG7抗原和COX-2的对比检测,以探讨人胃癌相关抗原MG7在胃癌前病变组织中的表达及其与COX-2表达的相关性。特别对其中107例有临床随访的患者,初步探讨了人胃癌相关抗原MG7与COX-2的联合检测在胃癌前病变预警的应用价值。实验目的:探讨在散发人群中胃粘膜不典型增生和肠化等癌前病变的MG7抗原和COX-2表达情况及相关性;并对这些癌前病变患者进行随访观察,初步了解MG7抗原和COX-2表达与胃粘膜病变进展之间的关系。材料和方法:1.患者与标本收集第四军医大学西京医院、天津医科大学总医院、山东大学附属齐鲁医院自2004年1月—2008年1月的胃粘膜活检标本,共501例患者的石蜡切片（包括癌前病变组织334例、浅表性胃炎59例、萎缩性胃炎67例及胃癌组织41例）。并对334例癌前病变患者进行随访观察,完成1年以上随访的患者共107例,根据前后两次以上同一部位胃镜活检组织标本病理诊断分为进展组（包括肠上皮化生→不典型增生,不典型增生→癌变）和非进展组（包括肠上皮化生→肠上皮化生,不典型增生→不典型增生）。2.方法1)通过细胞培养技术复苏MG7杂交瘤细胞,制备MG7单抗。2)应用免疫组织化学染色技术检测MG7-Ag和COX-2在胃癌前病变组织中的表达,明确其组织和细胞定位,研究两者的相关性。结果:1.MG7-Ag和COX-2在胃癌前病变组织和非胃癌前病变组织中的表达MG7-Ag表达主要呈细胞膜和细胞浆着色,而COX-2着色部位也主要在细胞浆和细胞膜。MG7-Ag和COX-2在胃癌前病变组织中表达与患者的年龄、性别无关（P>0.05）,但随着胃癌前病变的进展而逐渐上升,且差异有显着性（P<0.05）。MG7-Ag和COX-2在胃癌前病变组织中表达的阳性率显着高于慢性胃炎（P<0.05）;MG7-Ag和COX-2的表达从慢性浅表性胃炎、慢性萎缩性胃炎、肠上皮化生、不典型增生到胃癌呈上升趋势（P<0.05）,提示MG7-Ag和COX-2有可能作为胃癌前病变（包括肠上皮化生和不典型增生）发展成为胃癌的预警分子。2.MG7-Ag和COX-2在胃癌前病变组织中的相关性分析在334例胃癌前病变组织中MG7-Ag和COX-2的联合检测发现同时为阳性的为39.2%,同时为阴性的为33.5%。在MG7-Ag表达阳性的例数中COX-2表达同时为阳性的为79.9%,而COX-2表达阳性的例数中MG7-Ag表达同时为阳性的为69.3%。MG7-Ag和COX-2在胃癌前病变组织中的表达存在相关性（P<0.05）。3.MG7-Ag和COX-2联合检测预警胃癌前病变进展的研究在随访一年的107例癌前病变患者中进展组MG7-Ag和COX-2的阳性表达率均分别高于非进展组对应抗原的阳性表达率。对进展组和非进展组的MG7-Ag和COX-2联合检测结果比较,MG7（+） COX-2（+）/ MG7（-） COX-2（-） OR值为22.7,95%CI:5.9—74.（4P<0.005）,即当MG7（+） COX-2（+）时,胃癌前病变患者组织学出现进展的危险度增加22倍。MG7（+） COX-2（+）组及MG7（+） COX-2（-）组分别与MG7（-） COX-2（-）组比较结果有显着性差异（P<0.005）,而MG7（-） COX-2（+）组与MG7（-） COX-2（-）组比较结果无显着性差异（P>0.1）。结论:1. MG7-Ag和COX-2表达从慢性浅表性胃炎、慢性萎缩性胃炎、肠上皮化生、轻、中度不典型增生、重度不典型增生到胃癌呈上升趋势,提示MG7-Ag和COX-2有可能作为胃癌前病变发展成为胃癌的预警分子;2. MG7-Ag和COX-2在胃癌前病变组织中的表达呈正相关性;3. MG7-Ag和COX-2呈双阳性表达时,胃癌前病变进展的危险度增加22倍,此种联合检测对预测胃癌高危个体有重要价值。
赵泽文[7]（2008）在《抗人Endoglin单链抗体的制备及其在荷人卵巢癌裸鼠体内放射免疫显像初探》文中研究说明研究背景:Endoglin又名CD105,是一种细胞膜糖蛋白,是内皮细胞增殖的标志物之一。它在增殖的内皮细胞和肿瘤组织的新生血管内皮细胞中呈过表达,而在正常成熟的血管内皮细胞中不表达或弱表达。Endoglin还是转化生长因子-β（TGF-β）受体复合物的成分之一,具有调节内皮细胞对TGF的反应、促内皮细胞增殖和促血管形成等功能,与肿瘤血管生成有关。依据肿瘤的生长和转移依赖于肿瘤新生血管形成的观点,大量研究表明,通过靶向肿瘤新生血管内皮表达的Endoglin,在动物实验中实现了对移植瘤的放射免疫显像和治疗作用,证实了Endoglin可以作为体内肿瘤显像诊断和治疗的理想靶标。提高早期卵巢癌检出率是降低卵巢癌患者高死亡率的关键,但目前尚无理想的筛查或/和早期诊断卵巢癌的方法,因此建立特异的早期卵巢癌诊断方法显得尤为迫切和重要。卵巢癌是一高度血管化的恶性肿瘤,所以抗人Endoglin抗体有可能在其诊断及治疗中发挥重要作用。抗Endoglin抗体的研究中,以单克隆抗体的报道最多。但是单克隆抗体由于自身的一些缺点使得它的临床应用效果不佳。如单克隆抗体的分子量大,穿透力较弱,因有Fc段,在体内容易与正常组织的Fc受体发生非特异性结合,多为鼠源性,易致机体产生人抗鼠抗体反应,制备过程烦琐等。比较而言,单链抗体分子小、穿透力强、体内清除快、缺乏Fc段、异源性低、易于在大肠杆菌中重组表达获得足够量,易于用基因工程方法制备和修饰,通过构建双价或双特异性单链抗体来增加抗体的稳定性和亲和力,单链抗体是将药物、毒素和放射性物质导向肿瘤的很有价值的小分子抗体,因而在肿瘤诊断和治疗方面的应用越来越广泛。噬菌体表面呈现技术,是利用噬菌体表达外源基因的一项技术。它以改建的噬菌体为载体,把目的基因片段定向插入噬菌体外壳蛋白质基因区,使外源多肽或抗体表达并展示于噬菌体表面,进而通过亲和富集筛选表达有特异肽或抗体的噬菌体,然后进行DNA序列测定。它将基因型和表型、分子结合活性与噬菌体的可扩增性结合在一起,是一种高效的筛选系统。在抗原表位的模拟、蛋白质工程的改造、单链抗体的制备、药物筛选及疫苗研制等方面,具有广泛的用途。基于以上分析,本研究拟应用噬菌体表面呈现技术制备特异性抗人Endoglin单链抗体,并研究其生物学活性和体内靶向肿瘤新生血管内皮的作用,为探索早期卵巢癌诊断方法的研究奠定基础。研究目的:制备抗人Endoglin单链抗体,并检测其生物学活性;初步探讨抗人Endoglin单链抗体在荷人卵巢癌裸鼠体内肿瘤放射免疫显像中的应用。研究方法及结果:研究共分四部分。第一部分:以rhEndoglin（即重组人Endoglin胞外段）蛋白免疫Balb/c小鼠,纯化免疫成功小鼠脾脏的mRNA,用RT-PCR方法扩增出抗人Endoglin抗体的可变区基因,1%琼脂糖凝胶电泳示,重链和轻链可变区基因大小分别为约340bp和约325bp,与预期相符;用重叠延伸PCR经Linker序列把重链和轻链可变区基因连接成单链抗体基因,1%琼脂糖凝胶电泳示,该基因大小约750bp,与预期相符,并用SfiⅠ和NotⅠ双酶切该基因;第二部分:把双酶切的抗人Endoglin单链抗体基因克隆入经同样双酶切的噬菌粒载体pCANTAB5E中,转化大肠杆菌E.coli TG1,再经辅助噬菌体M13KO7感染,成功构建抗人Endoglin单链抗体噬菌体呈现文库,库容量约为3.98×106;用rhEndoglin抗原对文库进行5轮吸附-洗脱-富集panning淘筛,继之用噬菌体ELISA筛选鉴定具有抗原结合能力的阳性重组噬菌体克隆,结果一次性从随机挑选的94个重组噬菌体克隆中筛选到37个阳性克隆,阳性克隆检出率约为39.36%;据噬菌体ELISA结果,对抗原亲和力最强的重组噬菌体克隆测序,获得单链抗体基因序列;经比对分析发现,该基因全长为738bp,共编码246个氨基酸残基。其中重链可变区基因编码122个氨基酸残基,位于单链抗体的N端,轻链可变区基因编码109个氨基酸残基,位于单链抗体的C端。两个可变区之间通过（Gly4Ser）3组成的15肽连接。经数据库查询,未发现任何与该单链抗体基因相同的序列;用ANTHEPROT V5.0软件对单链抗体蛋白的氨基酸序列进行分析,计算出目的蛋白的分子量为25925.818 Da。在重链和轻链可变区各有2个半胱氨酸,可形成2个二硫键。预测其等电点pI=9.015。并在生物医学网站,自动建模获得该基因编码蛋白的二级结构和三级结构的预测模型;第三部分:把第二部分测序正确的重组噬菌体感染大肠杆菌E.coli HB2151,经IPTG诱导,成功表达了可溶性单链抗体蛋白,用SDS-PAGE和Western Blot鉴定分析,蛋白分子量约为29×103,集中在大肠杆菌的周质和培养上清中,且周质中蛋白表达量最高。确定最佳培养条件为:温度30℃,振摇速度250rpm,IPTG浓度1mmol/L,诱导培养5h;用HiTrap Anti-E Tag Column亲和层析纯化经IPTG诱导培养5h的细菌周质提取物中的单链抗体,用HiTrap Desalting Column更换单链抗体的缓冲液为中性磷酸盐缓冲液,SDS-PAGE鉴定纯化抗体的纯度大于95%;用PEG 8000浓缩纯化的单链抗体,之后Bradford法测抗体浓度为1.12mg/ml;用竞争性ELISA检测单链抗体相对于抗rhEndoglin单抗的抗原结合活活性,结果表明,该单链抗体能与抗rhEndoglin单抗竞争性结合rhEndoglin抗原表位,且竞争作用随单链抗体浓度增加而增强;用间接ELISA测定单链抗体的功能性亲和常数为（2.14±0.84）×107M-1;间接免疫荧光实验表明,该单链抗体能检测到HUVEC胞膜上表达的Endoglin,激光共聚焦显微镜下表现为胞膜上散在分布的绿色荧光点;第四部分:用瘤细胞悬液皮下注射法接种SKOV3人卵巢癌细胞于裸鼠皮下,经病理组织学证实,成功建立了荷人卵巢癌裸鼠动物模型;石蜡切片的免疫组化结果发现,单链抗体能使移植卵巢癌的血管内皮胞膜呈阳性着色,表明该单链抗体与移植卵巢癌中鼠源性血管内皮有交叉反应;用预亚锡直接标记法完成单链抗体的99mTc标记,用纸层析法测定标记率为83%;从鼠尾静脉将99mTc标单链抗体注入荷瘤鼠体内,Spect仪器观察,对照组的肿瘤部位始终未显像,而实验组中,在注药后1h即可见肿瘤部位显像,注药后3h肿瘤显像最清晰;γ放射免疫计数器检测各组织的放射性计数,计算肿瘤组织放射性计数/非肿瘤组织放射性计数的比值,该比值反应了抗人Endoglin单链抗体在荷瘤鼠体内的分布特点,最高为2.96±1.71。结论:利用噬菌体表面呈现技术成功制备了抗人Endoglin单链抗体;体外实验证实该单链抗体具有较强的抗原结合能力;体内实验证实,通过该单链抗体靶向肿瘤新生血管内皮的作用,实现了荷瘤鼠体内移植卵巢癌的放射免疫显像。所以我们认为,该单链抗体有望作为靶向卵巢癌新生血管内皮的导向载体,为卵巢癌早期诊断方法的研究奠定了基础。
靳斌[8]（2008）在《胃癌相关抗原MG7-Ag的鉴定和功能分析》文中认为胃癌是最常见的恶性肿瘤之一,其死亡率居肿瘤的第二位。对胃癌的早期诊断和治疗是胃癌研究的重大课题。胃癌早期无明显症状,发现时已到晚期,预后极差。以往的胃癌标志物如CEA、CA50等对胃癌的敏感性和特异性较低,早期诊断受到限制。因此,寻找新的组织学、细胞学、血清学的胃癌新抗原,对胃癌诊治的意义重大。本实验室樊代明教授在上世纪八十年代研制出一系列胃癌单克隆抗体,命名为MG系列。其中,MG7-Ag对胃癌的敏感性特异性都很高。后续本实验室及国内医学专家对此进行了一系列相关深入的研究,包括胃癌单克隆抗体MG7对胃癌的诊断、评价预后及动态监测作用、MG7靶向治疗作用、特异性纳米疫苗的制备等等,在国内外发表了几十篇很有影响力的文章。但是,MG7-Ag尚未可知,MG7单抗在国际上的推广及进一步研究受到限制。香港科技大学学者鉴定MG7-Ag为hnRNPA2?B1,但是其性质与我们的以往研究的MG7-Ag不符。本研究使用免疫沉淀、双向电泳、质谱分析等技术鉴定MG7-Ag,对于发现新的癌抗原或癌蛋白,对于胃癌新的分子机制的研究有着不可估量的重要意义。此外,本研究拟建立一个简便的胃癌血清学早期诊断方法,用于胃癌高危人群的普查。MG7单抗对胃癌细胞凋亡作用的研究,为今后的临床药物治疗提供新的思路。总之,本项研究有深刻的理论意义和临床应用前景。【目的】1、免疫组织化学检测MG7-Ag在胃粘膜组织中的表达与分布特点及与临床特征的联系;2、研究MG7-Ag与hnRNPA2/B1的表达区别;3、MG7-Ag的鉴定;4、建立检测MG7-Ag的简便的胃癌血清学早期诊断方法;5、MG7单抗对胃癌细胞凋亡及细胞周期的影响。【方法】1、通过细胞培养技术复苏MG7杂交瘤细胞,制备MG7单抗;2、应用免疫组化技术检测MG7-Ag在胃粘膜组织中的表达与分布特点及与临床特征的联系;3、应用免疫组化技术观察MG7-Ag与hnRNPA2/B1在胃癌组织中的表达区别;4、应用免疫细胞化学技术和扫描共聚焦显微镜观察MG7-Ag与hnRNPA2/B1在胃癌细胞中的表达区别;5、通过Western blot技术检测MG7-Ag与hnRNPA2/B1胃癌细胞中的表达区别;6、应用免疫沉淀,Western blot,双向电泳,质谱技术鉴定MG7-Ag;7、通过酶联免疫吸附方法建立检测MG7-Ag的胃癌血清学早期诊断方法;8、通过MG7-Ag的胃癌血清学早期诊断方法检测胃癌,胃癌前病变和其它各种肿瘤病人;9、流式细胞仪检测MG7抗体对胃癌细胞凋亡和细胞周期的影响。【结果】1、MG7-Ag在胃粘膜组织中的表达与分布及与临床特征的联系检测了MG7-Ag在胃粘膜组织（胃癌116例;浅表性胃炎,肠化,增生、萎缩性胃炎等84例）石蜡组织标本中的表达与分布情况,发现MG7-Ag阳性表达率是随着浅表性胃炎,肠化,增生,胃癌,逐渐增高的。MG7-Ag阳性分布:1.腺上皮细胞的胞浆上极和胞膜;2.胃腺腔内。胃癌旁切片染色提示:胃黏膜腺体底部上皮细胞MG7-Ag几乎全部阳性,向顶端方向阳性细胞渐减少,而顶端腔面上皮细胞MG7-Ag又多为阳性。在胃癌患者中,MG7-Ag表达与年龄、性别无关,与分化和临床分期有关。2、MG7-Ag与hnRNPA2/B1在胃癌细胞中表达存在明显区别我们应用免疫组化技术检测同一胃癌石蜡切块中MG7-Ag与hnRNPA2/B1在胃癌细胞中的表达,发现MG7-Ag主要分布在细胞膜,细胞核中未见阳性表达,而hnRNPA2/B1主要分布在细胞核中。应用免疫细胞化学技术和扫描共聚焦观察MG7-Ag与hnRNPA2/B1在胃癌细胞SGC7901,MKN45中的表达区别,发现MG7-Ag主要分布在细胞膜上,细胞核中未见阳性表达,而hnRNPA2/B1主要分布在细胞核中。通过Western blot技术检测MG7-Ag与hnRNPA2/B1在胃癌细胞MKN45中的区别,MG7-Ag表现为2条带,分子量分别约100KD、120KD;hnRNPA2/B1表现为2条带,分子量分别约34KD、37KD。3、MG7-Ag的鉴定我们通过免疫沉淀方法,将MG7抗体分别与胃癌细胞系SGC7901,MKN45,胃癌组织交联,行单向或双向电泳。与Western blot相匹配的蛋白点从银染或考马斯亮蓝染色的胶中切下,转到离心管中做质谱检测。免疫沉淀的单向电泳,银染的表观分子量为100KD的胃癌组织条带和胃癌细胞系MKN45条带,LC-MS/MS分析鉴定最可能为anti-colorectal carcinoma heavy chain;考马斯亮蓝染色的表观分子量为100KD的胃癌细胞系MKN45条带和SGC7901条带,ESI-MS/MS分析鉴定最可能为anti-human CD19 monoclonal antibody 4G7 immunoglobulin gamma1 heavy chain。免疫沉淀的双向电泳,考马斯亮蓝染色的表观分子量为100KD的胃癌组织条带,MALDI-TOF/TOF分析鉴定为IGHG3 protein。通过Western blot技术,抗人IgG抗体可以与MG7-Ag结合,说明MG7-Ag可能为免疫球蛋白重链样分子。4、研发检测MG7-Ag的胃癌血清学早期诊断方法及应用应用间接酶联免疫吸附方法,生物素-亲和素放大系统,选择合适的包被条件和抗体浓度,检测胃癌手术前后,胃癌前病变和其他肿瘤患者的血清中MG7-Ag。PBS（0.01M）为阴性对照。大于阴性对照的A值的2.1倍为阳性。116例胃癌术前患者的阳性率为83.6%,明显高于胃癌术后（总63例,47.6%）,胃癌前病变（总78例,12.8%）和其它肿瘤组。统计学分析差别有显着意义（P<0.01）。MG7-Ag在其他肿瘤患者血清中也有不同程度的阳性表达,如肺癌（45.2%）,直肠癌（45.5%）,结肠癌（17.6%）,乳腺癌（14.2%）,而子宫癌,淋巴瘤,急性白血病患者中未检测出。胃癌术前患者血清检测MG7-Ag的的阳性表达率随着TNM分期进展逐渐升高:Ⅰ期（总6例,33.3%）,Ⅱ期（总46例,78.3%）,Ⅲ期（总62例,91.9%）,Ⅳ期（总2例,100%）,统计学显示各组间差别有显着意义（P<0.01）;N0（总30例,60.0%）,≥N1（总86例,91.9%）,统计学显示差别有显着意义（P<0.01）。以上结果提示,MG7-Ag是胃癌较特异性的标志,MG7-Ag的表达率随胃癌的进展而升高。间接酶联免疫吸附实验检测患者血清MG7-Ag可以作为胃癌的早期诊断的简便方法。5、MG7单抗对胃癌细胞凋亡及细胞周期的影响。应用流式细胞仪检测MG7单抗对胃癌细胞系KATOⅢ的凋亡影响,发现MG7单抗明显促进胃癌细胞的早期凋亡（P<0.05）。细胞周期检测,MG7单抗主要使胃癌细胞阻滞在G1期。【结论】本研究提示:MG7-Ag的表达水平与胃癌的分期和恶性程度相关,可能在胃癌的发生和进展中起重要的作用;MG7-Ag与hnRNPA2/B1在胃癌细胞表达中存在明显区别,MG7-Ag是hnRNPA2/B1的可能性不大;MG7-Ag可能为免疫球蛋白重链样分子;建立了MG7-Ag的胃癌血清学早期诊断方法,预计有较广阔的应用前景。MG7单抗对胃癌细胞有促进凋亡的作用,对细胞周期的影响主要在G1期。
万忠海[9]（2008）在《抗PEA单抗和单链抗体制备及在绿脓感染中的应用》文中提出绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginodsa PA）是导致外科手术或烧伤细菌感染死亡的最主要的病原细菌之一。绿脓杆菌外毒素A（PEA）是该菌的主要致病因子之一。PEA分为三个（IIII）功能区,I区与易感细胞识别有关;II区与PEA的“跨膜移位”有关;III区具有细胞毒性作用。PEA的毒性是其I区与细胞表面受体结合后,由受体介导的一系列反应引发的。所以抑制I区与受体的结合就可以阻断毒素的全部毒性作用。为获得绿脓杆菌外毒素A受体结合区蛋白,本研究将PEA受体结合区亚单位基因克隆到表达载体pET28（c）中,构建了原核表达质粒pET-28（c）+B10,表达了重组的绿脓杆菌外毒素A受体结合区蛋白,进行了免疫学实验。进而利用该蛋白免疫Balb/c小鼠制备了抗PEA单克隆抗体,抗PEA（3C6）单克隆抗体经过正辛酸和硫酸铵纯化后,对严重绿脓杆菌感染小鼠进行了疗效实验,效果明显。在此基础上,采用RT-PCR重叠延伸剪接法方法构建了单链抗体基因,并将基因克隆入pET28a中,筛选得到重组表达质粒pET28a-（PEA-1）ScFv。通过表达、变性、复性、纯化之后,进行了PEA的细胞毒性抑制实验。单链抗体在高浓度下能够起到一定的抑制作用。本研究旨在寻求治疗烧伤后绿脓杆菌感染的新方法新途径。
罗晨[10]（2007）在《鼻咽癌人源抗独特型单链抗体DNA疫苗的实验研究》文中研究表明目的：构建含鼻咽癌人源抗独特型单链抗体基因G22的真核表达载体，鉴定重组质粒真核表达的生物学活性，并将其制备成基因疫苗进行动物实验，为抗鼻咽癌疫苗的进一步研究奠定了基础。方法：PCR扩增G22 scFv基因，重组至真核表达载体pcDNA3.1（+）中，构建重组表达载体pcDNA3.1（+）-G22。将CNE2细胞经热休克预处理后，RT-PCR扩增人全长gp96基因，重组至真核表达载体pcDNA3.1（+）中，构建重组表达载体pcDNA3.1（+）-gp96。经酶切鉴定和DNA序列测定后，用脂质体法将重组质粒稳定转染入真核细胞，以Western Blotting和流式细胞术检测重组质粒的表达，进一步应用免疫组化和免疫荧光确定G22 ScFv基因表达的细胞定位。随后将重组质粒制备成基因疫苗，经肌肉注射免疫C57BL／6小鼠。一部分小鼠在末次免疫后15天起取血及脾组织，用间接ELISA、竞争抑制ELISA和流式细胞术检测G22 ScFv诱导的特异性免疫应答。另一部分小鼠于末次免疫后1周背部皮下分别接种5×106野生型CMT-93或转基因CMT-93／G22瘤细胞，观察荷瘤小鼠的肿瘤体积大小和生存期。结果：酶切鉴定和DNA序列分析证实，重组质粒pcDNA3.1（+）-G22和pcDNA3.1（+）-gp96构建成功，并经Western Blotting和流式细胞术等方法验证G22 scFv基因和人全长gp96基因能在真核细胞中正确表达。进一步用G22 scFv为免疫原，gp96为佐剂，以基因疫苗的形式免疫小鼠，可诱导产生抗鼻咽癌特异性抗体，其能竞争性抑制FC2McAb（针对鼻咽癌的单抗）与鼻咽癌细胞HNE2表面抗原的结合；可刺激小鼠的脾脏CD4+T细胞、CD8+T细胞升高；并对荷瘤小鼠表现免疫保护效应，延长生存期。结论：成功构建了真核表达载体pcDNA3.1（+）-G22，并验证G22ScFv基因在真核细胞中表达的生物学活性。通过动物实验证明G22抗独特型单链抗体可诱导机体产生特异性体液和细胞免疫应答，延长荷瘤动物的生存期，为抗独特型单链抗体的临床应用提供了一定的实验依据。
二、胃癌单克隆抗体MG7的噬菌体呈现型抗独特型单链抗体ScFv的制备（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、胃癌单克隆抗体MG7的噬菌体呈现型抗独特型单链抗体ScFv的制备（论文提纲范文）
（1）靶向免疫检查点LAG-3全人源抗体的研制及生物特性的鉴定（论文提纲范文）
| 英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 抗 LAG-3 人源单链抗体(scFv)的筛选及生物特性鉴定 |
| 1.材料、方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 第二章 抗LAG-3完整人源抗体的表达纯化及结合活性评价 |
| 1.材料、方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 个人简历 |
| 致谢 |
| 综述 LAG-3 及其抑制剂在肿瘤免疫治疗中的研究进展 |
| 参考文献 |
（2）抗CD40×HER2双特异性单链抗体的构建及抑制肿瘤增殖的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 一、抗CD40高亲和力单链抗体克隆的筛选 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 实验技术路线图 |
| 1.1.2 菌株及文库 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要溶液配方 |
| 1.1.5 主要培养基配方 |
| 1.1.6 主要仪器 |
| 1.1.7 实验方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 原始文库扩增后滴度测定 |
| 1.2.2 噬菌体展示个轮筛选筛选压力的测定 |
| 1.2.3 噬菌体展示各轮筛选克隆随机测序及相互比对 |
| 1.2.4 潜在阳性克隆的选择 |
| 1.2.5 噬菌体ELISA比较各克隆亲和力差异 |
| 1.2.6 第1次梯度噬菌体ELISA比较各克隆亲和力差异 |
| 1.2.7 第2次梯度噬菌体ELISA比较各克隆亲和力差异 |
| 1.2.8 8~#阳性克隆测序结果及分析 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 抗体筛选技术的选择 |
| 1.3.2 噬菌体展示系统的选择 |
| 1.3.3 噬菌体展示筛选策略的设计 |
| 1.3.4 潜在阳性克隆的选择 |
| 1.4 小结 |
| 二、抗CD40×HER2双特异性单链抗体的构建及蛋白表达 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验技术路线图 |
| 2.1.2 菌株及文库 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要溶液配方 |
| 2.1.5 主要培养基配方 |
| 2.1.6 主要仪器 |
| 2.1.7 实验方法 |
| 2.1.8 统计学方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 PCR扩增 8~#克隆CD40 ScFv的VH及VL片段 |
| 2.2.2 PCR扩增HER2 ScFv序列全长 |
| 2.2.3 重叠PCR拼接CD40×HER2 ScDb |
| 2.2.4 CD40×HER2 ScDb原核表达载体的构建及鉴定 |
| 2.2.5 CD40×HER2 ScDb基因测序及序列分析 |
| 2.2.6 CD40×HER2 ScDb基因序列翻译结果预测 |
| 2.2.7 CD40×HER2 ScDb蛋白理化性质分子结构预测 |
| 2.2.8 CD40×HER2 ScDb蛋白诱导表达及纯化 |
| 2.2.9 Western Blot检测目的蛋白His-tag表达 |
| 2.2.10 CD40×HER2 ScDb Ni-NTA琼脂糖蛋白纯化 |
| 2.2.11 BCA蛋白定量法测定CD40×HER2 ScDb蛋白浓度 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 双特异性单链抗体的构建 |
| 2.3.2 双特异性单链抗体蛋白表达体系的设计 |
| 2.3.3 重组蛋白原核表达产物的纯化 |
| 2.4 小结 |
| 三、抗CD40×HER2双特异性单链抗体免疫激活功能验证 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 实验技术路线图 |
| 3.1.2 实验动物及细胞 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 主要溶液及培养基配方 |
| 3.1.5 主要仪器 |
| 3.1.6 实验方法 |
| 3.1.7 统计学方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 小鼠骨髓来源树突状细胞体外诱导及培养 |
| 3.2.2 流式细胞术检测不同干预组小鼠DC细胞表面标志物表达水平 |
| 3.2.3 ELISA检测不同组小鼠DC细胞上清IL-12 细胞因子水平 |
| 3.2.4 流式细胞术检测富集小鼠脾脏淋巴细胞CD3~+T淋巴细胞比例 |
| 3.2.5 ELISA检测不同组T细胞共培养后IFN-γ 表达水平的差异 |
| 3.2.6 肿瘤特异性T淋巴细胞对 4T1肿瘤细胞的杀伤 |
| 3.2.7 不同组 4T1小鼠肿瘤模型肿瘤生长趋势的比较 |
| 3.2.8 ELISA检测不同干预小鼠肿瘤组织中IFN-γ 细胞因子的表达水平 |
| 3.2.9 ELISA检测不同干预小鼠肿瘤组织中IL-12(p70)细胞因子的表达水平 |
| 3.2.10 HE染色检测不同组肿瘤组织中淋巴细胞浸润 |
| 3.2.11 IHC检测肿瘤细胞内Cleaved-caspase-3 的表达水平 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 CD40激动型抗体激活肿瘤免疫反应 |
| 3.3.2 CD40×HER2 ScDb促进小鼠树突状细胞成熟 |
| 3.3.3 CD40×HER2 ScDb诱导肿瘤特异性的免疫杀伤 |
| 3.4 小结 |
| 四、抗CD40×HER2双特异性单链抗体HER2靶向功能验证 |
| 4.1 对象和方法 |
| 4.1.1 实验技术路线图 |
| 4.1.2 动物及细胞系 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 主要溶液及培养基配方 |
| 4.1.5 主要仪器 |
| 4.1.6 实验方法 |
| 4.1.7 统计学方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 细胞免疫荧光检测CD40×HER2 ScDb与HER2的靶向性 |
| 4.2.2 不同干预对T6-17 细胞增殖及形态的影响 |
| 4.2.3 CCK8检测不同干预对T6-17 细胞增殖的抑制率 |
| 4.2.4 WB检测不同组肿瘤细胞内PI3K/Akt信号通路相关分子的磷酸化水平 |
| 4.2.5 CD40×HER2 ScDb对裸鼠体内T6-17 肿瘤增殖的影响 |
| 4.2.6 HE染色检测不同干预对T6-17 肿瘤细胞形态的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 针对HER2的分子靶向治疗 |
| 4.3.2 CD40×HER2 ScDb体外对T6-17 细胞增殖的抑制作用 |
| 4.3.3 CD40×HER2 ScDb对PI3K/Akt信号通路的抑制作用 |
| 4.3.4 CD40×HER2 ScDb对MAPK/ERK1/2 信号通路的抑制作用 |
| 4.3.5 CD40×HER2 ScDb抑制T6-17 细胞在小鼠体内的增殖 |
| 4.4 小结 |
| 全文结论 |
| 展望 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 抗体类药物在恶性肿瘤治疗中的应用 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）鸡源性抗新城疫病毒磷蛋白胞内抗体的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 综述 |
| 1 新城疫病毒磷蛋白相关研究概况 |
| 2 单链抗体的应用前景 |
| 3 胞内抗体及其应用研究进展 |
| 4 胞质转导肽当前研究现状 |
| 5 问题与展望 |
| 6 本研究的目的和意义 |
| 7 本研究的总体实验思路及技术路线 |
| 第二章 鸡源性抗新城疫病毒单链抗体库的构建 |
| 第一节NDV scFv基因表达文库的构建 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物、菌株和质粒 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 三黄鸡的免疫及阴性、阳性血清的制备 |
| 2.2 总RNA的提取 |
| 2.3 鸡源性单链抗体库基因的构建 |
| 2.4 单链抗体原核表达质粒的构建 |
| 2.5 单链抗体表达抗体库的构建 |
| 2.6 重组质粒pOPE101-XP-scFv的诱导表达 |
| 2.7 重组质粒pOPE101-XP-scFv原核表达产物可溶性分析 |
| 2.8 重组质粒pOPE101-XP-scFv诱导表达分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 VH、VL基因的扩增 |
| 3.2 单链抗体基因的扩增 |
| 3.3 重组质粒pOPE101-XP-scFv的鉴定 |
| 3.4 鸡源性单链抗体库库容量与库多样性的评价 |
| 3.5 单链抗体阳性克隆的检测 |
| 3.6 重组质粒pOPE101-XP-scFv诱导表达条件的优化 |
| 3.7 重组质粒pOPE101-XP-scFv原核表达产物的纯化 |
| 4 小结 |
| 第二节 抗新城疫病毒单链抗体的筛选及鉴定 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 毒株及鸡胚 |
| 1.2 主要试剂及耗材 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 NDV F48E9病毒的纯化 |
| 2.2 间接ELISA筛选方法的建立 |
| 2.3 ELISA筛选条件的优化 |
| 2.4 单链抗体特异性实验 |
| 2.5 单链抗体阳性克隆序列分析比较 |
| 2.6 单链抗体的性质测定 |
| 2.7 单链抗体阳性克隆体外中和活性分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 新城疫病毒抗原的纯化鉴定 |
| 3.2 筛选方法的建立与优化 |
| 3.3 抗新城疫病毒单链抗体的筛选 |
| 3.4 单链抗体阳性克隆序列分析 |
| 3.5 单链抗体的生物学特性分析 |
| 3.6 单链抗体阳性克隆对NDV感染细胞的保护效果 |
| 4 小结 |
| 第三节 讨论 |
| 第三章 鸡源性抗新城疫病毒磷蛋白单链抗体筛选 |
| 第一节 新城疫病毒磷蛋白的原核表达及纯化 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒、菌株和质粒 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 磷蛋白表达基因的扩增、纯化和回收 |
| 2.2 磷蛋白表达基因的克隆 |
| 2.3 pET-28a-P融合蛋白基因的构建 |
| 2.4 NDV磷蛋白的抗原表位预测 |
| 2.5 重组质粒pET-28a-P诱导表达的鉴定 |
| 2.6 重组质粒pET-28a-P诱导原核表达条件的优化 |
| 2.7 重组质粒pET-28a-P原核表达产物的纯化及鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 NDV F48E9磷蛋白表达基因的PCR扩增结果 |
| 3.2 NDV F48E9磷蛋白表达基因的克隆与酶切鉴定 |
| 3.3 NDV F48E9磷蛋白表达基因测序结果及核苷酸和氨基酸序列分析 |
| 3.4 重组表达质粒pET-28a-P原核表达的鉴定 |
| 3.5 重组质粒pET-28a-P原核表达产物诱导表达条件的优化 |
| 3.6 重组质粒pET-28a-P原核表达产物诱导表达的纯化 |
| 4 小结 |
| 第二节 抗新城疫病毒磷蛋白单链抗体的筛选 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 病毒、菌株和质粒 |
| 1.2 主要试剂及耗材 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 间接ELISA筛选方法的建立 |
| 2.2 单链抗体阳性克隆序列分析比较 |
| 2.3 单链抗体的亲和力测定分析 |
| 2.4 Western blot分析新城疫病毒磷蛋白与单链抗体的结合 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 抗新城疫病毒磷蛋白单链抗体阳性克隆的获得 |
| 3.2 抗新城疫病毒磷蛋白单链抗体阳性克隆的序列分析 |
| 3.3 单链抗体阳性克隆亲和力分析结果 |
| 3.4 单链抗体与新城疫病毒磷蛋白的结合能力 |
| 4 小结 |
| 第三节 讨论 |
| 第四章 鸡源性抗新城疫病毒磷蛋白胞内抗体研制及生物活性分析 |
| 第一节 抗新城疫病毒磷蛋白胞内抗体的研制 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒、菌株、质粒和细胞 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 抗新城疫病毒磷蛋白胞内抗体基因的扩增 |
| 2.2 胞内抗体重组质粒的转染 |
| 2.3 RT-PCR检测抗新城疫病毒磷蛋白胞内抗体mRNA的表达 |
| 2.4 重组质粒转染细胞的表达检测 |
| 2.5 流式细胞仪检测两种融合蛋白诱导BHK21细胞凋亡分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 重组质粒的构建与鉴定 |
| 3.2 抗鸡新城疫病毒磷蛋白胞内抗体在BHK21细胞中的表达分析 |
| 3.3 Western blot检测胞内抗体的表达 |
| 3.4 流式细胞仪对两种融合蛋白的检测分析 |
| 4 小结 |
| 第二节 抗磷蛋白胞内抗体生物活性分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒和质粒 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 激光共聚焦观察胞内抗体在细胞定位 |
| 2.2 免疫共沉淀实验分析胞内抗体与磷蛋白的结合活性 |
| 2.3 抗鸡新城疫病毒磷蛋白胞内抗体对病毒的影响 |
| 2.4 实时定量荧光PCR检测胞内抗体对病毒的抑制效果 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 重组质粒pCDNA3.1-scFv-17和pCDNA3.1-scFv-103细胞内表达及定位分析 |
| 3.2 Western blot |
| 3.3 HA检测胞内抗体对NDV感染细胞的保护效果 |
| 3.4 抗鸡新城疫病毒磷蛋白胞内抗体对病毒复制及转录的影响 |
| 4 小结 |
| 第三节 讨论 |
| 第五章 鸡源性抗新城疫病毒磷蛋白穿膜性胞内抗体研制及生物学活性研究 |
| 第一节 穿膜抗体的构建及在E.coli中的表达 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株与质粒 |
| 1.2 主要生化试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 穿膜抗体基因的PCR扩增、纯化及回收 |
| 2.2 穿膜抗体基因的克隆 |
| 2.3 穿膜抗体重组质粒pET-28a-scFv-CTP的构建 |
| 2.4 重组质粒pET-28a-scFv-CTP的诱导表达及鉴定 |
| 2.5 重组质粒pET-28a-scFv-CTP原核表达条件的优化 |
| 2.6 重组质粒pET-28a-scFv-CTP原核表达产物的可溶性分析 |
| 2.7 重组质粒pET-28a-scFv-CTP原核表达产物的纯化 |
| 2.8 穿膜抗体蛋白包涵体的复性 |
| 2.9 重组质粒pET-28a-scFv-CTP原核表达产物的表达分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 pET-28a-scFv-CTP基因的PCR扩增结果 |
| 3.2 pET-28a-scFv-CTP基因的克隆与酶切鉴定 |
| 3.3 pET-28a-scFv-CTP基因测序分析 |
| 3.4 重组质粒pET-28a-scFv-CTP原核表达的鉴定 |
| 3.5 重组质粒pET-28a-scFv-CTP原核表达产物诱导表达条件的优化 |
| 3.6 重组质粒pET-28a-scFv-CTP诱导表达的可溶性分析 |
| 3.7 重组质粒pET-28a-scFv-CTP诱导表达蛋白的纯化 |
| 3.8 重组质粒pET-28a-scFv-CTP的表达分析 |
| 4 小结 |
| 第二节 穿膜抗体融合蛋白穿膜活性研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒、菌株和质粒 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 检测穿膜抗体融合蛋白进入细胞的最佳浓度 |
| 2.2 免疫荧光检测穿膜抗体融合蛋白在细胞中的定位 |
| 2.3 MTT法检测穿膜抗体融合蛋白对细胞活性影响 |
| 2.4 TCID50检测穿膜抗体融合蛋白对细胞的保护效果 |
| 2.5 荧光定量PCR实验检测穿膜抗体融合蛋白对新城疫病毒复制及转录的影响 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 穿膜抗体穿透细胞膜最佳浓度的确定 |
| 3.2 检测穿膜抗体融合蛋白在细胞内的定位 |
| 3.3 穿膜抗体融合蛋白对细胞毒性的测定 |
| 3.4 穿膜抗体融合蛋白对细胞保护效果的测定 |
| 3.5 穿膜抗体融合蛋白对病毒复制及转录的影响 |
| 4 小结 |
| 第三节 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间的论文及申请的专利 |
（4）基于展示技术筛选抗硝基呋喃类化合物单链抗体（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 主要缩写词 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 呋喃唑酮的研究现状 |
| 1.1.1 呋喃唑酮的理化性质及生物学特性 |
| 1.1.2 呋喃唑酮及其代谢物检测方法的研究进展 |
| 1.2 小分子抗体技术研究进展 |
| 1.2.1 Fab抗体 |
| 1.2.2 单链抗体 |
| 1.2.3 其他类型工程抗体 |
| 1.3 核糖体展示技术的发展 |
| 1.3.1 核糖体展示技术的基本原理 |
| 1.3.2 核糖体展示技术的优点 |
| 1.3.3 核糖体展示技术的研究进展 |
| 1.3.4 核糖体展示技术存在的问题 |
| 1.4 本课题主要研究内容及创新之处 |
| 1.4.1 本课题的研究背景 |
| 1.4.2 主要研究内容 |
| 1.4.3 创新之处 |
| 第二章 抗呋喃唑酮单链抗体的筛选 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验试剂 |
| 2.1.2 主要溶液和试剂配制 |
| 2.1.3 仪器设备 |
| 2.1.4 菌株与质粒 |
| 2.1.5 细胞株 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 呋喃唑酮抗原合成 |
| 2.2.2 偶联产物的检测 |
| 2.2.3 细胞培养 |
| 2.2.4 单链抗体文库的构建 |
| 2.2.5 体外转录和翻译 |
| 2.2.6 亲和筛选 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 FZD的还原及其鉴定 |
| 2.3.2 偶联产物的检测 |
| 2.3.3 杂交瘤细胞总RNA的提取 |
| 2.3.4 抗体可变区VH和VL的扩增 |
| 2.3.5 单链抗体基因VH-linker-VL的扩增结果 |
| 2.3.6 单链抗体文库的验证 |
| 2.3.7 核糖体展示筛选单链抗体库 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 单链抗体的原核表达及亲和力分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验试剂 |
| 3.1.2 主要溶液和试剂配制 |
| 3.1.3 仪器设备 |
| 3.1.4 菌株、质粒 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 单链抗体重组质粒的构建 |
| 3.2.2 单链抗体的原核可溶性表达 |
| 3.2.3 ELISA法筛选单链抗体 |
| 3.2.4 单链抗体表达条件的优化及纯化 |
| 3.2.5 SDS-PAGE检测可溶性表达产物 |
| 3.2.6 可溶性ScFv抗体的亲和力分析 |
| 3.2.7 ScFv抗体的交叉反应性分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 单链抗体ScFv片段的扩增结果 |
| 3.3.2 重组质粒pET-28a(+)-ScFv的构建和验证 |
| 3.3.3 ELISA法筛选阳性克隆子 |
| 3.3.4 单链抗体表达条件的优化 |
| 3.3.5 可溶性表达产物的诱导表达及纯化 |
| 3.3.6 可溶性ScFv抗体的亲和力分析 |
| 3.3.7 ScFv抗体的交叉反应性分析 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 呋喃唑酮酶联免疫检测方法的建立 |
| 4.1 材料与仪器 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 最佳包被抗原及单链抗体工作浓度的确定 |
| 4.2.2 一抗最佳反应时间的确定 |
| 4.2.3 二抗最佳反应时间的确定 |
| 4.2.4 TMB显色时间的确定 |
| 4.2.5 检测方法的最低检测限分析 |
| 4.2.6 间接竞争ELISA检测方法的精密度测试 |
| 4.2.7 样品加标回收率 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 包被抗原及单链抗体工作浓度的确定 |
| 4.3.2 一抗最佳反应时间的确立 |
| 4.3.3 二抗最佳反应时间的确立 |
| 4.3.4 TMB显色时间的确立 |
| 4.3.5 检测方法的最低检测限分析 |
| 4.3.6 间接竞争ELISA检测方法的精密度测试 |
| 4.3.7 样品加标回收率的测定 |
| 4.4 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 结论 |
| 建议与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录一: 抗呋喃唑酮单链抗体基因全序列 |
| 附录二: PET-28A(+)质粒图谱 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 在读期间已发表和录用的论文 |
（5）伏马菌素B1和赭曲霉毒素A噬菌体单链抗体库的构建及重组抗体蛋白的原核表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号及缩略语 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 伏马菌素研究进展 |
| 1 伏马菌素的理化特性 |
| 2 伏马菌素的毒性及作用机理 |
| 2.1 神经毒性 |
| 2.2 肺毒性 |
| 2.3 免疫系统的毒性 |
| 2.4 细胞毒性 |
| 2.5 肝肾毒性 |
| 2.6 致癌性 |
| 2.7 生殖毒性、胚胎毒性 |
| 2.8 伏马菌素与其他真菌毒素之间的互作毒性效应 |
| 3 伏马菌素的污染情况 |
| 4 伏马菌素的限量标准 |
| 5 伏马菌素的检测技术 |
| 5.1 薄层色谱法 |
| 5.2 气相色谱法 |
| 5.3 高效液相色谱法 |
| 5.4 液相色谱-质谱联用 |
| 5.5 酶联免疫法 |
| 5.6 其他方法 |
| 参考文献 |
| 第二章 赭曲霉毒素研究进展 |
| 1 赭曲霉毒素的理化特性 |
| 2 赭曲霉毒素的毒性及作用机理 |
| 2.1 OTA急性毒性 |
| 2.2 肾毒性 |
| 2.3 肝毒性 |
| 2.4免疫毒性 |
| 2.5 致癌性 |
| 2.6 致畸性 |
| 2.7 毒性作用机理 |
| 3 赭曲霉毒素的污染情况 |
| 4 赭曲霉毒素的限量 |
| 5 赭曲霉毒素的检测技术 |
| 5.1 薄层色谱法 |
| 5.2 高效液相色谱-荧光检测器联用法 |
| 5.3 液相-质谱联用法 |
| 5.4 免疫学检测法 |
| 5.5 其他检测方法 |
| 参考文献 |
| 第三章 单链抗体及噬菌体展示技术 |
| 1 单链抗体的构建 |
| 2 噬菌体展示系统 |
| 2.1 丝状噬菌体系统 |
| 2.2 T4噬菌体系统 |
| 2.3 λ噬菌体系统 |
| 2.4 T7噬菌体展示系统 |
| 3 单链抗体的表达 |
| 4 单链抗体的发展 |
| 4.1 靶向载体 |
| 4.2 细胞内免疫 |
| 4.3 构建其它工程抗体 |
| 4.4 其他方面研究 |
| 5 单链抗体及噬菌体展示技术的应用 |
| 5.1 新型疫苗的研发 |
| 5.2 获得稀有的单克隆抗体 |
| 5.3 诊断与免疫治疗 |
| 5.4 在蛋白质组学研究中的应用 |
| 5.5 噬菌体展示技术在真菌毒素方面应用 |
| 参考文献 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第四章 伏马菌素B_1和赭曲霉毒素A完全抗原的合成与鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试剂与耗材 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 仪器设备 |
| 1.4 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 紫外扫描法鉴定OTA及FB_1完全抗原 |
| 2.2 凝胶电泳法鉴定完全抗原 |
| 2.3 红外光谱法鉴定完全抗原 |
| 2.4 MALDI-TOF-MS鉴定完全抗原及测定偶联比 |
| 2.5 ELISA鉴定完全抗原免疫原性 |
| 3 讨论 |
| 3.1 完全抗原的合成 |
| 3.2 凝胶电泳法鉴定偶联效果 |
| 3.3 完全抗原偶联结合比的确定 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 伏马菌素B_1单链抗体可变区基因克隆与噬菌体抗体蛋白的原核表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试剂及耗材 |
| 1.2 细胞株、菌株与质粒 |
| 1.3 仪器设备 |
| 1.4 引物 |
| 1.5 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL)基因扩增 |
| 2.2 单链抗体可变区基因片段(ScFv)的组装与扩增 |
| 2.3 ScFv基因片段T-A亚克隆产物酶切鉴定结果 |
| 2.4 pCANTAB5E-ScFv重组质粒构建与鉴定 |
| 2.5 FB_1噬菌体抗体库滴度 |
| 2.6 免疫亲和筛选条件确定 |
| 2.7 噬菌体单链抗体库的富集结果 |
| 2.8 阳性噬菌体单链抗体筛选结果 |
| 2.9 噬菌体重组单链抗体的可溶性表达 |
| 3 讨论 |
| 3.1 噬菌体展示技术及免疫亲和筛选技术 |
| 3.2 ELISA筛选技术 |
| 3.3 单链抗体蛋白的原核表达与宿主菌的选择 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第六章 赭曲霉毒素A单链抗体可变区基因克隆与噬菌体抗体蛋白的原核表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 引物 |
| 1.3 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL)基因扩增 |
| 2.2 单链抗体可变区基因片段(ScFv)的组装与扩增 |
| 2.3 pCANTAB5E-ScFv重组质粒构建与鉴定 |
| 2.4 OTA噬菌体抗体库滴度 |
| 2.5 噬菌体单链抗体库的富集结果 |
| 2.6 阳性噬菌体单链抗体筛选结果 |
| 2.7 噬菌体重组单链抗体的可溶性表达 |
| 3 讨论 |
| 3.1 单链抗体可变区基因片段的扩增的引物设计 |
| 3.2 单链抗体可变区基因的来源选择 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第七章 伏马菌素B_1和赭曲霉毒素A单链抗体特性鉴定 |
| 1 材料及方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 Western Blotting结果 |
| 2.2 ELISA分析单链抗体免疫活性结果 |
| 2.3 FB_1及OTA单链抗体效价 |
| 2.4 单链抗体活性的鉴定结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 全文总结 |
| 全文创新点 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表的论文及其他 |
（6）人胃癌相关抗原MG7与COX-2在胃癌前病变组织中的表达及应用价值（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 正文 |
| 第一部分 Mg7-Ag和COX-2 在胃癌前病变组织和非胃癌前病变组织中的表达情况 |
| 前言 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 MG7-Ag和COX-2 在胃癌前病变组织中表达的相关性分析 |
| 前言 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 人胃癌相关抗原MG7 和COX-2 联合检测预警胃癌前病变进展的研究 |
| 前言 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（7）抗人Endoglin单链抗体的制备及其在荷人卵巢癌裸鼠体内放射免疫显像初探（论文提纲范文）
| 英文缩写一览表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 论文正文 抗人Endoglin 单链抗体的制备及其在荷人卵巢癌裸鼠体内放射免疫显像初探 |
| 前言 |
| 第一部分 抗人Endoglin-scFv 基因的构建 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 抗人Endoglin-scFv 噬菌体呈现文库的构建、筛选及鉴定 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 抗人Endoglin-scFv 的可溶性表达、纯化及生物活性鉴定 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第四部分 ~(99m)Tc 标记抗人Endoglin-scFv 在荷人卵巢癌裸鼠体内的分布及放射免疫显像研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 附记 |
| 致谢 |
| 照片 |
| 参考文献 |
| 文献综述一 Endoglin 在恶性肿瘤中的研究意义 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 单链抗体及其在肿瘤诊断和治疗中的应用 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间参与的科研学术 |
| 英文论着 |
（8）胃癌相关抗原MG7-Ag的鉴定和功能分析（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 一 MG7 |
| 二 HnRNP 和 HnRNPA2/B1 |
| 三 蛋白质组学与肿瘤 |
| 四 免疫球蛋白与肿瘤 |
| 正文 |
| 第一部分 MG7-Ag 在胃粘膜组织中的表达与分布及临床特征的联系 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 MG7-Ag 与hnRNPA2/81 的区别 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 MG7-Ag 的鉴定 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第四部分 胃癌血清学早期诊断ELISA 方法的建立及应用 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第五部分 MG7 单抗对胃癌细胞的凋亡作用 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（9）抗PEA单抗和单链抗体制备及在绿脓感染中的应用（论文提纲范文）
| 提要 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 烧伤感染及绿脓杆菌外毒素 A |
| 第二章 单链抗体研究进展 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 重组 PEA 受体结合区基因在大肠杆菌中的表达及免疫实验 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 抗 PEA 受体结合区单克隆抗体的制备与鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 抗 PEA 受体结合区单克隆抗体在严重绿脓杆菌感染中的作用 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 抗 PEA 单链抗体基因的克隆及原核表达载体的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 （PEA-1）ScFv 表达纯化复性与生物学特性的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文及其他成果 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 致谢 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| CURRICULUM VITAE |
（10）鼻咽癌人源抗独特型单链抗体DNA疫苗的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1.英文缩写注释 |
| 2.前言 |
| 1.抗独特型抗体在肿瘤免疫治疗中的应用 |
| 2.基因疫苗在肿瘤免疫治疗中的优越性 |
| 3.技术路线 |
| 4.第一部分:鼻咽癌人源抗独特型单链抗体的真核表达及鉴定 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 5.第二部分:鼻咽癌人源抗独特型单链抗体基因疫苗的实验研究 |
| 5.1 材料 |
| 5.2 方法 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.4 讨论 |
| 6.结论 |
| 7.参考文献 |
| 8.综述 |
| 9.致谢 |
| 10.硕士期间发表的论文和获得的奖励 |
四、胃癌单克隆抗体MG7的噬菌体呈现型抗独特型单链抗体ScFv的制备（论文参考文献）
- [1]靶向免疫检查点LAG-3全人源抗体的研制及生物特性的鉴定[D]. 陈秀秀. 安徽医科大学, 2020
- [2]抗CD40×HER2双特异性单链抗体的构建及抑制肿瘤增殖的实验研究[D]. 陆礼. 天津医科大学, 2017(01)
- [3]鸡源性抗新城疫病毒磷蛋白胞内抗体的研究[D]. 李本强. 上海交通大学, 2015(02)
- [4]基于展示技术筛选抗硝基呋喃类化合物单链抗体[D]. 陈荫楠. 福州大学, 2015(07)
- [5]伏马菌素B1和赭曲霉毒素A噬菌体单链抗体库的构建及重组抗体蛋白的原核表达[D]. 王莹. 南京农业大学, 2012(11)
- [6]人胃癌相关抗原MG7与COX-2在胃癌前病变组织中的表达及应用价值[D]. 刘霖. 第四军医大学, 2009(12)
- [7]抗人Endoglin单链抗体的制备及其在荷人卵巢癌裸鼠体内放射免疫显像初探[D]. 赵泽文. 第三军医大学, 2008(05)
- [8]胃癌相关抗原MG7-Ag的鉴定和功能分析[D]. 靳斌. 第四军医大学, 2008(01)
- [9]抗PEA单抗和单链抗体制备及在绿脓感染中的应用[D]. 万忠海. 吉林大学, 2008(11)
- [10]鼻咽癌人源抗独特型单链抗体DNA疫苗的实验研究[D]. 罗晨. 中南大学, 2007(06)