一、反义寡核苷酸技术的进展及在医学中的应用（论文文献综述）
任炯羽[1]（2021）在《靶向LncRNA HOTAIR的反义显像初探》文中研究指明目的长链非编码RNA（long noncoding RNA,LncRNA）HOTAIR（HOX transcript antisense RNA）在人类许多肿瘤中扩增和过表达,可作为肿瘤治疗的有效靶点。99mTc标记的反义寡核苷酸（antisense oligonucleotides,ASON）可显示HOTAIR的表达,对恶性肿瘤有诊断和治疗价值,为恶性肿瘤的发生及预后提供重要的信息。本研究旨在用放射性核素99mTc合成一种新型的靶向LncRNA HOTAIR的反义寡核苷酸探针99mTc-HYNIC-ASON,鉴定探针在体内体外的理化性质、探讨其经过脂质体转染后对人脑胶质瘤U87细胞增殖和迁移能力的影响,并对恶性胶质瘤荷瘤裸鼠进行体内生物分布及活体成像研究。方法设计并合成针对LncRNA HOTAIR的反义寡核苷酸（ASON）探针序列为5′-AATTCTTAAATTGGGCTGG-3′以及错配反义寡核苷酸（ASONM）探针序列5′-AATACTTAGATTAGGCAGG-3′。序列通过甲基化及硫代修饰以提高稳定性和抗降解能力,以NH2C6作为连接子,即合成结构式为5′-NH2C6-ASON-3′,通过双功能螯合剂HYNIC和Tricine缓冲液偶联99mTc。以相同的方法标记错配反义寡核苷酸,经Sephadex G25纯化后,利用ITLC纸层析法,以盐水为展开剂检测高峰管探针的标记率、放化纯、在新鲜人血清中的稳定性;琼脂糖凝胶电泳实验检测探针的抗降解能力。复苏恶性胶质瘤U87细胞株,以脂质体2000转染放射性标记的探针,利用γ放射免疫计数器测定肿瘤细胞对探针的摄取率;细胞划痕试验及CCK-8（Cell Counting Kit-8）试验分别检测转染探针后肿瘤细胞迁移及增殖能力的变化。此外,扩增培养U87细胞,以1×1010个细胞,1.5ml每只小鼠接种于裸鼠右前腋下,待肿瘤直径达1.5-2.0cm左右时,选取肿瘤大小无显着差异、形态规则的荷瘤裸鼠用于后续实验。生物分布实验,取20只荷瘤裸鼠随机分为五组,分别经鼠尾静脉注射脂质体包裹的反义探针(即Lip-99mTc-HYNIC-ASON),脂质体包裹的错配探针(即Lip-99mTc-HYNIC-ASONM)1μg,2.59MBq（100μL）,于注射后1h、2h、3h、4h、6h（错配组2h、4h）分别取一组荷瘤裸鼠进行脱颈处死,取心、肝、脾、肾、胃、小肠、膀胱、肌肉、骨、肿瘤进行称重并测量放射性计数;显像实验,取4只荷瘤裸鼠随机分反义显像组、错配组、阻断组和99mTc对照组。反义组与错配组分别注射4μg,14.8MBq（150μL）Lip-99mTc-HYNIC-ASON、Lip-99mTc-HYNIC-ASONM;阻断组在注射Lip-99mTc-HYNIC-ASON 2h前注射10μg脂质体转染的未标记探针;99mTc对照组注射与实验组相同放射性活度的99mTc溶液,四组分别于注射后1h、2h、4h、6h、8h进行SPECT显像,观察肿瘤部位的放射性摄取情况。所有数据采用SPSS 22.0统计软件进行数据处理,计量资料以均数±标准差（±s）表示,两组比较用T检验,多组比较采用方差分析。显着性判断标准:当P<0.05时,说明受检组数据之间的差异有统计学意义。结果（1）ITLC测定反义探针99mTc-HYNIC-ASON和错配探针99mTc-HYNIC-ASONM的标记率分别为（91±1.5）%和（90±0.6）%,放化纯度经检测均大于89%;凝胶电泳实验证实99mTc与探针成功标记并且没有发生明显的降解;经ITLC检测,探针在与生理盐水和人新鲜血清中孵育表现出良好的稳定性,且12h内放化纯度高于80%。（2）此外,细胞摄取实验表明脂质体具有携带探针进入细胞的能力,与未转染的探针相比（0.6%）,脂质体转染后的探针在肿瘤细胞中的最大摄取率为3.0%,差异有统计学意义（t=15.6～21.56,P<0.01）;CCK-8实验、细胞划痕实验结果显示,转染探针Lip-99mTc-HYNIC-ASON能抑制肿瘤细胞的增殖和迁移能力,与未转染组探针相比,差异均具有统计学意义（t=2.336～30.23,P<0.05;t=51.54,P<0.01,F=331.8,P<0.01）。（3）生物分布研究表明,脂质体包裹的反义探针99mTc-HYNIC-ASON在肿瘤中高度聚集,且肿瘤摄取明显高于错配组,肿瘤与肌肉的比值也明显高于错配组。同时,注射脂质体包裹的反义探针99mTc-HYNIC-ASON后1h SPECT/CT显像可获得清晰的肿瘤部位浓聚影,2h时显影最为清晰;错配组和阻断组则均未见肿瘤显影。结论靶向HOTAIR恶性胶质瘤的反义寡核苷酸探针99mTc-HYNIC-ASON可成功制备,该探针标记率高、稳定性良好,靶向结合能力强,能够抑制胶质瘤U87细胞的增殖和迁移,并且该脂质体包裹的反义探针99mTc-HYNIC-ASON可用于体内恶性胶质瘤中lnc RNA HOTAIR的实时显像,观察HOTAIR的表达,是一种新型的无创性靶向探针,有望用于恶性胶质瘤的早期和特异性诊断。
刘晓亭[2]（2020）在《新型核酸纳米载体的设计及在肿瘤细胞成像和药物递送中的应用研究》文中指出目前医学水平和诊断技术得到了快速的发展,但癌症的发病率和死亡率仍然处在较高水平,是威胁人类健康和生命的重大疾病之一。癌症的早期诊断和精准治疗是决定癌症能否得到成功治愈的关键因素。近年来,肿瘤标志物的不断发现为癌症早期诊断提供了保障,细胞内肿瘤标志物种类较多,表达水平也有所差异,对于一些低表达丰度的肿瘤标志物需要建立更加灵敏的分析方法。另一方面,化学治疗作为癌症治疗的经典方法之一,但化疗通常会受到化疗药物低溶解性、强的毒副作用及耐药性等问题的制约,因此,需要开发具有特定功能的纳米载体进行化疗药物的递送。本论文致力于新型核酸纳米载体的设计及在肿瘤细胞成像和药物递送方面的应用研究。通过对目前已报道的核酸纳米载体进行总结,发现随着核酸纳米载体研究的深入,仍然存在一些不足和挑战:（1）现有的核酸纳米载体多为细胞质递送化疗药物,耐药细胞中细胞膜上过表达的外排转运体会将细胞质中的药物重新泵出细胞,降低细胞内的药物浓度,限制化疗效果,因此,如何构建药物作用位点靶向的核酸纳米载体对于提高药物的作用效果具有重要意义;（2）在应对化疗过程中出现的药物耐受性的问题上,常用的策略是利用纳米载体避开外排转运体介导的药物外排,而直接抑制外排转运体的表达是一种更根本的策略来应对药物耐受性;（3）细胞内许多肿瘤标志物的表达丰度偏低,目前多数具有细胞成像和药物递送双重功能的核酸纳米载体输出方式为1:1式,极大的限制了检测的灵敏度和药物释放,构建具有信号放大特性的核酸纳米载体来实现活细胞内肿瘤标志物的灵敏检测及药物释放是一个关键问题。基于以上问题和挑战,设计了三种新型的核酸纳米载体用于活细胞内肿瘤标志物的成像及药物递送。本文主要分为以下五章内容:第一章为绪论部分,主要分析了癌症诊断和治疗上所面临的严峻挑战,介绍了用于核酸纳米载体设计的经典核酸结构单元、金纳米颗粒,概述了核酸纳米载体在癌症诊断与治疗中的研究进展,并以此为基础总结了目前核酸纳米载体在细胞成像和药物递送上存在的问题。第二章,构建了一种内源性刺激响应核靶向的纳米载体（AuNP-mRS-DSs）用于活细胞内MRP1 mRNA的成像和药物递送。纳米载体由三部分组成:（ⅰ）金纳米颗粒（AuNP）,用于装载DNA和淬灭荧光;（ⅱ）mRNA识别序列（mRS）通过金-硫键连接到AuNP表面,用于MRP1 mRNA的特异性识别;（ⅲ）可拆卸的亚单位（DS）,由Cy5标记的DNA连接链和核仁素识别基序（含AS1411适体）杂交而成,并通过DNA连接链连接到mRS上,用于装载阿霉素（Dox）、结合核仁素及荧光信号的输出。首先,纳米载体的核仁素识别基序靶向肿瘤细胞表面过表达的核仁素,然后整个纳米载体在核仁素介导的内化作用下进入细胞。随后,mRS特异性识别过表达的MRP1 mRNA,从而释放束缚的DS,被AuNP淬灭的Cy5荧光恢复。最后,利用核仁素从细胞质到细胞核穿梭的作用,DS靶向细胞核递送Dox。细胞内荧光成像可以实现耐药细胞和非耐药细胞的区分。此外,通过荧光成像可以观察到耐药细胞中释放的可拆卸亚单位的分布。与游离阿霉素（IC50>8.00 μM）相比,将 Dox 装载到 AuNP-mRS-DSs 后对 MCF-7/ADR细胞的IC50更低为2.20 μM,这表明利用核酸纳米载体载药对耐药的乳腺癌细胞具有极好的抑制效果。该纳米载体在癌症化疗敏感性预测和耐药性的规避上具有重要意义。第三章,构建了多功能分子信标（MBs）修饰的金纳米颗粒作为纳米载体（MBs-AuNP）,用于活细胞内耐药相关mRNA的协同抑制及原位成像。MBs-AuNP由两部分构成:（ⅰ）三种特殊设计的分子信标修饰到AuNP表面,用于结合耐药相关的mRNAs,装载Dox并输出荧光信号;（ⅱ）AuNP,用于装载MBs,介导MBs进入细胞并淬灭荧光。被细胞摄取后,MBs-AuNP与三种不同的耐药相关 mRNA（MDR1 mRNA、MRP1 mRNA 和 BCRP mRNA）杂交,通过抑制mRNAs的翻译过程来减少外排蛋白的表达,同时,被AuNP淬灭的荧光团远离金纳米粒,荧光恢复,实现mRNAs的原位成像。实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）和蛋白印迹结果表明,经MBs-AuNP处理后耐药肿瘤细胞内耐药相关mRNA和外排蛋白的表达均有所下降。与游离Dox相比,Dox-MBs-AuNP对HepG2/ADR（IC50:0.35 vs 1.06μM）和 MCF-7/ADR（IC50:2.78 vs>5μM）具有更好的细胞毒性。通过荧光成像分析可直接观察细胞内杂交事件并实现耐药和非耐药肿瘤细胞的区分。该纳米载体能够通过基因沉默来下调多种外排蛋白的表达,实现对沉默事件的原位监测,提供了一种从基因水平应对药物耐受性的策略。第四章,构建了一种端粒酶特异性的DNAzyme驱动的DNA walker作为纳米载体（tsDNA-AuNP）用于细胞内端粒酶的活性分析及药物递送。该纳米载体由三部分构成:（ⅰ）AuNP,用于装载DNA并淬灭荧光;（ⅱ）行走链,由端粒酶引物和含DNAzyme序列的发卡结构杂交而成,用于结合端粒酶及切割底物发卡;（ⅲ）含有DNAzyme切割位点的底物发卡,用于装载阿霉素并输出荧光信号。该纳米载体内化入胞后,端粒酶引物在端粒酶的作用下发生延伸,打开含DNAzyme序列的发卡结构,释放被封闭的DNAzyme序列,然后行走链沿着三维的轨道运动,在外加Mn2+的作用下切割含DNAzyme切割位点的底物发卡,输出荧光信号并释放阿霉素,随后进行下一轮的切割反应。该方法能够实现低至10个HeLa细胞中端粒酶活性的检测,通过荧光成像的方法能够实现肿瘤细胞和正常细胞的区分,此外,该核酸纳米载体也能够用于端粒酶抑制剂的筛选。第五章为结论部分,主要总结了本论文的创新点及前景展望。
李志琴[3]（2019）在《LAG3干扰寡核苷酸作为重组蛋白疫苗和灭活流感病毒疫苗佐剂的研究》文中进行了进一步梳理淋巴细胞活化基因-3（Lymphocyte activation gene-3,LAG3）是表达在T细胞表面的抑制性受体（Inhibitory receptor,IR）。T细胞表达多种IRs,如T淋巴细胞相关抗原4（T-lymphocyte-associated antigen-4,CTLA-4）和程序性死亡蛋白1（programmed cell death protein-1,PD-1）等,来避免由于免疫反应的失控导致的免疫细胞过度活化、调节免疫反应的持续时间和幅度、维持免疫耐受、避免组织损伤和自身免疫病的发生。但是IRs持续性的高表达,可抑制T细胞功能,导致T细胞的无应答,无法发挥免疫作用。靶向封闭IRs,使T细胞恢复活性已被证明可显着增强抗病毒和抗肿瘤的免疫反应,这些IRs也因此被称为免疫检查点（immune checkpoint）。目前,靶向性封闭CTLA-4、PD-1或其配体PD-L1的治疗手段已经应用于临床治疗多种肿瘤,这表明了阻断T细胞抑制性信号用于疾病治疗的可行性。但是仍有很多患者未从这些药物中获益,因此仍然需要更多靶向各种类型免疫检查点的研究。LAG3也是一种免疫检查点,当其与MHCⅡ结合时可直接抑制T细胞活化的第一信号,负性调控T细胞的功能。靶向封闭LAG3可通过抑制LAG3传导的抑制信号,显着增强T细胞活性,进而提高免疫反应。目前,尚未见到靶向LAG3的寡核苷酸类抑制物的报道。在本研究中,设计了靶向LAG3的反义寡核苷酸,并探究了其维持T细胞反应的效应以及作为重组蛋白疫苗和灭活流感病毒疫苗佐剂的可能性。在探究靶向LAG3的反义寡核苷酸是否也能作为肿瘤疫苗佐剂增强抗肿瘤活性的研究中,我们意外的观察到了Lewis肺癌肿瘤裂解物引起的小鼠十二指肠致死性坏死,并探讨了此种坏死发生的可能原因。1.LAG3干扰反义寡核苷酸的设计与筛选为了设计靶向LAG3的反义寡核苷酸（antisense oligonucleotides,ASOs）,利用NCBI核苷酸数据库分别获得人和小鼠的LAG3 mRNA序列,并通过BLAST网站筛选出可用于设计ASOs的保守区。在对保守区序列进行特异性检测后,筛选出15个可用于设计ASOs的靶向区域。然后,设计出15个与这些靶向区域完全反向互补的ASOs,并利用“sfold”和“mfold”网站以结合位点的二级结构、结合自由能以及是否含有惰性序列作为筛选指标对这些序列进行评估。结果显示,有两个符合要求的LAG3干扰寡核苷酸（LAG3 interfering antisense oligonucleotides,LIOs）,即LIO-1和LIO-2,可用于后续研究。2.LIO进入免疫细胞的情况分析为了探究LIO能否进入免疫细胞尤其是T细胞,将LIO-1和LIO-2分别标记了Cy3荧光信号后,采用流式细胞术观察了na?ve ICR小鼠淋巴结细胞和脾细胞中的总T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、B细胞以及DC细胞对LIO-1及LIO-2的摄取情况。然后,利用免疫荧光技术进一步观察了LIO是否能定位于T细胞内部。结果显示,淋巴结细胞及脾细胞中的主要免疫细胞均可摄取LIO-1和LIO-2,并且LIO-1和LIO-2可定位于CD4+T细胞和CD8+T细胞的内部。结果提示:LIO-1和LIO-2均可以进入T细胞内部。3.LIO对T细胞LAG3表达的抑制效应为了探究LIO-1和LIO-2是否可以抑制LAG3的表达,首先利用RT-PCR技术检测了LIO对脾细胞中LAG3 mRNA表达的影响,然后利用流式细胞术分别检测了LIO对脾和引流淋巴结中的T细胞以及人T细胞淋巴瘤细胞系（Jurkat）细胞LAG3蛋白表达的影响。结果显示:1)LIO-1可抑制脾细胞中LAG3 mRNA的表达,LIO-2无明显作用;2)LIO-1可降低脾和引流淋巴结中CD4+T细胞和CD8+T细胞LAG3的表达,LIO-2无此效果;3)LIO-1可减少Jurkat细胞表面LAG3的表达,LIO-2仍然没有显着效果。由此可见,LIO-1可抑制LAG3的表达,但是LIO-2未能发挥抑制作用。4.在recall反应中LIO对抗原特异性T细胞反应的影响为了探究在recall反应中LIO对抗原特异性T细胞反应的影响,分离了LIO联合重组猪圆环病毒2b型（porcine circovirus type 2b,PCV2b）衣壳蛋白（CP）疫苗免疫的小鼠的脾细胞后,在体外使用CP蛋白再次刺激。然后利用T细胞增殖实验检测了抗原特异性CD4+T和CD8+T细胞的增殖情况。此外,还采用实时定量PCR技术检测了上述脾细胞在CP刺激后,细胞因子干扰素-γ（Interferon-gamma,IFN-γ）、白细胞介素-2（interleukin-2,IL-2）、IL-4和IL-6的mRNA表达情况。结果显示:1)LIO-1可以显着提高重组蛋白疫苗诱导的抗原特异性CD4+T细胞的增殖比例,但对抗原特异性CD8+T细胞的增殖比例无明显影响;2)LIO-1可显着提高脾细胞中IFN-γ、IL-2和IL-6的mRNA表达水平。由此可见,在recall反应中,当再次暴露于抗原时,LIO-1可以促进重组蛋白疫苗诱导的抗原特异性CD4+T细胞增殖以及细胞因子IFN-γ、IL-2和IL-6的产生。5.LIO对维持抗原特异性T细胞活化的影响为了进一步探究在体内LIO对维持抗原特异性T细胞活化的影响,本研究在小鼠第二次免疫LIO联合重组CP蛋白疫苗48h后,利用流式细胞术检测了小鼠引流淋巴结和脾中CD4+T细胞和CD8+T细胞表面T细胞早期活化标志CD69的表达情况。此外,本研究还利用实时定量PCR技术检测了上述引流淋巴结细胞和脾细胞中细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-6 mRNA的表达水平。结果显示:1)LIO-1可提高重组蛋白疫苗诱导的引流淋巴结细胞中CD4+CD69+T细胞的比例。2)LIO-1可提高重组蛋白疫苗诱导的引流淋巴结细胞中IFN-γ和IL-2的mRNA表达。由此可见,LIO-1在体内可维持引流淋巴结中CD4+T细胞的活化,并可促进细胞因子IFN-γ和IL-2的产生。6.LIO对重组蛋白疫苗和灭活流感病毒疫苗诱导的抗体反应的促进作用由于LIO-1可显着增强CD4+T细胞反应,这提示其有可能可以促进重组蛋白疫苗和灭活流感病毒疫苗诱导的抗体反应。为了验证这一猜想,本研究使用间接ELISA技术检测了LIO-1联合重组CP蛋白疫苗或是联合灭活FM1流感病毒疫苗免疫小鼠时,诱导的抗体反应。结果显示:1)LIO-1可显着提高重组CP蛋白疫苗诱导的抗体水平;2)LIO-1可显着提高灭活FM1流感病毒疫苗诱导的抗体水平。由此可见,LIO-1可作为佐剂,增强重组蛋白疫苗和灭活病毒疫苗诱导的抗体反应。7.CD8+T细胞和IFN-γ与小鼠十二指肠坏死的相关性观察在进一步探究LIO-1是否也能作为肿瘤疫苗佐剂时,我们意外的发现了Lewis肺癌肿瘤裂解物疫苗（LCLV）注射na?ve C57BL/6小鼠可引起广泛的十二指肠致死性坏死。为了探究这一现象发生的原因,na?ve小鼠注射LCLV后,在小鼠濒死时,利用流式细胞术分别检测了小鼠外周血白细胞（peripheral white blood cells,PWBC）、脾细胞及引流淋巴结细胞中CD4+T细胞和CD8+T的比例,并利用实时定量PCR技术检测了小鼠PWBC和脾细胞中IFN-γmRNA的表达情况。注射生理盐水的小鼠作为对照。结果显示:1)注射LCLV的小鼠PWBC中CD8+T细胞比例增高了5倍,达到约50%。2)相比于正常小鼠,注射LCLV的小鼠PWBC中IFN-γ表达水平迅速提高了约12倍。这提示,小鼠外周血中显着的CD8+T和IFN-γ产生的增高可能与十二指肠致死性坏死存在相关性。综上所述,在本研究中,设计了靶向LAG3的反义寡核苷酸药物（LIO-1）,并证明LIO-1能进入T细胞内部;可诱导LAG3 mRNA的降解;抑制CD4+T细胞LAG3的表达;维持抗原特异性CD4+T细胞的增殖;促进CD4+T细胞的活化;促进细胞因子IFN-γ、IL-2和IL-6的产生;增强重组蛋白疫苗和灭活流感病毒疫苗诱导的抗体反应。因此,LIO-1作为LAG3的核酸类抑制剂,可以增强微生物疫苗诱导的抗体反应,有成为一种新型佐剂的潜能。此外,在本研究中还意外发现了小鼠外周血中显着升高的CD8+T细胞和IFN-γ产生可能与十二指肠致死性坏死存在相关性。这一发现,如果能被进一步证明,可能有助于在临床上通过检测外周血CD8+T细胞和IFN-γ水平来提示患者发生十二指肠广泛坏死的风险和通过降低外周血CD8+T细胞和IFN-γ水平防止十二指肠广泛坏死的发生。
郭立强[4]（2019）在《Piezo2通道在早泄外周神经敏感化中的机制研究》文中进行了进一步梳理自从Schapiro等人在1943年首次提出早泄这一概念以来,早泄的具体定义就一直存在争论。早期的早泄的定义通常由各类专业学术组织或者个人整理,然而这些定义普遍存在缺陷,主要包括:非循证的、缺乏专业的操作标准、过分含糊、以及过分依赖于诊断者的主观判断。直到2013年ISSM召开专家会议,才完善了原发性早泄和继发性早泄的定义。早泄的病因复杂,阴茎感觉神经敏感化在早泄发生中的作用逐步受到关注。Xin等人通过对120例原发性早泄患者与对照进行阴茎震动阈值的测定,证实原发性早泄患者阴茎头及阴茎体对震动刺激的阈值明显降低。与Xin等人的研究相反,Salonia等发现早泄患者存在阴茎去敏感化,而非阴茎敏感化。我们认为,造成这种不一致的原因是大多数研究早于新的ISSM关于早泄的定义,因此,“正常”和“早泄”的定义在不同的研究之间存在差异,缺乏统一的标准。此外,相对较小的样本量也导致了研究结论之间可能存在的矛盾。因此,我们应用ISSM最新的早泄定义筛选病人,并使用阴茎生物震动感觉阈值检查仪重新评估阴茎神经敏感化和原发性早泄之间的关系。为深入研究原发性早泄的发病机制及病理过程,我们采用基于射精连续统一理论方式建立早泄大鼠模型,并为进一步研究早泄外周神经敏感化的机制奠定基础。Piezo通道是2010年由Coste等首先发现并证实具有完全独立的机械刺激敏感性,这一发现被认为在神经生物学领域具有里程碑式的意义。虽然Piezo2通道在正常触觉感受中的作用已被肯定,但该通道在阴茎机械感受中的生理作用,特别是在早泄外周感觉神经敏感化中的作用尚无研究。本研究中,我们的通过自然筛选方式建立早泄大鼠模型,逐步明确阴茎神经末梢及支配阴茎的背根神经节（DRG）神经元上是否有Piezo2表达。然后进一步探索阴茎DRG神经元上Piezo2通道表达及功能变化在阴茎机械刺激敏感化（外周敏感化）中的作用。第一部分:阴茎神经敏感化在早泄中的作用目的:评估阴茎神经敏感化和原发性早泄之间的关系。方法:1.连续纳入我院泌尿外科就诊的以“射精过快”为主诉的患者共420例,排除不符合纳入标准及可能存在受试者偏倚的,213例原发性早泄患者被纳入研究。2.要求患者在四周时间内至少有四次性交,根据患者报告,记录阴道内射精潜伏期（秒表法）。根据IELT将所有原发性早泄患者分为轻度早泄组:IELT≥30s且≤60s,共152人;重度早泄组:IELT<30s,共61人,剩余的124例患者由于不符合早泄的诊断标准而被作为对照组。3.阴茎皮肤感觉阈值通过阴茎生物震动感觉阈值检查仪综合评估并记录。结果:1.阴茎感觉阈值与IELT之间的相关性分析:（1）在对照组中,阴茎感觉阈值与IELT之间未发现具有统计学意义的相关性（阴茎头:rs=0.127,P=0.161;阴茎体:rs=0.156,P=0.084）。在早泄组中阴茎感觉阈值与IELT之间具有明显正相关性（阴茎头:rs=0.349,P=0.0001;阴茎体:rs=0.341,P=0.0001）。（2）在轻度早泄组中,阴茎感觉阈值与IELT之间具有明显正相关性（阴茎头:rs=0.315,P=0.0001;阴茎体:rs=0.27,P=0.001）。（3）在重度早泄组中,阴茎感觉阈值与IELT之间也具有明显正相关性（阴茎头:rs=0.389,P=0.002;阴茎体:rs=0.354,P=0.005）。3.阴茎感觉阈值作为判断早泄严重程度的敏感性和特异性的ROC曲线:（1）早泄的龟头阈值的截断值为 4.25V（AUC:0.852,95%CI:0.813-0.892）,该值对于区分早泄的状态具有73.4%的灵敏度和83.6%的特异度。（2）早泄的阴茎体阈值4.15V作为预测早泄严重程度的截断值水平。该值的AUC为 0.893（95%CI:0.895-0.927）,灵敏度为 77.4%,特异性为 86.996。结论:原发性早泄患者阴茎外周神经存在敏感化,阴茎感觉敏感化可能是导致原发性早泄患者IELT较短的主要因素。此外,阴茎感觉阈值是预测早泄严重程度的有效指标。第二部分原发性早泄大鼠模型的建立目的:基于射精连续统一理论,评价自然筛选建立原发性早泄大鼠模型的可行性。方法:1.选取雄性Wistar大鼠170只,雌性Wistar大鼠85只,首先对雌鼠进行手术去势,然后在实验前48h注射苯甲酸雌二醇20μg（溶解于0.1ml的芝麻油）,在实验前4h皮下注射黄体酮500μg（溶解于0.1ml的芝麻油）来诱导雌鼠发情。2.筛选实验时间为19:00-21:00,将雄性大鼠和预先激素诱导处理完毕雌性大鼠1:1合笼,交配实验连续进行6次,每周1次,由于雄性大鼠交配逐步趋于稳定,故记录后3次大鼠的交配过程。3.记录骑跨潜伏期、射精潜伏期、插入潜伏期、射精次数和骑跨次数等指标。4.根据EF均值将雄鼠分为三组,其中EF均值≤1划分为“射精延迟”组,1<EF均值≤2.5划为“射精正常”组,EF均值>2.5划为“射精过快”组结果:最终成功记录了 134只雄性大鼠的后3次交配过程,其中“射精正常”组雄性大鼠104只,平均射精次数为2.07±0.74;“射精延迟”组雄性大鼠14只,平均射精次数0.63±0.42;“射精过快”组雄性大鼠16只,平均射精次数4.04±0.56。“射精过快”组雄性大鼠的EL值较“射精正常”及“射精延迟”组大鼠明显缩短,“射精过快”组雄性大鼠的MF值较“射精正常”及“射精延迟”组大鼠显着减少,差异均存在统计学意义（P<0.01）。结论:根据EF值可有效地筛选出“射精过快”的雄性大鼠,该动物模型的成功建立对深入研究原发性早泄具有重要意义。第三部分阴茎DRG神经元机械感受Piezo2通道参与早泄发生的实验研究目的:应用分子生物学、电生理学及行为学等方法,研究Piezo2通道在早泄大鼠阴茎DRG神经元的表达及功能变化。方法:1.背根神经节（DRG）的标记及分离:将Dil（1,1’-双十八烷基--3,3,3’-四甲基-吲哚-羰花青-高氯酸盐）染料注射到阴茎龟头逆行标记背根神经节神经元,10-14天后麻醉大鼠,手术分离双侧L6-S1 DRGs,显微镜下取出。2.免疫组化分别观察阴茎神经末梢及阴茎DRG上Piezo2表达情况。3.免疫组化及RT-PCR定量检测比较Piezo2通道在早泄大鼠和正常大鼠阴茎L6-S1 DRGs的差异表达。4.钙成像技术:首先在荧光显微镜找到DiI标记的DRG神经元,然后将玻璃微电极呈45度角接近细胞,并给与4um位移的机械刺激,刺激的同时记录神经元胞内钙离子信号的变化。5.膜片钳技术:以MP-285微操将刺激电极呈45度角接近细胞,并给予4um位移的机械刺激步进,记录电极记录膜内向电流变化。6.FM1-43对机械电流的阻断作用:在给予细胞第一次机械刺激后,应用Piezo2通道的特异性阻断剂FM1-43（10 uM）5分钟,然后再给予第二次机械刺激,并分别记录膜内向电流变化。7.Piezo2的反义寡核苷酸干扰:将预先筛选的正常大鼠分成对照组,错义寡核苷酸组,反义寡核苷酸组三组,先用DiI染料标记,然后进行手术鞘内置管,并应用微量注射器注射寡核苷酸。8.寡核苷酸干扰后的免疫组化和PCR检测:将寡核苷酸干扰大鼠按照前述的方案进行Piezo 2免疫组化及PCR检测及定量分析,证实寡核苷酸干扰的有效性。9.寡核苷酸干扰后的膜片钳研究:经寡核苷酸干扰的大鼠,按照前述的方案进行膜片钳检测,记录机械刺激诱发的电流变化。10.反义寡核苷酸干扰后的早泄大鼠行为学观察:对预先筛选的射精过快大鼠进行寡核苷酸干扰,观察反义寡核苷酸干扰后大鼠性行为学指标的变化。结果:1.免疫组化显示:Piezo2通道在大鼠龟头神经末梢及L6-S1 DRG均有丰富表达。2.免疫组化及RT-PCR定量分析显示:Piezo2通道在早泄大鼠DRG中的表达较正常大鼠明显升高,差异有统计学意义（P<0.01）。3.相同机械刺激下早泄大鼠胞内钙升高幅度（2.62±0.61）明显大于正常大鼠（1.84±0.53）,且差异有统计学意义（P=0.004）。4.机械刺激可诱发一种快速激活且快速失活的内向电流,该电流可被Piezo2通道的特异性阻断剂FM1-43阻断（P<0.01）。早泄大鼠机械刺激诱发内向电流密度为15.12±5.03pA/pF明显高于正常大鼠机械刺激诱发内向电流密度9.78±3.52A/pF,差异存在统计学意义（P<0.01）。5.早泄大鼠DRG神经元电流的激活时间为915±150ms,电流失活至80%的时间为670±200ms;正常大鼠DRG神经元分别为680±110ms,和510±150ms,两组大鼠机械诱导的电流的激活和失活特性无明显差异（P>0.05）。6.免疫组化和PCR定量检测分析显示:Piezo2通道在反义寡核苷酸组大鼠阴茎DRG中表达较错义寡核苷酸组和对照组明显下调,差异有统计学意义（P<0.01）。7.膜片钳显示机械刺激诱发的内向电流密度在反义寡核苷酸组为3.77±1.40A/pF,在对照组和错义寡核苷酸组分别为:9.81±4.12pA/pF和9.08±4.94pA/pF,三组有显着性差异（P<0.01）。但三组大鼠机械诱导的电流的激活和失活特性无明显差异（P>0.05）。8.反义寡核苷酸干扰的早泄大鼠和错义寡核苷酸组早泄组大鼠相比,反义组射精潜伏期值（EL）明显延长,骑跨次数（MF）明显增加,射精次数明显减少,差异均有统计学意义（P均<0.01）。结论:Piezo2通道在大鼠龟头神经末梢及L6-S1的DRG上丰富表达,早泄大鼠DRG上Piezo2通道表达上调,机械刺激诱导的电流密度增强,且此通道电流可被Piezo2特异性阻断剂FM1-43阻断,同时,经Piezo2反义寡核苷酸干扰的大鼠机械电流密度明显降低,反义寡核苷酸干扰后早泄大鼠性行为指标明显改善,证实Piezo2通道在大鼠阴茎外周神经敏感化中起重要作用。
孙翔玉[5]（2019）在《基于功能性适配体修饰的磁性纳米粒子载药体系构建及抗肿瘤活性研究》文中研究指明近年来,人类健康依然受到癌症的极大威胁,恶性肿瘤的发病率居高不下,并趋向年轻化。由于癌细胞增殖迅速且容易在体内扩散,早期的准确诊断和有效治疗,有助于提高癌症病人的存活率并减少病人的痛苦。手术、化疗和放疗等许多治疗手段被广泛用于临床癌症治疗。然而,早期未转移的实体瘤通常用手术治疗进行切除,但是已转移的肿瘤和非实体瘤不适用。同样的,化疗药的全身毒性、耐药性和低选择性常常导致治疗的结果差强人意。要解决这些问题,就迫切需要制定新的治疗方案来提高治愈率和减少癌症治疗过程中带来的副作用和耐药情况。近年的研究表明,核酸适配体可以成功运载小分子并对肿瘤细胞表面的过表达蛋白有特异性识别和结合功能,可作为靶标用于药物运递送。同时,超顺磁性纳米粒子尺寸很小,表面易于修饰,因此可以发挥包括药物递送,治疗和成像在内的多种功能,在多功能磁共振成像,靶向药物递送,磁热疗中被广泛使用。本论文以表面修饰的超顺磁纳米粒子为载体,利用适配体在其表面进行功能化修饰,再固载化疗药物道诺霉素（DNM）和光敏剂四甲基吡啶卟啉（TMPyP）,成功构建了具有磁/适体双重靶向功能的、化学疗法与光动力疗法协同作用的药物递送体系,并在体外和细胞学水平上评估该复合物的稳定性、靶向性、敏感型递送效率、光敏性、迁移抑制和细胞毒性等,具体研究内容如下:首先利用COOH@SPION和氨基化的Apt-S8/Apt-gc34核酸适配体构建出一种新型靶向递送系统,详细步骤如下:（一）构建DNM&TMPyP&Apt-S8/Apt-gc34@SPION递送系统并进行体外抗肿瘤活性检测利用EDC/NHS反应将COOH@SPION与氨基化的Apt-S8/Apt-gc34结合,利用AS1411适配体的G-四链体结构和尾端富GC结构的发夹型结构将药物TMPyP和DNM分别负载到适配体修饰的磁性纳米粒子上。研究结果表明,载药体系极易被肿瘤细胞摄取,其中的DNM的在肿瘤细胞内部存在pH依赖性释放;核仁素适配体（AS1411）封闭实验证明载药体系通过适配体AS1411与穿梭蛋白核仁素特异性结合内化进入肿瘤细胞;避光实验结果证实TMPyP光照后产生的ROS起到了抑制肿瘤增殖作用,进一步细胞凋亡和蛋白免疫印迹实验表明,在光照条件下诱导了细胞凋亡,凋亡过程中的相关蛋白bcl-2和c-myc的表达均下调。（二）构建DNM&TMPyP&Apt-PSA&PEI@SPION递送系统并进行体外抗肿瘤活性检测在上述研究的基础上,将适配体AS1411与p-gp siRNA通过GC G碱基互补自组装成DNA-RNA杂交链)（Apt-PSA）。利用PEI修饰的SPION带正电荷的特点,将上述杂交链Apt-PSA通过静电力作用复合到SPION表面,进一步构建了DNM&TMPyP&Apt-PSA&PEI@SPION新型靶向递送系统。随后的RT-PCR实验与蛋白免疫印迹实验表明,MCF-7/ADR细胞中耐药蛋白p-gp表达量明显降低,证明p-gp siRNA对MDR1基因的有效沉默。（三）构建DNM&TMPyP&PND&Bio-gc34&PSA&PEI@SPION递送系统并进行体外抗肿瘤活性检测将生物素修饰的单链寡核苷酸gc34（Bio-gc34）、p-gp siRNA分别与PEI修饰的SPION通过静电力作用复合到SPION表面。将具有增敏作用的PND、DNM、TMPyP负载到退火后的Bio-gc34上,进一步构建了DNM&TMPyP&PND&Bio-gc34&PSA&PEI@SPION新型靶向递送系统。通过细胞毒性实验可以证实与单纯的DNM药物相比,DNM&TMPyP&PND&Bio-gc34&PSA&PEI@SPION对MCF-7/A DR的IC50存在显着性差异。RT-PCR实验与蛋白免疫印迹实验结果表明,体系作用后,MCF-7/ADR细胞中耐药蛋白p-gp表达量明显降低,证明p-gp siRNA能够有效沉默MDR1基因。本实验结果验证了DNM&TMPyP&PND&Bio-gc34&PSA&PEI@SPION系统多疗法协同作用,减少了化疗药DNM的用量;PND能够竞争性的与p-gp蛋白结合,减少了DNM被转运出细胞的概率,保证DNM在细胞内的有效浓度;同时联合p-gp siRNA下调了MDR1基因表达,达到三重抑制p-gp蛋白的作用,为耐药乳腺癌的治疗研究提供了一种新思路和新方法。
王潇晗[6]（2018）在《细辛马兜铃酸合成途径关键酶基因的挖掘及功能鉴定》文中研究说明细辛能外散风寒、内祛阴寒,具有止痛、镇咳的功效,是治疗风寒,头痛及咳嗽类病症的要药。细辛为马兜铃科植物,含有马兜铃酸。目前,多种含马兜铃酸的中草药品种处于禁用或限制使用当中。中药的传统使用方法炮制、蒸煮、合理配伍都对马兜铃酸的去除有一定的效果,但难以从根本上解决马兜铃酸的毒性问题。生物技术手段的不断进步为中药减毒展开了新天地,利用现代生物技术了解掌握马兜铃酸在植物体内的合成途径,并从遗传学角度在基因水平上去除或减少细辛中的马兜铃酸,既有必要性,也有可能性。本研究进行了针对上述问题的工作。本研究首次通过无参高通量测序,取得了北细辛转录组信息。并对转录组测序结果进行了综合分析,在KEGG Pathway 350中找到了马兜铃酸合成途径中离马兜铃酸最近的代谢产物千金藤碱,综合KEGG Pathway 950的上下调基因后,确定酪氨酸脱羧酶（TyrDCs）家族基因作为关键酶基因,进一步开展马兜铃酸合成途径的研究;本研究成功克隆出TyrDC1,TyrDC2,TyrDC3基因,测序结果在BLAST上进行比对分析,确定为完整的CDS序列;TyrDC1和TyrDC3在进行碱基序列对比时均能对比到同源性大于90%的其他物种基因,但TyrDC2没有对比到同源性较高的基因,同源性与芳香族-L-氨基酸脱羧酶预测蛋白相似度为60%左右,经过系统发育树和碱基序列对比后,TyrDC2为未在其他植物和本植物中报道过的TyrDC。预测了TyrDCs的亚细胞定位位置,确定了其蛋白为功能性蛋白。对TyrDCs进行二级与三级结构预测,TyrDC1和TyrDC3为非稳定蛋白,TyrDC2为稳定蛋白;本研究成功构建PRI101-TyrDC1,-TyrDC2,-TyrDC3的植物过表达载体,建立北细辛愈伤组织的遗传转化体系。将构建成功的重组质粒转化到北细辛的遗传转化体系中,对该体系进行评价,确定该体系较为稳定,转化效率高,可为下游的分子实验奠定基础。对转基因北细辛和对照组进行了HPLC分析测定,结果为转基因的细辛愈伤组织AAI的含量比对照组高（P<0.05）,证明了TyrDCs家族基因均能促进AAI的生物合成;本研究成功构建pEASY-Blunt E1-TyrDC1,-TyrDC2,-TyrDC3的原核表达载体,可表达可溶性蛋白。Western blot实验验证了表达出的蛋白为TyrDC。对表达出的蛋白进行体外验证实验证实:TyrDC1,TyrDC2,TyrDC3对细辛叶片研磨液中马兜铃酸A（AAI）含量有提高作用,与对照组中的AAI对比差异为显着（P<0.05）;混合TyrDCs提高效率最大,TyrDC2效果相较于其他2种要高,但差异不显着;本研究构建pTRV-2-TyrDC1,-TyrDC2,-TyrDC3的沉默表达载体,对细辛叶片进行注射侵染,叶片颜色变浅皱缩,叶脉突出。对所侵染的植株进行qRT-PCR检测,TyrDC1,TyrDC2,TyrDC3的相对表达量降低;对所侵染的植株进行HPLC检测,AAI含量相对降低,与qRT-PCR检测TyrDCs相对表达量降低相吻合。3种TyrDC中,TyrDC2对AAI的影响最大,且在其他植物中未见报道,我们推断TyrDC2可能在马兜玲酸生物合成中可能起到了更为关键的作用。
张亚冉[7]（2017）在《SIRT2基因对牛前体脂肪细胞分化的作用及其转录调控机制研究》文中进行了进一步梳理Sirtuins家族是调控动物生长发育、衰老及新陈代谢等多方面功能的一组烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+）依赖的蛋白去乙酰化酶,是当今长寿与衰老、癌症及代谢紊乱疾病等相关领域的研究热点。哺乳动物Sirtuins家族包括7个成员,命名为SIRT1-SIRT7;它们有不同的亚细胞定位和功能。其中Sirtuin 2（SIRT2）主要位于胞浆,其通过作用于下游不同的靶蛋白底物在多个生理过程中发挥作用,包括脂肪细胞分化、脂肪酸氧化、胰岛素抵抗和葡萄糖异生等。但目前关于牛SIRT2基因对前体脂肪细胞分化的作用及其转录调控机制仍不清楚。本研究旨在利用腺病毒介导的过表达和干扰技术,从细胞和分子水平研究牛SIRT2基因对前体脂肪细胞分化的作用。通过利用生物信息学方法及双荧光素酶报告载体系统,分析牛SIRT2基因的启动子特征和活性,寻找牛SIRT2基因的核心启动子区域。在此基础上借助于定点突变、电泳迁移率变动分析（electrophoretic mobility shift assay,EMSA）和染色质免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation,ChIP）技术,研究SIRT2基因的转录调控机制。主要研究成果如下:（1）克隆获得秦川牛SIRT2基因1173 bp的CDS区,共编码390个氨基酸。构建了牛SIRT2基因的腺病毒过表达载体,经过在HEK 293 A细胞系中包装和扩繁后得到高滴度腺病毒Ad-SIRT2。（2）利用HEK 293 A细胞系,筛选得到一条靶向干扰牛SIRT2基因的干扰效率为的74.7%的shRNA,命名为shRNA-1002。将其与腺病毒骨架载体重组后,在HEK 293A细胞系中包装和扩繁,获得高滴度重组腺病毒Ad-shRNA-1002。（3）利用酶消化法培养获得牛原代前体脂肪细胞。Real-time PCR检测病毒的有效性,结果表明,在牛前体脂肪细胞中Ad-SIRT2处理组比Ad-CMV-NC对照组的SIRT2mRNA表达量提高了316.3倍（P<0.01）,而Ad-shRNA-1002处理组比Ad-shRNA-NC对照组的SIRT2 mRNA表达量降低了68.3%（P<0.01）,表明Ad-SIRT2和Ad-shRNA-1002可分别成功介导牛SIRT2基因的过量表达和沉默。（4）油红O染色结果显示,在牛前体脂肪细胞中过量表达SIRT2基因,抑制细胞中脂滴的积累及前体脂肪细胞的分化。相反,干扰SIRT2基因,促进脂肪细胞中脂滴的累积及前体脂肪细胞的分化。（5）牛前体脂肪细胞诱导分化4 d时,real-time PCR检测过表达和干扰SIRT2基因后调控脂肪细胞分化的关键转录因子及脂滴代谢关键基因的表达情况。结果显示,过量表达SIRT2基因后,转录因子C/EBPα（CCAAT/enhancer-binding proteinα）和PPARγ（peroxisome proliferator-activated receptorγ）mRNA的表达量显着降低（P<0.05）。另外,PPARγ通路下游的脂滴代谢关键基因FABP4（fatty acid binding protein 4）、FAS（fatty acid synthase）和LPL（lipoprotein lipase）的表达量也显着下调（P<0.05）。反之,干扰SIRT2基因后,C/EBPα和PPARγmRNA的表达量显着上调,同样PPARγ通路下游的脂滴代谢关键基因FABP4、FAS和LPL的表达量也显着上调（P<0.05）。但是,不论过表达还是干扰SIRT2对转录因子C/EBPβ、C/EBPδ和SREBP1（sterol regulatory element binding protein 1）的表达无显着影响（P>0.05）。（6）利用5’末端cDNA快速扩增法,发现牛SIRT2基因存在多个转录起始位点,将位于翻译起始位点（ATG）上游85 bp处的鸟嘌呤残基“G”指定为“+1”,与GenBank提供的SIRT2 mRNA参考序列（NM001113531.1）的5’末端位点一致。（7）克隆获得牛SIRT2基因2017 bp（-1956/+61）的5’侧翼序列。5’末端逐段缺失片段的荧光素酶活性分析结果表明牛,牛SIRT2基因的核心启动子区位于-178/+4。生物信息学预测发现,核心启动子区-178/+4存在E2F1、SP1、YY1和XBP1等转录因子结合位点。但没有发现典型的真核启动子元件TATA box和CAAT box,即SIRT2启动子为无TATA box的启动子。（8）通过定点突变转录因子YY1结合位点,发现牛SIRT2基因启动子活性下降约60%（P<0.01）。进一步利用EMSA和ChIP技术分别在体外和体内证实YY1转录因子能够与牛SIRT2基因核心启动子区结合。以上研究结果表明,YY1促进牛SIRT2基因的转录。综上所述,牛SIRT2基因抑制前体脂肪细胞的分化。YY1通过结合于SIRT2核心启动子区正向调控牛SIRT2基因的转录活性。同时,根据之前报道以及本研究结果,绘制了一张YY1、SIRT2通路和PPARγ之间的调控网络草图。总之,本研究结果为解析牛SIRT2基因在牛脂肪细胞分化中的作用提供了科学依据,并在此基础上揭示了SIRT2的启动子特征和转录调控机制,拓宽了脂肪细胞分化相关基因的调控网络。研究结果不仅为深入研究及理解动物脂肪形成和沉积的复杂分子机理提供了理论依据,也为选育高品质肉牛良种奠定了一定的理论基础。
付赛赛[8]（2017）在《黄芩苷增敏环丙沙星的关键外排基因筛选》文中提出在畜牧业中,大肠杆菌是一种常见的且发病率较高的病原菌之一,它也可以引起畜禽及人的泌尿系统、呼吸系统等的感染。随着近年来抗生素的滥用,大肠杆菌对常用抗菌药物的耐药性已经达到了一个十分严重的趋势,主动外排系统是其主要耐药机制之一。外排泵抑制剂能够恢复常见抗生素的抗菌活性,使菌株对其耐药率降低。前期研究表明,黄芩苷能够增敏环丙沙星,是一种潜在的外排泵抑制剂。本试验目的在于研究黄芩苷增敏环丙沙星的主要外排基因,为挖掘老药潜力,克服单药耐药性,为环丙沙星更好应用于兽医临床奠定基础。为探讨黄芩苷与环丙沙星联用后的效应,本试验采用微量肉汤稀释法,测定了295株动物源大肠杆菌对四种喹诺酮类药物的耐药性,结果发现,分离菌株对四种药物的耐药率介于61.7%72.2%之间,对环丙沙星耐药率最高,其中环丙沙星MIC≥64μg/mL的菌株8株。进一步测定了黄芩苷单药对以上8株耐药菌株的MIC值,结果2株黄芩苷MIC为512μg/mL,6株MIC为1024μg/mL;棋盘法测定了环丙沙星和黄芩苷联合的FIC,结果8株菌株FIC等于0.375,均为协同效应。使用16、32、64、128、256μg/mL黄芩苷进一步和环丙沙星联合,结果发现32μg/mL黄芩苷能够显着降低环丙沙星对耐药菌株的MIC,因此确定了黄芩苷与环丙沙星联用时最适宜的浓度为32μg/mL。为进一步测定探究黄芩苷对耐药大肠杆菌主动外排调控基因的mRNA表达水平的影响,对上述8株耐药菌株采取以下5种方式处理进行培养（1）不加任何药物（2）单独加32μg/mL黄芩苷（3）单独加4μg/mL环丙沙星（4）32μg/mL黄芩苷和4μg/mL环丙沙星联合（5）16μg/mL CCCP和4μg/mL环丙沙星联合,抽提总RNA并反转录cDNA,荧光定量PCR,测定主动外排调控基因及管家基因gapA的Ct值,并计算不同培养条件下各个耐药大肠杆菌基因acrA、acrD、marA、acrE、acrF、acrB、mdtA、robA、soxS的mRNA相对表达量的差异。结果表明,黄芩苷和环丙沙星联用与单独加入环丙沙星相比,acrE、acrB、acrF、mdtA、robA、soxS基因表达量变化不明显;acrA、acrD、marA基因表达量有明显的下降趋势,提示这3个基因是黄芩苷的作用靶点。为探讨反义寡核苷酸沉默acrA、marA、acrD基因前后,黄芩苷对临床耐药大肠杆菌环丙沙星敏感性的影响,设计以上3个基因的反义寡核苷酸引物,设置空白对照组、黄芩苷组、反义寡核苷酸沉默组、反义寡核苷酸沉默+黄芩苷组进行实验,分别转染到临床耐药菌感受态细胞中,涂布于一定浓度环丙沙星平板上,培养观察菌落生长情况并计数。结果发现,acrA、marA上述两个基因被沉默后,加入黄芩苷对环丙沙星的敏感性影响不明显;acrD基因被沉默后,加入黄芩苷对环丙沙星的敏感性有下降趋势。以上结果表明acrA、marA在黄芩苷的抗菌增敏作用中发挥着主要的作用,acrD发挥着次要的作用。
李睿,郭青玉,肖刚,邓晓红[9]（2013）在《生物膜变形链球菌对反义寡核苷酸的摄取率检测》文中指出目的:探讨阳离子聚合物So-fast提高生物膜中变形链球菌对反义寡核苷酸摄取率的效果。方法:制备变形链球国际标准株GS5生物膜,在无载体和用阳离子聚合物作载体So-fastTM情况下用变形链球菌gtfB基因的反义脱氧寡核苷酸PS-ODN转化生物膜中变形链球菌,采用流式细胞仪检测生物膜中变形链球菌细菌对PS-ODN的摄取效率。结果:生物膜中的变形链球菌对裸反义寡核苷酸的摄取效率为16%,采用So-fastTM作为转化载体,摄取效率为71.7%。结论:阳离子聚合物可促进反义寡核苷酸通过变形链球菌细胞膜,使其摄取效率明显提高。
杨璐[10]（2012）在《2’-0-甲氧乙基反义寡核苷酸在杜兴肌肉萎缩症上的应用研究》文中认为目的：杜兴肌肉萎缩症是一种由dystrophin基因突变,导致dystrophin蛋白缺失所引发的致死性神经肌肉失调症,本研究利用杜兴肌肉萎缩症疾病细胞和动物模型来测试一种新的反义寡核苷酸化学结构-2’-O-甲氧乙基（2’-O-MOE）,通过对该反义寡核苷酸化学结构的体外、体内局部和系统的测试,其中包括系统给药剂量和给药途径的优化,预期为杜兴肌肉萎缩症反义寡核苷酸介导的外显子跳读的基因治疗方法提供一种候选的反义寡核苷酸药物。与此同时,通过对荧光标记的2’-O-MOE反义寡核苷酸药物体外和体内试验,来测试该反义寡核苷酸药物在肌肉细胞内的定位和摄取效率及在实验动物各组织内的分布情况。方法：1.浓度效应试验中将300nM、500nM、1μM不同长度和骨架修饰的2’-O-MOE包括MOE20（PS）.MOE25（PS）和MOE25（PO）反义寡核苷酸药物通过脂质体转染H?K mdx细胞48h后,利用RT-PCR技术检测其诱导外显子23跳读的效率。2.时间效应试验中将500nM不同长度和骨架修饰的2’-O-MOE反义寡核苷酸药物通过脂质体转染H2K mdx细胞24h、48h、72h、96h后,利用RT-PCR技术检测其诱导外显子23跳读的效率。3.细胞毒性试验中,应用WST试剂盒分别检测高于试验测试浓度5倍和10倍的MOE25（PS）、MOE25（PO）和MOE20（PS）对细胞增殖能力和生存率的影响。4.不同反义寡核苷酸化学结构比较试验中,将500nM MOE25（PS）、 MOE25（PO）.MOE20（PS）和2’OmePS通过脂质体转染H2K mdx细胞48h后,利用RT-PCR技术检测不同反义寡核苷酸药物诱导外显子23跳读效率的差异。5.在mdx小鼠局部肌肉试验中.将5μg的MOE25（PS）、MOE25（PO）、MOE20（PS）和2’OmePS分别注射到成年mdx小鼠的胫前肌（tibialis anterior-TA）。注射两周后,收集肌肉组织样品。利用免疫组化、RT-PCR和Western Blot测试各反义寡核苷酸药物诱导外显子23跳读效率和dystrophin蛋白的分布及表达水平。6.将局部肌肉测试效果较好的2’-O-MOE反义寡核苷酸通过尾静脉、腹腔和皮下注射等不同给药途径及不同的剂量进行系统测试,注射2周后,收取全身肌肉组织包括胸膈肌和心肌,利用免疫组化、RT-PCR和Western blot方法系统检测该反义寡核苷酸诱导外显子跳读和dystrophin蛋白表达的效率。7.在动物体内组织分布试验中,将100mg/kg荧光标记的MOE25（PS）通过尾静脉隔天注射成年mdx小鼠,连续给药5次,检测该MOE25（PS）在mdx小鼠各肌肉组织中的分布情况。8.在细胞摄取试验中,将荧光标记的MOE25（PS）通过脂质体转染H2K mdx细胞后,通过荧光显微镜检测不同时间点细胞对荧光标记MOE25（PS）的摄取情况,并利用流式细胞仪定量分析H2K mdx细胞对其摄取情况。9.在细胞内定位试验中,将荧光标记的MOE25（PS）通过脂质体转染H2K mdx细胞4h后,通过激光扫描共聚焦荧光显微镜检测MOE（PS）在H2K mdx细胞中的定位情况,包括与细胞核和溶酶体等细胞器的共定位情况。结果：1.在浓度效应试验中,结果表明：随着浓度的升高,3种不同2’-O-MOE反义寡核苷酸药物诱导H2K mdx细胞外显子跳读的效率也随之增加,表现出浓度依赖性效应。其中以MOE25（PS）诱导外显子23跳读效果最佳,在500nM时,已达到90%以上外显子跳读效率。2.细胞毒性分析试验结果显示MOE25（PS）和MOE20（PS）在10μM的浓度下对细胞的增殖和生存率无影响,而MOE25（PO）在该浓度表现出对细胞轻微的毒害作用。3.在时间效应试验中,RT-PCR结果显示：MOE25（PO）和MOE25（PS）诱导H2Kmdx细胞外显子23跳读效率最高的时间点都为转染后48h。4.不同反义寡核苷酸化学结构比较试验中,在500nM浓度时,：RT-PCR结果显示：MOE25（PS）诱导外显子23跳读的效率显着高于2’OmePS和MOE20（PS）,略高于MOE25（PO）,表明MOE25（PS）是一种比2’OmePS更有效的反义寡核苷酸药物。5.在mdx小鼠的局部肌肉注射试验中,结果表明：四种测试反义寡核苷酸都能够有效地诱导dystrophin蛋白在mdx小鼠胫前肌中的表达,其中尤为突出的是MOE25（PS）,能够有效诱导dystrophin蛋白在整个肌肉组织切片上均匀分布和表达,且Western blot结果显示在MOE25（PS）处理的胫前肌中dystrophin蛋白的表达量接近于正常组织中的30%,与其他三种反义寡核苷酸相比具有显着差异。6.在动物系统试验中,通过不同剂量和不同给药途径（包括尾静脉、腹腔和皮下注射）来系统评估MOE25（PS）反义寡核苷酸系统介导外显子跳读的效率。RT-PCR和免疫组织化学试验结果显示MOE25（PS）未能有效诱导系统外显子23跳读和恢复dystrophin蛋白表达。7.动物体内组织分布情况试验结果显示：荧光标记的MOE25（PS）通过尾静脉注射后,大部分进入肾、肝等非肌肉组织,只有极少量进入到各肌肉组织中8.在体外细胞摄取试验中,通过检测不同时间点H2K mdx细胞对MOE25（PS）的摄取情况,结果发现在转染后4h,细胞对MOE25（PS）的摄取效率最高：进一步的细胞流式定量分析结果显示：在转染后4h, H2K mdx细胞对MOE25（PS）的摄取率约为90%。9.激光扫描共聚焦结果显示荧光标记的MOE25（PS）大部分分布于H2K mdx细胞的细胞质内,与溶酶体共定位,只有很少一部分迷入细胞核。结论：1.2’-O-MOE反义寡核苷酸能够在H2K mdx细胞中有效地诱导细胞内外显子23跳读,表现出浓度依赖性和时间效应：在高浓度下,未表现出对细胞明显的毒害作用。2.2’-O-MOE反义寡核苷酸能够有效地诱导mdx小鼠局部肌肉中外显子23跳读和恢复dystrophin蛋白的表达,但其诱导dystrophin蛋白系统表达效果有限。3.动物体内组织分布试验结果表明MOE25（PS）反义寡核苷酸缺乏肌肉靶向性,系统注射的MOE25（PS）绝大部分进入肾脏组织.而进入肌肉组织的能力有限。4.细胞摄取和定位试验结果显示：在转染试剂的作用下,MOE25（PS）反义寡核苷酸能够高效地进入细胞内,但大部分存在于细胞质和溶酶体中,而只有少量有效地进入细胞核。
二、反义寡核苷酸技术的进展及在医学中的应用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、反义寡核苷酸技术的进展及在医学中的应用（论文提纲范文）
（1）靶向LncRNA HOTAIR的反义显像初探（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 放射性核素标记的反义探针在肿瘤疾病中的应用研究 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 个人简介 |
| 开题、中期及学位论文答辩委员组成 |
（2）新型核酸纳米载体的设计及在肿瘤细胞成像和药物递送中的应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号与缩写 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 癌症的诊断与治疗 |
| 1.1.1 癌症的诊断 |
| 1.1.2 癌症的治疗 |
| 1.1.3 癌症的诊疗一体化 |
| 1.2 经典的核酸结构单元用于设计纳米载体 |
| 1.2.1 核酸适配体 |
| 1.2.2 脱氧核酶 |
| 1.2.3 分子信标 |
| 1.2.4 双链探针 |
| 1.3 金纳米颗粒 |
| 1.3.1 金纳米颗粒的理化性质 |
| 1.3.2 金纳米颗粒分布、代谢性质和毒理研究 |
| 1.3.3 金纳米颗粒在癌症诊疗中的应用研究 |
| 1.4 核酸纳米载体在癌症诊断和治疗中的研究进展 |
| 1.4.1 具有荧光特性的核酸纳米探针用于肿瘤细胞成像 |
| 1.4.2 核酸纳米载体在药物递送中的研究 |
| 1.4.3 基于核酸纳米载体的癌症诊疗一体化研究 |
| 1.5 本论文解决的科学问题及研究内容 |
| 参考文献 |
| 第二章 内源性刺激响应核靶向的纳米载体用于细胞内mRNA成像及药物递送 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 试剂和仪器 |
| 2.2.2 凝胶电泳实验 |
| 2.2.3 金纳米颗粒(AuNPs)的合成及AuNP-mRS-DSs的制备 |
| 2.2.4 金纳米颗粒表面mRS-DS的修饰量考察 |
| 2.2.5 特异性考察 |
| 2.2.6 杂交实验 |
| 2.2.7 细胞系及细胞培养 |
| 2.2.8 细胞内荧光成像实验 |
| 2.2.9 qRT-PCR对MRP1 mRNA进行分析 |
| 2.2.10 细胞摄取 |
| 2.2.11 阿霉素插入实验 |
| 2.2.12 细胞存活率考察 |
| 2.2.13 统计学分析 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 DNA序列设计的可行性验证 |
| 2.3.2 AuNP-mRS-DSs的表征 |
| 2.3.3 金纳米颗粒表面mRS-DS的修饰量及AuNP-mRS-DSs的特异性考察 |
| 2.3.4 AuNP-mRS-DSs的选择性考察 |
| 2.3.5 细胞内荧光成像 |
| 2.3.6 细胞摄取 |
| 2.3.7 纳米载体的载药量考察 |
| 2.3.8 细胞存活率考察 |
| 2.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第三章 多功能分子信标修饰的金纳米颗粒作为纳米载体用于活细胞内耐药相关mRNA的协同抑制及原位成像 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 试剂和仪器 |
| 3.2.2 凝胶电泳实验 |
| 3.2.3 金纳米颗粒(AuNPs)的合成及MBs-AuNP的制备 |
| 3.2.4 金纳米颗粒表面分子信标的修饰量考察 |
| 3.2.5 可行性与稳定性实验 |
| 3.2.6 细胞系及细胞培养 |
| 3.2.7 细胞内荧光成像 |
| 3.2.8 MDR1 mRNA、MRP1 mRNA和BCRP mRNA的相对表达水平分析 |
| 3.2.9 Western blotting实验 |
| 3.2.10 阿霉素插入实验 |
| 3.2.11 细胞毒性实验 |
| 3.2.12 统计学分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 DNA序列设计的可行性验证 |
| 3.3.2 MBs-AuNP的表征 |
| 3.3.3 金纳米颗粒表面分子信标的修饰量考察 |
| 3.3.4 可行性及稳定性考察 |
| 3.3.5 细胞内荧光成像 |
| 3.3.6 MBs-AuNP对细胞内耐药相关mRNA和蛋白水平的影响 |
| 3.3.7 纳米载体的载药量考察 |
| 3.3.8 细胞存活率实验 |
| 3.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第四章 端粒酶特异性的DNAzyme驱动的DNA walker作为纳米载体用于活细胞内端粒酶活性分析及药物递送 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 试剂和仪器 |
| 4.2.2 凝胶电泳实验 |
| 4.2.3 金纳米颗粒(AuNPs)的制备 |
| 4.2.4 tsDNA-AuNP的制备及其表面底物发卡修饰量的考察 |
| 4.2.5 细胞培养及HeLa细胞提取液的制备 |
| 4.2.6 HeLa细胞提取液中端粒酶活性检测 |
| 4.2.7 tsDNA-AuNP的稳定性考察 |
| 4.2.8 细胞内端粒酶活性的成像分析 |
| 4.2.9 TERT mRNA的相对表达水平分析 |
| 4.2.10 端粒酶抑制剂的筛选 |
| 4.2.11 阿霉素插入实验 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 DNA序列设计的可行性验证 |
| 4.3.2 tsDNA-AuNP的表征 |
| 4.3.3 tsDNA-AuNP的可行性和稳定性考察 |
| 4.3.4 行走链与底物发卡修饰比例的考察 |
| 4.3.5 tsDNA-AuNP检测性能的考察 |
| 4.3.6 细胞内端粒酶活性分析的条件优化 |
| 4.3.7 不同细胞内端粒酶活性分析 |
| 4.3.8 端粒酶抑制剂的筛选 |
| 4.3.9 纳米载体的载药量考察 |
| 4.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 致谢 |
| 博士期间发表论文 |
| 附录 |
| 附件 |
（3）LAG3干扰寡核苷酸作为重组蛋白疫苗和灭活流感病毒疫苗佐剂的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词表 |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 1 LAG3概述 |
| 1.1 LAG3的结构 |
| 1.2 LAG3的配体 |
| 1.2.1 MHCⅡ分子 |
| 1.2.2 Galectin-3 |
| 1.2.3 LSECtin |
| 1.2.4 FGL1 |
| 1.2.5 α-突触核蛋白 |
| 1.3 LAG3的表达 |
| 1.4 LAG3的表达调控 |
| 1.5 LAG3的信号转导通路 |
| 2 LAG3的免疫调节 |
| 2.1 LAG3对效应T细胞的调节 |
| 2.2 LAG3对Treg细胞的调节 |
| 2.3 LAG3对其他免疫细胞的调节 |
| 2.3.1 LAG3对pDC的调节 |
| 2.3.2 LAG3对NK细胞及NKT细胞的调节 |
| 3 靶向LAG3免疫治疗的应用 |
| 3.1 LAG3可溶性融合蛋白(IMP321)的应用 |
| 3.2 抗LAG3单克隆抗体的应用 |
| 4 佐剂的研究进展 |
| 4.1 矿物盐类佐剂 |
| 4.2 乳化剂 |
| 4.3 脂质体 |
| 4.4 模式识别受体激动剂 |
| 4.5 其它类型的佐剂 |
| 5 RNA靶向性寡核苷酸药物的研究进展 |
| 5.1 RNA靶向性寡核苷酸药物的分类及作用机制 |
| 5.1.1 ASO |
| 5.1.2 siRNA |
| 5.2 RNA靶向性寡核苷酸药物的化学修饰 |
| 5.3 RNA靶向性寡核苷酸药物的应用 |
| 6 肿瘤裂解物疫苗的研究进展 |
| 7 IFN-γ与疾病发生 |
| 7.1 IFN-γ的概述 |
| 7.2 IFN-γ与感染性休克 |
| 7.3 IFN-γ与乳糜泻 |
| 7.4 IFN-γ与过敏性肺炎 |
| 7.5 IFN-γ与造血功能障碍 |
| 7.6 IFN-γ与其它疾病 |
| 8 CD8~+T细胞与疾病发生 |
| 8.1 CD8~+T细胞概述 |
| 8.2 CD8~+T与多发性硬化 |
| 8.3 CD8~+T细胞与哮喘 |
| 8.4 CD8~+T细胞与动脉粥样硬化 |
| 8.5 CD8~+T细胞与肿瘤 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 LAG3干扰寡核苷酸对LAG3表达的影响 |
| 1 材料方法 |
| 1.1 实验动物和细胞 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 细胞 |
| 1.2 主要实验试剂及仪器 |
| 1.2.1 寡核苷酸 |
| 1.2.2 重组蛋白 |
| 1.2.3 其它试剂 |
| 1.2.4 实验仪器与耗材 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 人和小鼠LAG3 m RNA序列的比对及反义寡核苷酸靶向区域的确定 |
| 1.3.2 LAG3反义寡核苷酸的分析与筛选 |
| 1.3.3 LAG3反义寡核苷酸的合成 |
| 1.3.4 疫苗的配制 |
| 1.3.5 小鼠免疫 |
| 1.3.6 小鼠脾细胞及淋巴结细胞的分离 |
| 1.3.7 细胞的培养 |
| 1.3.8 流式细胞术 |
| 1.3.9 免疫荧光实验 |
| 1.3.10 RT-PCR |
| 1.3.11 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 LAG3干扰寡核苷酸的设计与筛选 |
| 2.1.1 LAG3干扰寡核苷酸靶向区域的筛选 |
| 2.1.2 候选反义寡核苷酸的评估 |
| 2.2 LIO进入免疫细胞的情况 |
| 2.2.1 淋巴结中各类型免疫细胞对LIO的摄取 |
| 2.2.2 脾中各类型免疫细胞对LIO的摄取 |
| 2.2.3 LIO在T细胞中的定位 |
| 2.3 LIO对LAG3表达的影响 |
| 2.3.1 LIO对脾细胞LAG3 m RNA表达的影响 |
| 2.3.2 LIO对引流淋巴结细胞中CD4~+T及CD8~+T细胞LAG3蛋白表达的影响 |
| 2.3.3 LIO对脾细胞中CD4~+T及CD8~+T细胞LAG3蛋白表达的影响 |
| 2.3.4 LIO对Jurkat细胞LAG3蛋白表达的影响 |
| 3 小结 |
| 第二章 LIO作为重组蛋白疫苗和灭活病毒疫苗佐剂的效果 |
| 1 材料方法 |
| 1.1 实验动物及细胞 |
| 1.2 主要实验试剂及仪器 |
| 1.2.1 重组蛋白及病毒 |
| 1.2.2 其他试剂 |
| 1.2.3 实验仪器与耗材 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 疫苗的配制 |
| 1.3.2 动物免疫 |
| 1.3.3 T细胞增殖实验 |
| 1.3.4 流式细胞术 |
| 1.3.5 实时定量PCR |
| 1.3.6 间接ELISA |
| 1.3.7 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 在recall反应中LIO对诱导抗原特异性效应T细胞反应的影响 |
| 2.1.1 LIO对T细胞增值影响的时间点摸索 |
| 2.1.2 LIO对recall反应中抗原特异性T细胞增值的影响 |
| 2.1.3 在recall反应中LIO对T细胞产生细胞因子能力的影响 |
| 2.2 LIO维持抗原特异性T细胞活化的效应 |
| 2.2.1 LIO对引流淋巴结细胞中T细胞CD69表达的影响 |
| 2.2.2 LIO对脾细胞中T细胞CD69表达的影响 |
| 2.2.3 LIO对引流淋巴结细胞中Th1和Th2型细胞因子产生的影响 |
| 2.2.4 LIO对脾细胞中Th1和Th2型细胞因子产生的影响 |
| 2.3 LIO-1 对T细胞反应影响的特异性 |
| 2.4 LIO对抗原非特异性T细胞增殖的影响 |
| 2.5 LIO对LAG3配体MHCⅡ的影响 |
| 2.5.1 LIO对引流淋巴结细胞中DC细胞MHCⅡ表达的影响 |
| 2.5.2 LIO对脾细胞中DC细胞MHCⅡ表达的影响 |
| 2.6 LIO作为重组蛋白疫苗及灭活病毒疫苗佐剂的效果 |
| 2.6.1 LIO-1 作为微生物疫苗佐剂的剂量摸索 |
| 2.6.2 LIO-2 对重组蛋白疫苗诱导的抗体反应的影响 |
| 2.6.3 LIO-1 作为重组蛋白疫苗佐剂的效果 |
| 2.6.4 LIO-1 作为灭活流感病毒疫苗佐剂的效果 |
| 3 小结 |
| 第三章 CD8~+T细胞和IFN-γ与小鼠十二指肠坏死的相关性观察 |
| 1 材料方法 |
| 1.1 实验动物及细胞 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 细胞 |
| 1.2 主要实验试剂及仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 Lewis肺癌细胞的接种 |
| 1.3.2 Lewis肺癌肿瘤裂解物的制备及疫苗配制 |
| 1.3.3 Lewis肺癌皮下移植瘤模型的建立 |
| 1.3.4 小鼠外周血白细胞的分离 |
| 1.3.5 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 Lewis肺癌肿瘤裂解物的制备 |
| 2.2 LIO-1 联合肿瘤裂解物疫苗治疗Lewis肺癌的效果 |
| 2.3 Lewis肺癌肿瘤裂解物疫苗对小鼠的脏器损伤 |
| 2.4 小鼠十二指肠坏死与外周血IFN-γ产生的相关性 |
| 2.5 小鼠十二指肠坏死与外周血T细胞的相关性 |
| 2.6 小鼠十二指肠坏死与脾及引流淋巴结中T细胞的相关性 |
| 3 小结 |
| 第三篇 讨论 |
| 第四篇 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（4）Piezo2通道在早泄外周神经敏感化中的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一部分 阴茎敏感化在早泄中的作用前言 |
| 研究对象和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 原发性早泄大鼠模型的建立前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 阴茎DRG神经元机械感受Piezo2通道参与早泄发生的实验研究前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 英文论文1 |
| 英文论文2 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（5）基于功能性适配体修饰的磁性纳米粒子载药体系构建及抗肿瘤活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 纳米材料在生物学及医学中的应用 |
| 1.1.1 肿瘤细胞微环境 |
| 1.1.2 纳米材料载体在医学中的应用 |
| 1.1.3 基于脂质的纳米颗粒 |
| 1.1.4 聚合物纳米载体 |
| 1.1.5 无机纳米粒子 |
| 1.1.6 磁性纳米粒子 |
| 1.2 功能性核酸在肿瘤治疗中的应用 |
| 1.3 小干扰RNA技术在医学中的应用 |
| 1.3.1 RNAi和癌症即RNAi的沉默机制 |
| 1.3.2 RNAi的递送方式 |
| 1.3.3 RNAi降低肿瘤的耐药性 |
| 1.4 选题意义 |
| 1.5 研究内容 |
| 第二章 核酸适体-磁性微球药物运载体系的构建及抗肿瘤活性研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.0 试剂和仪器 |
| 2.2.1 实验仪器 |
| 2.2.2 主要反应溶液的配置 |
| 2.2.3 DNA适配体与COOH-SPION的合成 |
| 2.2.4 凝胶阻滞实验 |
| 2.2.5 透射电子显微镜(TEM)分析 |
| 2.2.6 Apt-gc34@SPION和 Apt-S8@SPION的退火 |
| 2.2.7 ABTS法验证G-四链体结构 |
| 2.2.8 CD光谱分析 |
| 2.2.9 分子模拟Autodock计算小分子药物与DNA结合情况 |
| 2.2.10 药物的固载 |
| 2.2.11 稳定性检验 |
| 2.2.12 体外缓释率的研究 |
| 2.2.13 细胞的培养 |
| 2.2.14 普鲁士蓝染色试验 |
| 2.2.15 磁靶向实验 |
| 2.2.16 细胞摄取及活性氧含量的检测 |
| 2.2.17 细胞毒性实验 |
| 2.2.18 细胞迁移实验研究 |
| 2.2.19 流式细胞仪检测细胞凋亡 |
| 2.2.20 蛋白免疫印迹法检测蛋白表达 |
| 2.3 实验结果与讨论 |
| 2.3.1 纳米载药体系的表征 |
| 2.3.2 理论计算结果与药物固载量 |
| 2.3.3 稳定性实验 |
| 2.3.4 药物缓释 |
| 2.3.5 普鲁士蓝染色实验 |
| 2.3.6 磁靶向实验 |
| 2.3.7 细胞内化及活性氧检测 |
| 2.3.8 体外细胞毒性 |
| 2.3.9 细胞迁移 |
| 2.3.10 细胞凋亡的研究 |
| 2.3.11 WB实验结果分析 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 DNM&TMPyP&Apt-PSA&PEI@SPION体系的构建及抗肿瘤活性研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.0 试剂材料与仪器 |
| 3.2.1 主要试剂的配制 |
| 3.2.2 Apt-PSA&PEI@SPION纳米体系的构建 |
| 3.2.3 药物的固载量 |
| 3.2.4 稳定性考察 |
| 3.2.5 药物体外缓释 |
| 3.2.6 细胞培养 |
| 3.2.7 普鲁士蓝染色 |
| 3.2.8 磁靶向实验 |
| 3.2.9 细胞内活性氧检测 |
| 3.2.10 细胞毒性实验-CCK-8 实验 |
| 3.2.11 细胞迁移实验 |
| 3.2.12 细胞凋亡实验 |
| 3.2.13 反转录PCR(RT-PCR)及蛋白免疫印迹(Wersten Blot)实验 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 Apt-PSA&PEI@SPION纳米微球的表征 |
| 3.3.1.1 非变性聚丙烯酰胺凝(native-PAGE)胶实验 |
| 3.3.1.2 凝胶阻滞实验 |
| 3.3.1.3 TEM、Zeta和DLS实验 |
| 3.3.2 ABTS反应与CD光谱验证G-四链体 |
| 3.3.3 药物的固载量 |
| 3.3.4 稳定性 |
| 3.3.5 体外缓释 |
| 3.3.6 普鲁士蓝染色 |
| 3.3.7 磁靶向实验 |
| 3.3.8 细胞内活性氧检测 |
| 3.3.9 细胞毒性实验-CCK-8实验 |
| 3.3.10 细胞迁移实验 |
| 3.3.11 细胞凋亡实验 |
| 3.3.12 反转录PCR(RT-PCR)及蛋白免疫印迹(Wersten Blot)实验 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 DNM&TMPyP&PND&Bio-gc34&PSA&PEI@SPION体系的构建及抗肿瘤活性研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 试剂材料与仪器 |
| 4.2.2 Bio-gc34&PSA&PEI@SPION纳米体系的构建 |
| 4.2.3 药物的固载量 |
| 4.2.4 药物体外缓释 |
| 4.2.5 细胞培养 |
| 4.2.6 普鲁士蓝染色 |
| 4.2.7 磁靶向实验 |
| 4.2.8 药物在细胞内定位及活性氧检测 |
| 4.2.9 细胞毒性实验-CCK-8 实验 |
| 4.2.10 细胞周期实验 |
| 4.2.11 反转录PCR(RT-PCR)及蛋白免疫印迹(Wersten Blot)实验 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 琼脂糖凝胶实验 |
| 4.3.2 药物的固载量 |
| 4.3.3 体外缓释 |
| 4.3.4 普鲁士蓝染色 |
| 4.3.5 磁靶向实验 |
| 4.3.6 细胞内定位及活性氧检测 |
| 4.3.7 细胞毒性实验-CCK-8 实验 |
| 4.3.8 细胞周期实验 |
| 4.3.9 反转录PCR(RT-PCR)及蛋白免疫印迹(Wersten Blot)实验 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
（6）细辛马兜铃酸合成途径关键酶基因的挖掘及功能鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 含马兜铃植物的应用与毒性 |
| 1.1 马兜铃科植物的应用 |
| 1.2 中草药的药性和毒性分析 |
| 1.3 马兜铃酸毒性研究 |
| 第二章 马兜铃科中药减毒研究现状 |
| 2.1 传统的中药减毒研究 |
| 2.2 育种研究 |
| 第三章 分子育种在中药育种中的应用 |
| 3.1 外源基因导入方法 |
| 3.2 基因沉默方法 |
| 3.3 植物基因转化的受体系统 |
| 第四章 转录组学及其在中药中的应用 |
| 4.1 高通量测序 |
| 4.2 转录组数据分析 |
| 4.3 基因功能分类 |
| 4.4 RNA-seq在中药中的应用 |
| 第五章 细辛马兜铃酸合成途径 |
| 5.1 酪氨酸基本代谢途径 |
| 5.2 AAI的合成途径 |
| 5.3 酪氨酸脱羧酶(TyrDC) |
| 第六章 本研究的目的与意义 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 北细辛转录组数据初步分析 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 结果与分析 |
| 1.4 讨论 |
| 本章小结 |
| 第二章 TyrDCs家族基因的克隆与表达分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 方法及步骤 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 本章小结 |
| 第三章 TyrDCs家族基因的原核表达与功能验证 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 方法及步骤 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 本章小结 |
| 第四章 TyrDCs家族基因的过表达与验证 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 方法及步骤 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 本章小结 |
| 第五章 VIGS诱导TyrDCs家族基因沉默 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.2 方法及步骤 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.4 讨论 |
| 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（7）SIRT2基因对牛前体脂肪细胞分化的作用及其转录调控机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 脂肪组织与脂肪细胞的研究进展 |
| 1.2.1 脂肪组织的分类、功能及分布 |
| 1.2.2 脂肪细胞的种类和特点 |
| 1.2.3 脂肪组织和脂肪细胞的起源 |
| 1.2.4 脂肪发生 |
| 1.2.5 研究脂肪细胞分化的细胞模型 |
| 1.3 前体脂肪细胞分化的转录因子 |
| 1.3.1 C/EBPs |
| 1.3.2 PPARγ |
| 1.3.3 SREBP-1c/ADD |
| 1.3.4 其他转录因子 |
| 1.4 Sirt2 与脂肪细胞分化 |
| 1.4.1 哺乳动物Sirtuins家族简介 |
| 1.4.2 SIRT2 调控脂肪细胞分化研究进展 |
| 1.5 SIRT2 基因转录调控研究进展 |
| 1.6 基因功能的研究方法 |
| 1.6.1 表达载体系统 |
| 1.6.2 RNA干扰 |
| 1.7 基因转录调控分析方法 |
| 1.7.1 确定转录起始位点的方法 |
| 1.7.2 缺失和突变 |
| 1.7.3 电泳迁移率调变动分析 |
| 1.7.4 染色质免疫共沉淀 |
| 1.8 本研究的目的、意义和内容 |
| 1.8.1 研究目的和意义 |
| 1.8.2 研究内容 |
| 第二章 牛SIRT2 基因重组腺病毒过表达载体的构建及病毒包装 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 组织样 |
| 2.1.4 载体 |
| 2.1.5 细胞和菌 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 牛脂肪组织总RNA的提取及反转录 |
| 2.2.2 克隆SIRT2 基因CDS序列引物的设计与合成 |
| 2.2.3 SIRT2 完整CDS区的克隆 |
| 2.2.4 胶回收PCR扩增获得的SIRT2 基因CDS区 |
| 2.2.5 SIRT2 基因的亚克隆 |
| 2.2.6 重组穿梭载体pAdTrack-CMV-SIRT2 的构建与鉴定 |
| 2.2.7 pAd-SIRT2 腺病毒骨架载体的构建与鉴定 |
| 2.2.8 重组腺病毒Ad-SIRT2 的包装、扩繁和病毒滴度测定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 脂肪组织总RNA的提取 |
| 2.3.2 牛SIRT2 基因CDS区的克隆与鉴定 |
| 2.3.3 pAdTrack-CMV-SIRT2 重组质粒的鉴定 |
| 2.3.4 pAd-SIRT2 重组病毒过表达载体的鉴定 |
| 2.3.5 重组腺病毒Ad-SIRT2 的包装、扩繁及病毒滴度测定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 总RNA的提取 |
| 2.4.2 牛SIRT2 基因克隆 |
| 2.4.3 牛SIRT2 基因重组腺病毒过表达载体的构建与病毒包装 |
| 2.4.4 腺病毒滴度的测定 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 牛SIRT2 基因sh RNA序列的筛选与干扰腺病毒的包装 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 主要仪器 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 载体 |
| 3.1.4 细胞和菌 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 靶向牛SIRT2 基因的shRNA序列的设计与合成 |
| 3.2.2 pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA的构建与鉴定 |
| 3.2.3 psi CHECKTM-Ⅱ-SIRT2 表达载体的构建 |
| 3.2.4 有效干扰SIRT2 基因shRNA序列的筛选 |
| 3.2.5 pAd-shRNA病毒重组子的构建及鉴定 |
| 3.2.6 腺病毒的包装、扩增及滴度测定 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA表达载体的构建 |
| 3.3.2 SIRT2 基因的克隆与psiCHECKTM-II-SIRT2表达载体的构建 |
| 3.3.3 有效sh RNA序列的筛选 |
| 3.3.4 pAd-shRNA-1002 重组腺病毒载体的鉴定 |
| 3.3.5 Ad-shRNA-1002 腺病毒的包装、扩增及滴度测定 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 shRNA的设计与合成 |
| 3.4.2 有效干扰shRNA序列的筛选 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 过表达和干扰SIRT2 基因对牛前脂肪细胞分化的影响 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 主要仪器 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 组织样 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 牛前体脂肪细胞的分离和培养 |
| 4.2.2 病毒最佳感染复数(Multiplicity Of Infection,MOI)的确定 |
| 4.2.3 重组腺病毒Ad-SIRT2和Ad-shRNA-1002 有效性的鉴定 |
| 4.2.4 过表达和干扰SIRT2 基因对牛前体脂肪细胞分化的影响 |
| 4.2.5 统计分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 牛原代前体脂肪细胞的分离培养 |
| 4.3.2 MOI值的确定 |
| 4.3.3 病毒有效性的鉴定 |
| 4.3.4 油红O染色结果 |
| 4.3.5 Real-time PCR检测SIRT2、脂肪细胞分化及脂质代谢关键基因m RNA表达情况 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 Real-time PCR引物的检测 |
| 4.4.2 过量表达及干扰SIRT2 基因对牛前体脂肪细胞分化的作用 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 牛SIRT2 基因启动子活性分析 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 主要仪器 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 载体 |
| 5.1.4 细胞和菌 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 5'RACE确定牛SIRT2 基因的转录起始位点 |
| 5.2.2 克隆牛SIRT2 基因5’上游基本启动子区域 |
| 5.2.3 SIRT2 基因基本启动子序列生物信息学分析 |
| 5.2.4 牛SIRT2 基因基本启动子序列系列缺失片段的扩增 |
| 5.2.5 pGL3-SIRT2 promoter重组载体的构建及鉴定 |
| 5.2.6 启动子系列缺失片段的活性分析 |
| 5.2.7 统计分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 牛SIRT2 基因的转录起始位点 |
| 5.3.2 PCR扩增牛SIRT2 基因2 KB左右启动子区域 |
| 5.3.3 SIRT2 基因启动子进化保守序列分析 |
| 5.3.4 牛SIRT2 启动子区域Cp G岛预测结果 |
| 5.3.5 牛SIRT2 基因5’调控区系列缺失片段的扩增 |
| 5.3.6 重组质粒pGL3-SIRT2 promoter的鉴定 |
| 5.3.7 SIRT2 启动子系列缺失片段活性分析 |
| 5.3.8 SIRT2 核心启动子序列转录因子结合位点分析 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 牛SIRT2 基因转录起始位点的确定 |
| 5.4.2 牛SIRT2 基因启动子序列的扩增及活性分析 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 转录因子YY1 对牛SIRT2 基因的转录调控作用 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 主要仪器 |
| 6.1.2 主要试剂 |
| 6.1.3 质粒 |
| 6.1.4 细胞和菌 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 生物信息学分析 |
| 6.2.2 YY1 结合序列定点突变的双荧光素酶报告系统分析 |
| 6.2.3 电泳迁移率变动分析(Electrophoretic Mobility Shift Assays,EMSA) |
| 6.2.4 染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP) |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 生物信息学分析预测的保守的YY1 转录因子结合位点 |
| 6.3.2 YY1 转录因子的生物信息学分析 |
| 6.3.3 YY1 结合位点突变对SIRT2 启动子活性的影响 |
| 6.3.4 EMSA验证YY1 体外结合于SIRT2 启动子上 |
| 6.3.5 ChIP验证YY1 体内结合于SIRT2 启动子上 |
| 6.4 讨论 |
| 6.4.1 生物信息学分析YY1 结合位点及YY1 转录因子的保守性 |
| 6.4.2 YY1 结合位点正向调控SIRT2 基因的转录活性 |
| 6.4.3 YY1 转录因子结合于SIRT2 基因启动子上 |
| 6.5 小结 |
| 第七章 结论及创新点 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（8）黄芩苷增敏环丙沙星的关键外排基因筛选（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 大肠杆菌产生耐药的机制 |
| 1.1.1 外膜通透性改变 |
| 1.1.2 编码DNA解旋酶和拓朴异构酶Ⅳ的改变 |
| 1.1.3 质粒介导的喹诺酮类耐药 |
| 1.1.4 主动外排泵的表达导致喹诺酮类耐药 |
| 1.2 外排泵抑制剂的作用环节 |
| 1.2.1 阻断外排泵能量供应 |
| 1.2.2 阻碍底物通过外排泵通道 |
| 1.2.3 干扰外排泵组装的抑制剂 |
| 1.3 潜在的外排泵抑制剂-黄芩苷 |
| 1.4 Real-Time PCR检测基因表达差异 |
| 1.4.1 耐药基因检测方法 |
| 1.4.2 耐药基因的m RNA表达差异 |
| 1.4.3 荧光定量 PCR 的原理 |
| 1.5 反义寡核苷酸技术 |
| 试验一大肠杆菌对喹诺酮类药物的耐药性及黄芩苷与环丙沙星联用最佳浓度筛选 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株 |
| 2.1.2 药品 |
| 2.1.3 仪器设备 |
| 2.1.4 培养基 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 菌种的复苏 |
| 2.2.2 药品的配制 |
| 2.2.3 培养基的配制 |
| 2.2.4 MIC的测定 |
| 2.2.5 棋盘稀释法测定黄芩苷与环丙沙星联用MIC |
| 2.2.6 判定药敏联合的试验结果 |
| 2.2.7 不同浓度的黄芩苷对环丙沙星 MIC 的影响 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 单药的MIC及耐药菌株的筛选 |
| 3.2 联合药敏试验FIC结果 |
| 3.3 黄芩苷与环丙沙星联用时起协同效应的最佳浓度 |
| 4 讨论 |
| 4.1 分离菌株对氟喹诺酮类药物耐药率 |
| 4.2 适宜的黄芩苷浓度提高环丙沙星的抗菌活性 |
| 5 小结 |
| 试验二 黄芩苷和环丙沙星联用对耐药大肠杆菌主动外排相关靶基因 mRNA表达的影响 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验菌株 |
| 2.2 试剂 |
| 2.3 仪器 |
| 2.4 方法 |
| 2.4.1 菌株的处理 |
| 2.4.2 主要试剂的配置 |
| 2.4.3 引物 |
| 2.4.4 RNA的提取 |
| 2.4.4.1 菌株的培养 |
| 2.4.4.2 Trizol法提取菌株总RNA |
| 2.4.5 各外排基因和管家基因的PCR扩增 |
| 2.4.6 PCR产物的纯化与回收 |
| 2.4.7 标准曲线的建立 |
| 2.4.8 对不同处理耐药菌株的荧光定量 PCR 检测 |
| 2.4.9 数据分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 RNA提取 |
| 3.2 gapA基因扩增电泳 |
| 3.3 Real Time PCR各个主动外排标准曲线、溶解曲线、扩增曲线的建立 |
| 3.3.1 各个基因标准曲线的建立 |
| 3.3.2 各个基因溶解曲线的建立 |
| 3.3.3 各个基因扩增曲线的建立 |
| 3.4 不同处理耐药菌中各个基因荧光定量RT-PCR检测 |
| 3.4.2 不同药物共培养大肠杆菌耐药株acrB基因表达水平分析 |
| 3.4.3 不同药物共培养大肠杆菌耐药株acrD基因表达水平分析 |
| 3.4.4 不同药物共培养大肠杆菌耐药株acrE基因表达水平分析 |
| 3.4.5 不同药物共培养大肠杆菌耐药株acrF基因表达水平分析 |
| 3.4.6 不同药物共培养大肠杆菌耐药株mdtA基因表达水平分析 |
| 3.4.7 不同药物共培养大肠杆菌耐药株marA基因表达水平分析 |
| 3.4.8 不同药物共培养大肠杆菌耐药株robA基因表达水平分析 |
| 3.4.9 不同药物共培养大肠杆菌耐药株soxS基因表达水平分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 荧光定量PCR的应用 |
| 4.2 主动外排基因及调节基因m RNA表达量之间的关系 |
| 5 小结 |
| 试验三 黄芩苷增加acrA、acrD和 mar A基因沉默大肠杆菌对环丙沙星敏感性 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 菌株 |
| 2.2 试剂 |
| 2.3 仪器 |
| 2.4 反义寡核苷酸引物 |
| 2.5 感受态细胞的制备 |
| 2.6 转化试剂的准备 |
| 2.7 细胞转化 |
| 2.8 细胞分组及涂板 |
| 2.9 统计学处理 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 反义寡核苷酸沉默引物筛选 |
| 3.2 从环丙沙星平板上观察表型菌落数目与大小 |
| 3.3 黄芩苷对临床耐药菌株环丙沙星敏感性的影响 |
| 3.4 acrA、acrD、marA基因沉默对菌株环丙沙星敏感性的影响 |
| 3.5 黄芩苷对 acrA、acrD、marA 基因沉默前后环丙沙星敏感性的影响 |
| 3.6 acrA、acrD、marA基因沉默后黄芩苷对环丙沙星敏感性的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 全文结论 |
| 本文创新点 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 附录 |
（10）2’-0-甲氧乙基反义寡核苷酸在杜兴肌肉萎缩症上的应用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 对象和方法 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 细胞系 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 反义寡核苷酸药物 |
| 1.4 常用试剂 |
| 1.5 主要仪器设备 |
| 1.6 引物 |
| 1.7 主要分析工具软件 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 试剂配制 |
| 2.2 细胞培养 |
| 2.3 脂质体转染细胞 |
| 2.4 TRIzol法提取细胞总RNA |
| 2.5 RT-PCR和PCR反应条件 |
| 2.6 组织总蛋白的提取 |
| 2.7 蛋白浓度测定 |
| 2.8 WST-8试剂盒检测反义寡核苷酸毒性 |
| 2.9 免疫荧光组织化学检测 |
| 2.10 Western blot |
| 2.11 局部肌肉注射 |
| 2.12 系统注射 |
| 2.13 FACS流式细胞仪分析细胞转染效率和荧光强度 |
| 2.14 共聚焦荧光显微镜分析 |
| 2.15 组织中荧光标记MOE25(PS)的定量分析 |
| 3 统计学分析 |
| 结果 |
| 1 2'-O-MOE反义寡核苷酸在H_2K mdx细胞的体外测试 |
| 1.1 浓度效应及细胞毒性分析 |
| 1.2 时间效应 |
| 1.3 不同MOE反义寡核苷酸与临床上测试的2'OmePS药物的比较分析 |
| 2 2 '-O-MOE反义寡核苷酸在DMD小鼠模型上的局部和系统测试 |
| 2.1 局部肌肉测试 |
| 2.2 MOE25(PS)反义寡核苷酸在mdx小鼠上的系统测试 |
| 3 MOE25(PS)反义寡核苷酸在体内的组织分布与细胞内的摄取及共定位 |
| 3.1 MOE25(PS)在mdx小鼠的体内各组织分布情况 |
| 3.2 荧光标记MOE25(PS)在H_2K mdx细胞的摄取和细胞内共定位情况 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
四、反义寡核苷酸技术的进展及在医学中的应用（论文参考文献）
- [1]靶向LncRNA HOTAIR的反义显像初探[D]. 任炯羽. 宁夏医科大学, 2021(02)
- [2]新型核酸纳米载体的设计及在肿瘤细胞成像和药物递送中的应用研究[D]. 刘晓亭. 山东大学, 2020(08)
- [3]LAG3干扰寡核苷酸作为重组蛋白疫苗和灭活流感病毒疫苗佐剂的研究[D]. 李志琴. 吉林大学, 2019(02)
- [4]Piezo2通道在早泄外周神经敏感化中的机制研究[D]. 郭立强. 山东大学, 2019(02)
- [5]基于功能性适配体修饰的磁性纳米粒子载药体系构建及抗肿瘤活性研究[D]. 孙翔玉. 广东药科大学, 2019(02)
- [6]细辛马兜铃酸合成途径关键酶基因的挖掘及功能鉴定[D]. 王潇晗. 吉林农业大学, 2018(03)
- [7]SIRT2基因对牛前体脂肪细胞分化的作用及其转录调控机制研究[D]. 张亚冉. 西北农林科技大学, 2017(05)
- [8]黄芩苷增敏环丙沙星的关键外排基因筛选[D]. 付赛赛. 河南农业大学, 2017(05)
- [9]生物膜变形链球菌对反义寡核苷酸的摄取率检测[J]. 李睿,郭青玉,肖刚,邓晓红. 实用口腔医学杂志, 2013(04)
- [10]2’-0-甲氧乙基反义寡核苷酸在杜兴肌肉萎缩症上的应用研究[D]. 杨璐. 天津医科大学, 2012(02)