一、纤维连接蛋白在大鼠肺纤维化中的作用（论文文献综述）
王宝剑[1]（2021）在《基于“阳化气，阴成形”理论研究TGF-β1/Smads影响黄韧带肥厚的机制及模型的建立》文中进行了进一步梳理黄韧带肥厚（Ligamentum flavum hypertrophy,LFH）是退行性腰椎管狭窄症（Degenerative Lumbar Spinal Stenosis,DLSS）的主要病理表现之一。黄韧带（ligamentum flavum,LF）位于上、下椎板之间,从颈椎延伸至骶椎,起到保护和稳定脊柱的作用。黄韧带在纤维化过程中一方面是其自身体积发生增厚的改变,另一方面是其自身弹性的下降在脊柱后伸时出现皱褶、折叠,使椎管容积减小,导致马尾神经、神经根的受压和缺血缺氧。与此同时,肥厚黄韧带中增多的炎性介质会透过硬脊膜而扩撒至神经根,易造成神经根的炎症及水肿。另外,炎性介质还可以激活多种纤维化因子的表达而加速纤维化的进程。因此黄韧带炎症与纤维化的病理改变共同参与、相互影响而导致了 DLSS腰腿痛、间歇性跛行的症状。在退行性脊柱疾病的促炎细胞因子中,IL-1β、TNF-α是最主要的参与者,其在肥厚黄韧带中的高表达已得到初步证实,另外TGF-β 1/Smads被认为是引起纤维化的最重要的信号传导通路,它在各种组织与器官的纤维化和瘢痕组织纤维性修复过程中有着核心的推动作用。但目前关于黄韧带炎性或纤维化信号通路的研究较少。至于Smads通路是否可以介导TGF-β1致使细胞外基质沉积而导致黄韧带的肥厚,以及IL-1β、TNF-α和TGF-β 1/Smads通路中的相关原件与黄韧带厚度、纤维化程度的具体相关性尚未见报道。而在中医机制方面,“阳化气,阴成形”理论对黄韧带肥厚的病机阐明具有重要指导作用,该理论与现代医学“炎症-纤维化”的病理机制相契合。但目前尚无从该角度探讨黄韧带肥厚的报道。黄韧带肥厚动物模型的建立是研究退行性脊柱疾病的基础,也是探索黄韧带增厚机制、发现药物潜在治疗靶点的前提。但极少数研究涉及腰椎黄韧带肥厚动物模型的制作,对于该动物模型目前仍存在争议。实验一基于“阳化气,阴成形”理论研究IL-1β、TNF-α和TGF-β1/Smads在LFH中的表达及相关性目的:通过对比增厚黄韧带与未增厚黄韧带的纤维化程度以及IL-1β、TNF-α和TGF-β 1/Smads通路相关原件的表达水平,探索黄韧带厚度与纤维化程度和以上原件表达的具体相关性,初步证实Smads通路可以介导TGF-β1致使细胞外基质沉积而导致黄韧带肥厚。从“阳化气,阴成形”理论角度阐述黄韧带肥厚的中医病机,以期为中医药干预黄韧带“炎症-纤维化”病理过程提供理论支持。方法:（1）在取得医学伦理批准和患者知情同意的前提下,在临床手术中收集废弃的DLSS组增厚黄韧带和腰椎间盘突出症（Lumbar disc herniation,LDH）组未增厚黄韧带,各25例。（2）通过MRI测量两组黄韧带的厚度并对比其差异。（3）对两组标本组织进行HE染色组织学观察。（4）进行Masson三色法染色后,通过纤维化分级标准以及弹性纤维-胶原纤维比值来对比两组黄韧带总体与各层（腹侧层、中间层、背侧层）纤维化程度的差异。（5）免疫组化法检测两组黄韧带IL-1β、TNF-α、TGF-β 1/Smads（TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7）、collagen Ⅰ（Col 1）、collagen Ⅲ（Col 3）的定位、半定量表达。（6）Real-Time PCR 法检测两组黄韧带 IL-1β、TNF-α、TGF-β1/Smads（TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7）、Col1 和 Col 3 mRNA 的定量表达。（7）相关性研究:通过pearson相关与线性回归分析明确DLSS组黄韧带的厚度与其各层纤维化程度、mRNA表达的具体相关性。结果:（1）DLSS 组的黄韧带厚度为 5.13±0.80mm,大于 LDH 组 3.52±0.67mm（p<0.01）。（2）HE染色下,LDH组的未增厚黄韧带弹性纤维呈直线状,排列紧密且整齐,表面光滑连续,以弹性纤维为主,含有少量胶原纤维,细胞数目较少。DLSS组增厚的黄韧带纤维呈波浪状,排列紊乱、疏松,弹性纤维减少,胶原纤维含量增加,成纤维细胞增多。（3）DLSS组的总体纤维化分级为2.44±0.31级,高于LDH组的1.62±0.22级（p<0.05）;DLSS组腹侧层、中间层、背侧层的纤维化分级均高于LDH组（p<0.05或p<0.01或p<0.001）;DLSS组腹侧层、中间层、背侧层的纤维化分级是逐渐递增的,即腹侧层<中间层<背侧层（p<0.05或p<0.01）;DLSS组的弹性纤维-胶原纤维面积比值为1.85±0.54,低于LDH组的2.92±0.37（p<0.01）;DLSS组腹侧层、中间层、背侧层的弹性-胶原纤维比值均低于LDH组（p<0.05或p<0.01）;DLSS组腹侧层、中间层、背侧层的弹性-胶原纤维比值是逐渐递减的,即腹侧层>中间层>背侧层（p<0.05或p<0.01）。（4）免疫组化:DLSS 组的 IL-1 β、TNF-α、TGF-β 1、p-Smad2/3、Col 1和Col 3的蛋白表达均高于LDH组（p<0.05或p<0.01或p<0.001）。DLSS组的Smad7的蛋白表达低于LDH组（p<0.01）。（5）Real-Time PCR:DLSS 组 IL-1β、TNF-α、TGF-β1、Smad2、Smad3、Col 1 和 Col 3 的 mRNA 表达高于 LDH 组（p<0.05 或 p<0.01 或 p<0.001）。DLSS 组 Smad7 的 mRNA 表达低于 LDH 组（p<0.05）;DLSS 组的 IL-1β、TGF-β1、Smad2、Smad3、Col 1和Col 3的mRNA表达在背侧层最高,腹侧层最低,有从背侧层向腹侧层逐渐递减的趋势。Smad7的mRNA表达在背侧层最低,腹侧层最高,有从背侧层向腹侧层逐渐递增的趋势。（6）在DLSS组中,黄韧带腹侧层、中间层以及背侧层的纤维化分级随着黄韧带的厚度的增加而升高。各层的相关系数r分别为0.54,0.73,0.84,说明黄韧带的厚度与背侧层纤维化分级的相关程度最高。黄韧带腹侧层、中间层以及背侧层的弹性纤维-胶原纤维比随着黄韧带的厚度的增加而降低。各层的相关系数r分别为-0.62,-0.72,-0.81,说明黄韧带的厚度与背侧层弹性-胶原纤维比值的相关程度最高。（7）在DLSS组中,黄韧带厚度与背侧层TGF-β 1 mRNA表达的相关程度最高,其次依次为IL-1 β、Col 1等;黄韧带厚度与中间层IL-1 β mRNA表达的相关程度最高,其次依次为Smad7、TGF-β 1等;黄韧带厚度与腹侧层TGF-β 1 mRNA表达的相关程度最高,其次依次为为IL-1 β、Col 3等。结论:（1）相较于未增厚黄韧带,肥厚黄韧带中TGF-β1、Smad2、Smad3（或p-Smad2/3）、Col 1和Col3的mRNA和蛋白均呈高表达,Smad7的mRNA和蛋白呈低表达。初步证实Smads通路可以介导TGF-β1致使细胞外基质沉积而导致黄韧带肥厚。（2）在肥厚黄韧带中,背侧层的纤维化程度大于中间层和腹侧层。其厚度也与各层的纤维化程度呈正线性相关,且以背侧层相关性最高,中间层次之,最后是腹侧层。在肥厚黄韧带中,IL-1β、TNF-α、TGF-β1、Smad2、Smad3、Col 1和Col 3 mRNA表达均高于中间层和腹侧层,Smad7 mRNA表达低于中间层和腹侧层。其厚度也与各层的mRNA表达呈正线性（或负线性）相关,且以背侧层相关性最高,中间层次之,最后是腹侧层。说明黄韧带炎症与纤维化的严重程度由背侧向腹侧逐渐递减,其病理改变可由背侧向腹侧逐渐发展。（3）结合“阳化气,阴成形”理论认为,黄韧带在增龄、急性创伤、慢性劳损等因素作用下易出现微损伤,并诱导了局部炎症反应,当机体处于“阴平阳秘”的生理状态时,这种损伤尚能引发适度的炎症反应,以及正常的纤维化修复和瘢痕的形成,而当机体处于阴阳失衡、阳不化气状态时,持续的炎症反应使细胞因子、趋化因子等代谢产物长期聚集于黄韧带局部,形成了炎症微环境,从而诱发了过度的纤维化修复和瘢痕的形成。该中医理论与现代医学中炎症反应诱发过度的纤维化修复和瘢痕形成的理论相类似。实验二基于三种造模方法诱导大鼠黄韧带肥厚动物模型的建立与评价目的:建立一种新的黄韧带肥厚大鼠模型,并将其与人肥厚黄韧带组织进行比较、评估。同时,探讨腰椎活动范围的增加所诱发黄韧带增厚的机制。方法:（1）将72只大鼠分为A假手术组（切开皮肤等组织后缝合）、B肌肉切除组（切除L5-L6椎旁肌肉）、C骨关节切除组（切除L5-L6棘突和棘上韧带,磨除L5/6双侧关节突关节的一半,关节囊不做缝合处理）以及D肌肉+骨关节切除组（B+C混合）共4组,于造模后的4w、8w、12w共3个时间点取材。（2）通过对黄韧带的HE染色和Masson染色,测量L5/6节段黄韧带总体和背侧层的厚度以及弹性纤维-胶原纤维的比值。（3）通过X线片测量屈曲和背伸位时L5/6节段的活动范围和椎间隙高度。（4）通过免疫组化、免疫印迹、Real-Time PCR法检测黄韧带中炎性因子(IL-1β、TNF-α、TGF-β1/Smads通路相关原件和Col 1、Col 3的表达。（5）将大鼠黄韧带与人肥厚黄韧带的退变程度进行比较、评估。结果:（1）HE染色与黄韧带厚度的测量:三种造模方法均可以引起黄韧带厚度的增加,其中以肌肉+骨关节切除法最明显,其次为骨关节切除法,最后为肌肉切除法。12w时肌肉+骨关节切除组黄韧带的整体厚度是假手术组的1.35倍,骨关节切除组是假手术组的1.14倍,肌肉切除组是假手术组的1.06倍。但三种造模方法均不能引起黄韧带宽度的额外增加。12w时肌肉+骨关节切除组黄韧带背侧层厚度是假手术组的2.09倍,骨关节切除组是假手术组的1.26倍,肌肉切除组是假手术组的0.96倍。三种造模方法中只有骨关节切除法和肌肉+骨关节切除法可以引起黄韧带背侧层厚度及其所占比例的增加,其中以肌肉+骨关节切除法最为明显,其次为骨关节切除法。（2）Masson染色与纤维化程度:三种造模方法均可以引起黄韧带的弹性-胶原纤维比值的下降,其中以肌肉+骨关节切除法最为明显,其次为骨关节切除法,最后为肌肉切除法。12w时肌肉+骨关节切除组黄韧带的弹性-胶原纤维比是假手术组的0.43倍,骨关节切除组是假手术组的0.66倍,肌肉切除组是假手术组的0.95倍。（3）影像学测量:三种造模方法均可以造成屈曲位椎间隙后方高度和活动范围的增加,其中以肌肉+骨关节切除法最明显,骨关节切除法次之,最后是肌肉切除法。（4）免疫组化、免疫印迹、Real-Time PCR:①免疫组化结果显示,肌肉+骨关节切除组所产生的 IL-1 β、TNF-α、TGF-β 1、p-smad2/3、Col 1 和 Col 3的蛋白表达量最多,Smad7的表达量最少,其次为骨关节切除法,最后为肌肉切除法;②免疫印迹结果显示,肌肉+骨关节切除组所产生的IL-1 β、TNF-α、TGF-β1和Col 1的蛋白表达量最多,其次为骨关节切除法,最后为肌肉切除法;③Real-Time PCR结果显示,肌肉+骨关节切除组所产生的IL-1 β、TNF-α、TGF-β1、Smad2、Smad3、Col1和Col 3的mRNA表达量最多,其次为骨关节切除法,最后为肌肉切除法。（5）造模术后12w时假手术组的弹性-胶原纤维的比值为2.79,将其与实验一中数据比较,其退变程度类似于人未增厚的黄韧带（2.92）;肌肉切除组的弹性-胶原纤维的比值为2.65,退变程度仍接近人未增厚的黄韧带（2.92）;骨关节切除组的弹性-胶原纤维的比值为1.84,退变程度接近人轻度肥厚的黄韧带（1.66-2.23）;肌肉+骨关节切除组的弹性-胶原纤维的比值为1.19,退变程度与人中度肥厚的黄韧带相近（1.08-1.66）。结论:（1）建立了一种新的黄韧带肥厚大鼠模型,其退变程度可能类似于人类中度肥厚的黄韧带。（2）三种造模方法均能引起黄韧带退变与增厚,其程度依次为肌肉+骨关节切除法>骨关节切除法>肌肉切除法。（3）在大鼠模型中,黄韧带背侧层的增厚占比例最高,这可能是由于背侧层在屈曲位受到更大的应力导致的。说明机械应力可能是诱发或加速黄韧带增厚的重要因素。（4）腰椎屈曲范围的增加所引发的机械应力可导致黄韧带中炎性因子TNF-α、IL-1 β的高表达,并诱导TGF-β 1/Smads通路致使细胞外基质沉积而导致黄韧带肥厚。
喻娟娟[2]（2021）在《CB2受体激动剂JWH133和抑制剂SR144528对卵蛋白诱导大鼠气道重塑的影响》文中认为目的:通过建立卵蛋白（OVA）诱导大鼠气道重塑动物模型,用大麻素CB2受体激动剂JWH133和抑制剂SR44528分别对气道重塑大鼠进行干预,观察各组大鼠肺组织切片病理改变,检测各组大鼠肺泡灌洗液中基质金属蛋白酶9（MMP-9）、基质金属蛋白酶（MMP-2）和血管内皮生长因子（VEGF）的浓度,以及上述因子在肺组织中的蛋白表达情况。探讨大麻素受体激动剂JWH133和抑制剂SR44528分别对气道重塑大鼠影响。方法:将32只SD雌性大鼠平均分成4组（n=8）,分别为空白对照组、气道重塑组、气道重塑+JWH133组、气道重塑+SR144528组。空白对照组大鼠不进行干扰,气道重塑组于第1天和第8天分别经腹腔注射OVA（上海源叶,货号S12012,纯度98%）生理盐水溶液（100mg/ml）1ml进行致敏,第15天到第56天每天用2%OVA生理盐水30ml雾化进行激发,每天雾化一次,每次约半小时。气道重塑+JWH133组:致敏和激发处理同气道重塑组,此外,于第28天到第56天每次雾化前半小时经腹腔注射大麻素受体激动剂JWH133生理盐水溶液1ml,每只大鼠JWH133的用量2.5mg/kg,每天1次。气道重塑+SR144528组致敏和激发处理同气道重塑组,此外,于第28天到第56天每次雾化前半小时经腹腔注射大麻素受体激动剂SR144528生理盐水溶液1ml,每只大鼠SR144528133的用量2.5mg/kg,每天1次。动物模型完成后全部处死并取材,取肺组织做HE染色观察大鼠肺组织形态并进行肺损伤评分,Masson染色观察大鼠肺组织胶原纤维沉积情况;取支气管肺泡灌洗液ELISA检测基质金属蛋白酶9（MMP-9）、基质金属蛋白酶（MMP-2）和血管内皮生长因子（VEGF）的浓度;取肺组织Western blot方法检测大鼠肺组织MMP-9、MMP-2、VEGF蛋白表达情况,用image lab软件对蛋白印迹条带进行密度分析测定其灰度值。结果:第56天雾化结束后,各组大鼠一般情况良好,整个造模期间无大鼠死亡。（1）肺组织HE染色观察组织形态学改变:空白对照组大鼠肺组织切片HE染色显示肺组织结构清晰,肺泡腔完整,无明显肺泡充血、出血,肺泡腔及血管壁可见少许中性粒细胞浸润,肺泡壁间隔薄、支气管壁无增厚,肺损伤评分为（0.56±0.5）分。气道重塑组大鼠肺组织切片HE染色显示肺组织结构紊乱、肺泡破裂、肺泡间隔厚、完整的肺泡数目少,肺泡及气道上皮基底膜增厚,肺损伤评分为（3.44±0.5）分。气道重塑+JWH133组大鼠肺组织切片HE染色显示肺组织结构清晰,肺泡腔完整,无明显肺泡充血、出血,肺泡腔及血管壁可见少许中性粒细胞浸润,肺泡壁间隔薄、支气管壁无增厚,肺损伤评分为（0.67±0.47）分。气道重塑+SR144528组肺组织切片HE染色显示肺组织结构紊乱,肺泡破裂较多,肺泡间隔明显增厚,肺泡壁及气道上皮基底膜增厚,肺损伤评分为（3.56±0.5）分。与空白对照组比较,气道重塑组大鼠肺组织损伤评分重,差异有显着性（P<0.01,t=11.63）。与气道重塑组比较,气道重塑+JWH133组大鼠肺组织损伤评分轻,差异有显着性（P<0.01,t=11.47）。与气道重塑组比较,气道重塑+SR144528组大鼠肺组织损伤评分有轻微增加,差异没有显着性（P>0.05,t=0.45）。（2）肺组织切片Masson染色胶原蛋白结果:空白对照组肺组织切片Masson染色可见肺泡间隔、肺泡腔胶原纤维散在分布。气道重塑组大鼠肺组织切片Masson染色可见肺泡间隔、肺泡腔胶原纤维密集分布。气道重塑+JWH133组肺组织切片Masson染色可见肺泡间隔、肺泡腔胶原纤维散在分布。气道重塑+SR144528组大鼠肺组织切片Masson染色可见肺泡间隔、肺泡腔胶原纤维密集分布。（3）Elissa检测结果:各组大鼠BALF中MMP-2的浓度分别为空白对照组（0.9±0.17）,气道重塑组（1.78±0.34）,气道重塑+JWH133组（1.07±0.41）,气道重塑+SR144528组（1.78±0.44）。各组大鼠BALF中MMP-9的浓度分别为空白对照组（0.56±0.36）,气道重塑组（1.04±2）,气道重塑+JWH133组（0.52±0.36）,气道重塑+SR144528组（1.31±0.55）。各组大鼠BALF中VEGF浓度分别为空白对照组（0.95±0.24）,气道重塑组（1.75±0.41）,气道重塑+JWH133组（1.14±0.58）,气道重塑+SR144528组（1.87±0.68）。与空白对照组比较,气道重塑组大鼠BALF中MMP-9、MMP-2、VEGF的浓度均增高,差异有显着性（P<0.01）。与气道重塑组比较,气道重塑+JWH133组大鼠BALF中MMP-9、MMP-2、VEGF的浓度明显降低,差异有显着性（P<0.01）。与气道重塑组比较,气道重塑+SR14452组大鼠BALF中MMP-9、MMP-2、VEGF的浓度升高,差异无显着性（P>0.05）。（4）Western Blot检测各组大鼠肺组织MMP-9、MMP-2、VEGF蛋白表达情况结果显示:上述因子蛋白表达经SDS-PAGE分析均有条带表达,空白对照组各因子灰度与内参灰度的比值依次为MMP-9（0.56±0.36）,MMP-2（0.9±0.17）,VEGF（0.95±0.24）。气道重塑组各因子灰度与内参灰度的比值依次为MMP-9（1.04±0.32）,MMP-2（1.7±0.34）,VEGF（1.75±0.41）。气道重塑+JWH133组各因子灰度与内参灰度的比值依次为MMP-9（0.52±0.36）,MMP-2（1.07±0.41）,VEGF（1.14±0.58）。气道重塑+SR144528组各因子灰度与内参灰度的比值依次为MMP-9（1.31±0.55）,MMP-2（1.78±0.44）,VEGF（1.87±0.68）。与空白对照组比较,气道重塑组大鼠肺组织MMP-9、MMP-2、VEGF蛋白表达均高,差异有显着性（P<0.01）。与气道重塑组比较,气道重塑+JWH133组大鼠肺组织MMP-9、MMP-2、VEGF蛋白表达明显降低,差异有显着性（P<0.01）。与气道重塑组比较,气道重塑+SR144528组大鼠肺组织MMP-9、MMP-2、VEGF蛋白表达高,差异无显着性（P>0.05）。结论:1、用卵蛋白腹腔注射致敏大鼠并雾化56天,可以导致大鼠气道重塑样改变。2、大麻素受体激动剂JWH133可以减轻卵蛋白气道重塑大鼠的肺组织损伤3、下调MMP-9、MMP-2、VEGF表达有可能是大麻素受体激动剂JWH133减轻气道重塑大鼠肺损伤的机制之一。
蔡文臣[3]（2021）在《矽肺纤维化靶向LncRNAs和mRNAs的筛选、验证及其调控机制研究》文中进行了进一步梳理目的基于动式染尘系统构建矽肺大鼠模型。采用高通量转录组测序分析筛选矽肺大鼠模型中与矽肺纤维化有关的差异LncRNAs和差异mRNAs,研究与探讨具有代表性的差异LncRNA[包括LncRNA LOC102549714（Lnc714）、LOC103691771（Lnc771）]和差异mRNA[分泌性磷蛋白1（SPP1）]在矽肺纤维化进程中的功能及其调控机制。方法采用动式染尘系统构建矽肺大鼠模型,随机分为对照24周组、染尘24周组。采用HE染色和天狼星红染色法观察肺组织病理形态的改变;通过免疫组织化学染色法（IHC）和免疫印迹法（Western blot）检测纤维化相关蛋白α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）以及I型胶原（COLI）的定位及表达。利用高通量转录组测序、分析和筛选矽肺大鼠模型中与矽肺纤维化有关的差异LncRNAs和mRNAs;采用富集分析与注释工具对候选差异LncRNAs和mRNAs进行生物信息学分析。实时荧光定量PCR（q RT-PCR）法检测候选差异LncRNAs Lnc714、Lnc771、LOC102550137（Lnc137）、LOC103692016（Lnc2016）、LOC103693125（Lnc125）和候选差异mRNAs SPP1、Mmp12、Ccl7、Defb5、Slc26a4、Fabp4、Lpo、Lcn2、Itln1和Dlk1在矽肺大鼠肺组织、转化生长因子1（TGF-β1）诱导的肺原代成纤维细胞、Si O2诱导的RAW264.7单核巨噬细胞、Si O2诱导的肺泡II型MLE-12上皮细胞以及尘肺患者肺泡灌洗液的巨噬细胞中的表达。在肺原代成纤维细胞中分别沉默或过表达Lnc714、Lnc771和Lnc714+miR-873-3p模拟物（Lnc714+mi873-3p）,在基础水平及TGF-β1诱导水平上检测α-SMA、COLI、转化生长因子I型受体（TGF-βRI）、TGF-βRII、p-Smad2/3和Smad2/3的表达。ELISA法检测SPP1在尘肺患者血清中的含量。结合矽肺大鼠模型、体外诱导构建Si O2诱导的RAW264.7单核巨噬细胞模型,并予以SPP1重组蛋白和Ac-SDKP进行干预。IHC检测SPP1的表达以及定位;Western blot法检测COLI、巨噬细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、TGF-β1、TGF-βRI、TGF-βRII、p-Smad2/3、Smad2/3和SPP1的表达。结果1 HE染色、天狼星红染色、IHC染色及Western blot结果显示,与对照24周组比较,染尘24周组中可见典型融合的细胞纤维性结节,且有较多红色条索状胶原纤维沉积,α-SMA和COLI在矽结节及周边间质纤维化区域呈强阳性表达。高通量转录组测序结果显示,与对照组比较,矽肺大鼠肺组织中86个LncRNAs表达上调和59个LncRNAs表达下调,差异均具有统计学意义（P<0.05）。根据差异变化倍数以及丰度,筛选获得了5个候选差异LncRNAs,采用q RT-PCR在大鼠肺组织中进行验证分析,结果显示与对照24周组比较,Lnc714、Lnc771和Lnc137在染尘24周组中表达升高,而Lnc2016和Lnc125表达降低,差异均具有统计学意义（P<0.05）。q RT-PCR结果显示Lnc714和Lnc771在TGF-β1诱导的肺成纤维细胞、Si O2诱导的单核巨噬细胞RAW264.7和矽肺患者肺泡灌洗液的巨噬细胞中高表达（P<0.05）。IHC和Western blot结果显示,与TGF-β1诱导组比较,沉默Lnc771和Lnc714抑制α-SMA、COL I、TGF-βRI、TGF-βRII和p-Smad2/3的蛋白表达（P<0.05）。过表达Lnc771和Lnc714可促进肺成纤维细胞α-SMA、COL I、TGF-βRI、TGF-βRII和p-Smad2/3的表达（P<0.05）。而在过表达Lnc714的基础上给予miR-873-3p模拟物可抑制肺成纤维细胞α-SMA、COL I、TGF-βRI、TGF-βRII和p-Smad2/3的表达和细胞迁移。2高通量转录组测序结果显示,与对照组比较,矽肺大鼠肺组织中有912个mRNAs表达上调和426个mRNAs表达下调;根据差异变化倍数以及丰度,筛选获得了10个候选差异mRNAs,采用q RT-PCR在大鼠肺组织中进行验证分析。结果显示,与对照24周组比较,SPP1、Mmp12、Ccl7、Defb5、Slc26a4和Fabp4在染尘24周组中表达明显升高（P<0.05）,而Lpo、Lcn2、Itln1和Dlk1表达明显降低（P<0.05）;ELISA结果显示,与接尘对照组比较,尘肺患者血清中SPP1表达升高（P<0.05）。IHC及Western blot结果显示,与对照24周组相比较,染尘24周组肺组织内COL I、MCP-1、TGF-β1和SPP1表达上调;与染尘24周组相比较,Ac-SDKP干预组中COL I、MCP-1、TGF-β1和SPP1的表达降低（P<0.05）。与对照组相比较,Si O2诱导的巨噬细胞中COL I、MCP-1、TGF-β1和SPP1蛋白表达升高;与Si O2诱导组相比较,给予Ac-SDKP干预后,巨噬细胞中COL I、MCP-1、TGF-β1和SPP1蛋白表达下降（P<0.05）。与对照组相比较,SPP1诱导组的巨噬细胞中TGF-βRI、TGF-βRII和p-Smad2/3表达上调;与SPP1诱导组相比较,给予Ac-SDKP和LY364947干预后,巨噬细胞中的TGF-βRI、TGF-βRII和p-Smad2/3表达下降（P<0.05）。结论矽肺大鼠模型的肺组织中筛选出了145个差异LncRNAs和1338个差异mRNAs,其中具有代表性的差异LncRNA Lnc771和Lnc714可通过TGF-β1/Smad2/3信号通路参与调控肌成纤维细胞分化。具有代表性的差异mRNA SPP1能够激活TGF-β1信号通路,从而促进大鼠矽肺纤维化的形成与进展,靶向阻断SPP1/TGF-β1信号,可以阻抑矽肺纤维化的形成与进展。图43幅;表9个;参245篇。
李楠楠[4]（2021）在《黄芪甲苷Ⅳ通过PPM1A调控TGF-β1/Smad信号通路减轻矽肺肺损伤和纤维化》文中进行了进一步梳理研究背景及意义长期暴露性吸入二氧化硅粉尘可引起以肺结节和肺纤维化为主要病理特征的肺部疾病,称为矽肺病,该疾病常表现为进行性加重的呼吸困难及肺功能下降,最终结局呼吸衰竭直致死亡。由于该病的致残、致死率极高,被称为“第二肺癌”。中国拥有最大的矽肺患者人群,近年,由于预防措施仍不完备,发病人数持续上升。在西方发达国家,职业健康机构也被同样的问题所困扰。目前由于矽肺发病的病理生理作用机制仍未被完全阐释,迄今尚未发现对实际治疗有较高价值的药物,所以,矽肺深入具体的作用机制及更实际有效的治疗方案值得进一步探讨。多项研究表明,TGF-β1在相关纤维化疾病中参与细胞增殖、迁移、分化、基质沉积、免疫应答反应、炎症系统调节等反应,为其中重要的调控因子,并在组织的修复和纤维化中发挥关键作用。有大量研究证实TGF-β1对组织纤维化进程的干预通过Smads信号通路的激活而发挥作用,事实上TGF-β1/Smad信号通路被证实参与在机体诸多器官、组织发生纤维化病变的病理生理过程。PPM1A即镁离子依赖的蛋白磷酸酶1A,隶属于丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶家族,此因子参与真核细胞压力相关细胞内信号通路的调节过程。相关科研实验证实p-Smad2/Smad3可以特异性选择被PPM1A去磷酸化,激活大鼠中p-Smad2/3的高表达,而这个过程将被PPM1A的干预而受到抑制。这也表明PPM1A能够负向调控TGF-β1/Smad信号通路的活性。黄芪甲苷Ⅳ（ASV）是黄芪的主要活性物质之一。在过去的几十年中,ASV通过体外和体内实验证明了其潜在的心脏保护和免疫增强作用。近年来,对ASV药理作用的研究已经得到广泛而深入地开展。研究表明,ASV能够有效治疗脑血管疾病、心肺血管疾患、胰岛功能异常及肝损害等免疫相关损害而引起的多种疾病,且越来越多的证据支持ASV用于治疗器官纤维化、炎症反应、氧化应激和细胞凋亡。我们前期实验亦证实ASV对矽肺肺损伤及纤维化具有保护作用。鉴于以上理论基础,我们认为:PPM1A的低表达使Smad3持续性高磷酸化状态,维持了TGF-β1/Smad信号通路的高水平激活,加速了肺组织纤维化进程;ASV能够有效调控PPM1A的表达水平,抑制Smad3的持续磷酸化,进而延缓矽肺大鼠的肺纤维化。我们将进一步阐明ASV矽肺保护作用的相关机制及可能涉及的信号通路,寻找矽肺治疗中潜在的生物靶向诊断和治疗中的生物标志物及药物作用靶位点,提高矽肺患者生命质量,改善临床预后。第一部分 黄芪甲苷Ⅳ（ASV）对矽肺损伤及纤维化的保护作用目的旨在研究黄芪甲苷Ⅳ对矽肺肺损伤及纤维化的影响。方法1.动物实验部分:非气管暴露法构建矽肺大鼠模型,分为对照组、ASV组、矽肺组和实验组（矽肺+ASV）组,行相关处理后检测各组组织学形态变化（HE及Masson染色）,随后采用RT-PCR、免疫组化方法对纤维化标记物Ⅰ型胶原、纤维连接蛋白1和α-平滑肌肌动蛋白的表达情况进行检测。2.细胞实验部分:体外SiO2刺激人胚肺成纤维细胞构建矽肺细胞模型。行RT-PCR及Western blot和免疫荧光检测纤维化标记物Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和α-平滑肌肌动蛋白的表达情况。结果1.HE染色及Masson染色证实矽肺大鼠模型构建成功,经ASV处理后矽肺肺损伤及纤维化减轻。矽肺大鼠模型肺组织中存在Ⅰ型胶原、纤维连接蛋白1和α-平滑肌肌动蛋白异常高表达;经黄芪甲苷Ⅳ处理后纤维化标记物表达较矽肺组明显减低。2.体外细胞实验亦证实黄芪甲苷Ⅳ可降低纤维化标记物Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和α-平滑肌肌动蛋白的表达。小结黄芪甲苷Ⅳ（ASV）可缓解矽肺大鼠的肺损伤及纤维化;体内体外实验证实:ASV可减少矽肺纤维化相关蛋白I型胶原（collagen Ⅰ）、Ⅲ型胶原（collagenⅢ）、纤维连接蛋白1（FN1）和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达。第二部分 黄芪甲苷Ⅳ通过调控TGF-β1/Smad信号通路抑制炎症和氧化应激发挥矽肺保护作用目的探索黄芪甲苷Ⅳ矽肺保护作用可能参与的病理生理过程及对经典纤维化通路TGF-β1/Smad信号通路的影响。方法构建矽肺大鼠模型,将实验动物分为对照组、ASV组、矽肺组和实验组（矽肺+ASV）,细胞计数法检测肺泡灌洗液中炎症细胞募集情况,ELISA法检测氧化应激和炎症因子的情况。RT-PCR和Westernblot检测TGF-β1/Smad通路相关因子在各组的表达情况。结果1.矽肺中氧化应激、炎细胞和炎性因子水平明显增高,ASV可降低矽肺大鼠的氧化应激、炎细胞募集和炎性因子水平;2.TGF-β1/Smad通路在矽肺中异常激活,ASV不能降低TGF-β1/Smad信号通路中Smad2、Smad3基因的表达,而是通过影响Smad2、Smad3磷酸化抑制矽肺组织中TGF-β1/Smad通路的活性。小结ASV通过影响Smad2、Smad3的磷酸化阻断矽肺组织TGF-β1/Smad通路,削弱氧化应激与炎症反应。第三部分 黄芪甲苷Ⅳ通过调节PPM1A的表达调控TGF-β1/Smad信号通路目的探讨黄芪甲苷Ⅳ靶向调节PPM1A的表达对TGF-β 1/Smad信号通路的影响。方法Westernblot检测矽肺组织和细胞模型中黄芪甲苷Ⅳ对PPM1A表达的影响。行黄芪甲苷Ⅳ浓度梯度及时间梯度检测明确其对PPM1A的调控作用。构建si-PPM1 A 载体,分为 si-Control 和 si-PPM1 A 组,两组均分为对照、SiO2、SiO2+ASV亚组,检测各亚组内PPM1A的表达、肺纤维化指标以及TGF-β1/Smad信号通路相关因子的蛋白表达情况。结果1.体内体外实验证实:在矽肺中ASV促进PPM1A的表达,同时降低p-Smad2/3的表达。2.体外实验证实:矽肺细胞模型中PPM1A的表达对ASV具有浓度依赖性和时间依赖性。3.PPM1A与p-Smad2/3表达显着负相关。4.PPM1A基因沉默后,黄芪甲苷Ⅳ对Smad2/3磷酸化和下游纤维化因子的抑制作用减弱,表明黄芪甲苷Ⅳ可能通过PPM1A介导调节Smad2/3磷酸化和下游纤维化信号因子。小结黄芪甲苷Ⅳ可能通过PPM1A介导调节Smad2/3磷酸化调控TGF-β1/Smad信号通路发挥矽肺保护作用。结论我们成功在体内外构建矽肺模型,经研究发现黄芪甲苷Ⅳ（ASV）可缓解矽肺大鼠的肺损伤及纤维化;体内体外实验证实ASV可减少矽肺纤维化相关蛋白collagen Ⅰ、collagenⅢ、FN1和α-SMA表达。ASV可降低矽肺大鼠的氧化应激、炎细胞和炎性因子水平。ASV通过影响Smad2、Smad3磷酸化抑制TGF-β1/Smad信号通路发挥抗矽肺纤维化作用。进一步研究发现PPM1A在矽肺中低表达,p-Smad2/3高表达;ASV可促进PPM1A表达,降低p-Smad2/3表达;ASV处理时间及浓度与PPM1A的表达显着正相关;同时p-Smad2/3表达与ASV处理时间及浓度负相关;PPM1A同p-Smad2/3表达之间的负相关联系是非常密切的;而PPM1A表达受到黄芪甲苷Ⅳ的靶向调节,降低Smad2/3磷酸化水平,负向调控TGF-β1/Smads信号通路的传导。黄芪甲苷Ⅳ能够靶向调控PPM1A的表达干扰Smad2/3磷酸化进程,实现对TGF-β1/Smad信号通路的调控,影响炎症反应和氧化应激发挥矽肺保护作用。
高芳瑜[5]（2021）在《LncRNA MRAK050699通过调控EMT过程在矽肺纤维化中的作用研究》文中研究说明目的通过构建矽肺大鼠模型,观察矽肺特有lncRNA表达谱,模拟矽肺发病过程,敲减大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞（RLE-6TN细胞）中lncRNA MRAK050699,探索MRAK050699对SiO2粉尘诱导RLE-6TN细胞上皮-间充质转化（EMT）的影响,进而观察MRAK050699对矽肺纤维化过程的调控作用。方法1.SPF级雄性SD大鼠20只,随机将大鼠分为2组,每组10只:生理盐水对照组、矽肺模型组。采用非暴露气管注入方法,向模型组大鼠气管内一次性注入游离SiO2粉尘50mg,生理盐水对照组则注入等量灭菌的生理盐水。然后将处理后的大鼠正常喂养45天取材。行苏木素-伊红（HE）染色、马松（Masson）染色、免疫组化（IHC）检测;实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）法检测组织中各项筛选出的lncRNA;制备基因芯片构建差异表达microRNA-靶基因的调控网络。利用miRanda工具预测差异表达上调和下调的基因,并按照差异倍数进行排序,cytoscape软件构建整合的差异表达的lncRNA-microRNA-mRNA网络。利用KEGG分析lncRNA相关靶基因的富集途径,用基因本体（GO）富集分析LncRNA相关靶基因的功能。使用荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ hybridization,FISH）观察lncRNA在细胞中的定位。2.使用CCK8法测定SiO2粉尘对NR8383细胞活力的影响,使用蛋白免疫印记（Western blot）法检测不同浓度粉尘刺激NR8383细胞分泌TGF-β表达水平。建立共培养体系,实验分为四组培养体系,分别为正常组、模型组、敲减对照组以及敲减组。（NR8383细胞与RLE-6TN细胞铺板比例为1:2）,向后三组共培养体系的transwell小室中加入40μg/cm2 SiO2粉尘悬液150μl后,四组同时继续培养24h。培养结束后,取出transwell小室,观察下层小室细胞状态,提取下室的RLE-6TN细胞的总RNA及全蛋白,分别检测TGFbr1、p-Smad3、E-cadherin、N-cadherin、α-SMA、Vimentin、Snail、ZEB1、ZEB2、COLⅠ、COLⅢ、FN的m RNA以及蛋白表达水平。结果1.大鼠肺组织解剖结果可见,生理盐水对照组大鼠双肺呈粉红色,表面光滑,质软,柔软,弹性良好;矽肺模型组大鼠肺组织中可见散在的灰白色斑块,质硬。HE、Masson结果显示,生理盐水对照组与模型组相比,可见清晰的大鼠肺泡结构,血管轻度扩张充血;肺泡间隔区未见大量胶原纤维增生。而矽肺模型组大鼠肺泡结构不完整,可见明显的结节状结构,呈肺气肿改变,部分可见斑片状纤维化;并可见蓝色胶原丝状物分布,结节内胶原明显增生。免疫组化结果显示,α-SMA、COLⅠ蛋白在模型组中高表达。基因芯片结果可见,差异表达的lncRNAs有1077个,其中378个表达上调,699个表达下调。差异表达的m RNA中,215例上调,510例下调。Tgfbr1为参与TGF-β信号通路中最重要的靶基因。通过PCR技术对大鼠肺组织中筛选出的LncRNA表达水平进行验证。可得,Tgfbr1 mRNA水平以及21个lncRNA的表达水平在矽肺模型组的肺组织中均上调,MRAK052509、MRAK139674、AY539881、MRAK050699、XR6113、uc.452+、BC167061的表达差异最为显着。使用Spearman检验进行相关性分析,MRAK016357、MRAK052509、S56463、MRAK050699、BC167061、U06752、AY007691与Tgfbr1在矽肺大鼠模型肺组织的表达中呈正相关。使用细胞定位的方法观察到MRAK050699主要位于肺组织细胞的胞质中。KEGG途径分析表明,上调的前10条途径是补体和凝血级联途径、淀粉和蔗糖代谢途径、类风湿关节炎等。下调的前十条途径为RAP1信号通路、内吞作用等。从GO富集中,高表达的Lnc RNAs相关靶基因富集了细胞成分中的72个功能项目。2.CCK8结果显示SiO2粉尘浓度在40μg/cm2时,细胞活力下降较为明显。随SiO2粉尘浓度升高,TGF-β蛋白表达水平逐渐增加。RT-qPCR验证MRAK050699敲除效率约为50%（F=8.659,P<0.05）。共培养结束后显微镜下观察RLE-6TN细胞的形态变化,正常组的细胞呈现典型的上皮样特征,为多边形、卵圆形且紧密连接;模型组细胞呈现间质样细胞形态,表现为长梭形、纺锤形,并且细胞间隙变宽;敲减对照组与模型组类似,呈现间质细胞形态;而敲减组的细胞仅有小部分由卵圆形变为长梭形、纺锤形,细胞基本处于紧密连接状态。使用PCR及WB检测RLE-6TN细胞中TGFbr1、p-Smad3、E-cadherin、N-cadherin、α-SMA、Vimentin、Snail、ZEB1、ZEB2、COLⅠ、COLⅢ、FN的m RNA和蛋白表达水平,结果表明与正常组比较,模型组TGFbr1、p-Smad3、N-cadherin、α-SMA、Vimentin、Snail、ZEB1、ZEB2、COLⅠ、COLⅢ、FNm RNA和蛋白表达水平均升高,E-cadherin表达水平降低（P<0.05）;与敲减对照组比较,敲减组TGFbr1、p-Smad3、N-cadherin、α-SMA、Vimentin、Snail、ZEB1、ZEB2、COLⅠ、COLⅢ、FN m RNA和蛋白表达水平均降低,E-cadherin表达水平升高（P<0.05）;模型组与敲减对照组比较,各蛋白表达水平差异均无统计学意义（P>0.05）。结论长期吸入SiO2粉尘可使大鼠发生矽肺纤维化。矽肺模型大鼠的lncRNA表达谱相对于正常大鼠会发生变化,TGF-β/Smad信号通路为重要的致纤维化通路,其中Tgfbr1为该通路中最重要的靶基因。LncRNA MRAK050699可通过调控EMT过程干预矽肺纤维化。
占海兵[6]（2021）在《LncRNA MEG3介导的PI3K/AKT通路和EMT在纳米氧化镍致大鼠肺纤维化中的作用》文中指出目的:建立纳米氧化镍（NiO NPs）致大鼠肺纤维化模型和人肺腺癌上皮细胞（A549细胞）胶原沉积模型,探讨长链非编码RNA（lnc RNA）MEG3、生长转化因子-β1（TGF-β1）、磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/AKT信号通路和上皮间充质转换（EMT）在NiO NPs致肺纤维化中的作用及其分子机制。方法:1.体内实验设计:32只健康成年雄性Wistar大鼠随机分为四组,采用气管滴注法分别按0、0.015、0.06和0.24 mg/kg NiO NPs对各组大鼠进行染毒,每周两次,持续9周;最后一次染毒24 h后,摘取大鼠肺脏用于后续试验。2.体外实验设计:（1）采用不同浓度的NiO NPs混悬液（0、25、50和100μg/m L）处理A549细胞24 h。（2）分别用10μM的TGF-βI型受体（TGF-βRI）抑制剂SB431542或10μM的PI3K抑制剂LY294002预处理A549细胞1 h后,再用100μg/m L NiO NPs混悬液联合SB431542（10μM）或LY294002（10μM）处理A549细胞24 h。（3）用100μg/m L NiO NPs分别处理正常A549细胞和MEG3过表达的A549细胞（LV-MEG3 A549细胞）24 h。经过上述不同处理后,收获细胞进行后续试验。3.指标检测:（1）采用苏木精-伊红（HE）染色组织切片观察大鼠肺组织病理学改变;用苦味酸-天狼星红染色组织切片检测胶原蛋白水平,用生化比色法检测大鼠肺组织羟脯氨酸含量,评估大鼠肺组织胶原沉积情况。（2）实时荧光定量PCR（RT-q PCR）技术检测lncRNA MEG3的相对表达水平。（3）免疫印迹法（Western blot）检测I型胶原纤维（Col-I）、TGF-β1、波形蛋白（Vimentin）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、纤维黏连蛋白（Fibronectin）和E-钙黏素（E-cadherin）的相对表达水平,以及PI3K、AKT、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（m TOR）的总蛋白及其磷酸化（p-PI3K、p-AKT和p-m TOR）水平。（4）细胞免疫荧光染色技术检测Col-I、Vimentin、α-SMA、Fibronectin和E-cadherin的蛋白含量并行定位分析。结果:1.体内实验:（1）HE染色结果显示,NiO NPs染毒组大鼠肺组织肺泡间隔增宽,肺泡壁增厚。苦味酸-天狼星红染色显示,0.06和0.24 mg/kg NiO NPs染毒组大鼠肺组织胶原过量沉积,主要以Col-I为主。与对照组比较,0.06和0.24mg/kg NiO NPs染毒组大鼠肺组织中羟脯氨酸含量和Col-I的蛋白表达水平均明显升高（P<0.05）。（2）与对照组比较,0.06和0.24 mg/kg NiO NPs染毒组大鼠肺组织中TGF-β1、p-PI3K、p-AKT、p-m TOR、Vimentin、α-SMA和Fibronectin的蛋白表达水平均升高（P<0.05）,而E-cadherin的蛋白表达水平降低（P<0.05）。（3）与对照组比较,NiO NPs染毒组大鼠肺组织中lncRNA MEG3的表达水平随NiO NPs剂量的增加而降低（P<0.05）。2.体外实验:（1）与对照组比较,100μg/m L NiO NPs处理组A549细胞中TGF-β1、p-PI3K、p-AKT、p-m TOR、Vimentin、α-SMA和Fibronectin的蛋白表达水平均升高（P<0.05）,而E-cadherin的蛋白表达水平降低（P<0.05）。（2）与对照组比较,50和100μg/m L NiO NPs处理组A549细胞中lncRNA MEG3的表达水平降低（P<0.05）。（3）与100μg/m L NiO NPs组比较,NiO NPs+SB431542组A549细胞中Col-I、p-PI3K、p-AKT、p-m TOR、Vimentin、α-SMA和Fibronectin的蛋白表达水平均降低（P<0.05）,而E-cadherin的蛋白表达水平升高（P<0.05）。细胞免疫荧光染色显示,NiO NPs可引起A549细胞中E-cadherin由膜蛋白转运至细胞质中,而Vimentin由细胞核释放至细胞表面,而这种定位变化可被SB431542部分抑制。（4）与100μg/m L NiO NPs组比较,NiO NPs+LY294002组A549细胞中Col-I、p-PI3K、p-AKT、p-m TOR、Vimentin、α-SMA和Fibronectin的蛋白表达水平均降低（P<0.05）,而E-cadherin的蛋白表达水平升高（P<0.05）。（5）与NiO NPs处理的正常A549细胞组比较,100μg/m L NiO NPs处理的LV-MEG3 A549细胞中TGF-β1、Col-I、p-PI3K、p-AKT、p-m TOR、Vimentin、α-SMA和Fibronectin的蛋白表达水平均降低（P<0.05）,而E-cadherin的蛋白表达水平升高（P<0.05）。结论:NiO NPs可诱导大鼠肺组织纤维化,其机制与NiO NPs引起肺组织lncRNA MEG3表达下调而促进TGF-β1蛋白高表达,进而激活PI3K/AKT信号通路并导致EMT发生有关。
杨珣[7]（2020）在《Smad7泛素化修饰对博来霉素致小鼠肺纤维化的影响》文中认为目的:观察博来霉素致小鼠肺纤维化病变中Smad7、泛素化Smad7、乙酰化Smad7及相关纤维化指标的表达变化,探讨Smad7泛素化修饰通过介导TGF-β1/Smads信号通路对肺纤维化的发生发展的影响及Smad7泛素化修饰与Smad7乙酰化修饰的相互关系,为寻找肺纤维化治疗靶点提供理论和实验依据。方法:选用体重1820g的雄性C57小鼠30只。按数字表法随机分为空白组、博来霉素（Bleomycin,BLM）组、BLM+MG132（泛素化蛋白酶体抑制剂）组,各组10只。BLM组、BLM+MG132组采用一次性气管滴入博来霉素（5mg/kg）构建肺纤维化模型。BLM+MG132组小鼠于造模后第1天起给予MG132（0.1mg/kg）腹腔注射,每天1次,直至第28天。于造模28天后取小鼠肺脏待后续检测。小鼠左肺下叶制作病理切片,HE染色光镜下观察肺组织形态学改变,Masson染色观察胶原含量;羟脯氨酸含量测定评价肺纤维化程度;Westernblot检测Smad7、α-SMA、Col-I的蛋白水平;q RT-PCR检测各组Smad7、Col1a1（Col-I）、TGF-β1、α-SMA的m RNA表达变化;免疫沉淀（IP）Smad7蛋白,免疫印迹（IB）检测各组小鼠肺组织中Smad7泛素化水平、乙酰化水平。结果:1、在予博来霉素造模28天后,C57小鼠肺组织HE染色镜下显示可见肺泡腔狭窄、塌陷,肺泡间隔增厚,肺泡、气管周围血管见较多中性粒细胞、巨噬细胞浸润,肺组织正常结构已遭到破坏;Masson染色镜下可见大片染成蓝紫色胶原纤维分布在肺间质、肺泡间隔;BLM组小鼠肺组织羟脯氨酸较空白组含量增多;以上结果表明C57小鼠气管滴注博来霉素28天后肺纤维化模型构建成功。予MG132（BLM+MG132组小鼠）干预后,HE染色镜下见肺泡腔狭窄、肺泡间隔增厚、炎症细胞浸润等程度较BLM组减轻;Masson染色镜下见蓝紫色胶原纤维减少;同时肺组织羟脯氨酸的含量减少,提示肺纤维化程度减轻。2、予BLM处理后,与空白组小鼠比较,小鼠肺组织α-SMA、Col-I蛋白表达增多,Smad7蛋白表达减少,差异具有统计学意义（p<0.05）;Col1a1、α-SMA、TGF-β1、Smad7 m RNA表达上调,差异具有统计学意义（p<0.05）;Smad7泛素化水平增高、乙酰化水平下降。3、予MG132干预后,与BLM组小鼠比较,小鼠肺组织α-SMA、Col-I蛋白水平下降,Smad7蛋白水平上升,差异具有统计学意义（p<0.05）;Col1a1、α-SMA、TGF-β1、Smad7 m RNA表达下调差异具有统计学意义（p<0.05）;Smad7泛素化水平下降、乙酰化水平增高。结论:1博来霉素致小鼠肺纤维化中Smad7的蛋白表达减少,TGF-β1/Smads信号通路过度激活,促进了肺纤维化的发生发展。2 MG132能够抑制Smad7的泛素化水平,上升Smad7的乙酰化水平,上调Smad7的蛋白水平,增强Smad7对TGF-β1/Smads信号通路负向调控作用,减轻肺纤维化病变。Smad7的泛素化修饰与乙酰化修饰可能存在竞争关系。
田丽[8]（2020）在《基于血管新生机制探讨miR-126对肺纤维化大鼠VEGF调控及加味补阳还五汤的干预作用》文中研究表明目的:肺纤维化是许多不同病因肺间质性疾病的常见结局,其典型特征是细胞外基质蛋白过度沉积、血管生成和重构、肺实质不可逆瘢痕形成,导致气体交换减少和肺功能受损。本研究旨在观察博来霉素诱导的大鼠肺纤维化病程中血管新生情况,探讨加味补阳还五汤通过miR-126和VEGF在体内和体外对肺纤维化大鼠的保护作用及其机制,拟为肺纤维化的治疗提供新思路新方法。方法:1.体内实验:健康雄性清洁级SD大鼠,年龄7周,体重180±20g。随机分为对照组,模型组,强的松组,补阳还五汤组和加味补阳还五汤组。利用博来霉素气管滴入法建立肺纤维化模型。造模后24小时,对照组给予生理盐水灌胃,强的松组给予强的松混悬液（4.2mg/kg?d）灌胃,补阳还五汤组给予补阳还五汤液（4.9g/kg?d）灌胃,加味补阳还五汤组予加味补阳还五汤液（7.3g/kg?d）灌胃。各组动物均在14天、28天随机分批处死,取大鼠肺组织,HE染色观察肺组织病理变化,Masson染色观察肺组织中胶原含量、分布和形态学变化,免疫组化Ⅷ因子染色标记肺血管,显微镜下计算微血管数目,测定微血管密度（MVD）,RT-PCR法检测肺组织中miR-126及VEGF m RNA的水平,Western blot法及免疫组化法检测肺组织VEGF蛋白表达,免疫组化法比较各组肺组织中HIF-lα蛋白表达情况。2.体外实验一:在TGF-β1刺激的MRC-5中转染miR-126模拟物或抑制剂及其阴性对照物,探究miR-126与VEGF的关系。MRC-5随机分为6组:对照组,模型组,miR-126 mimics组,miR-126 mimics NC组,miR-126 inhibitor组,miR-126 inhibitor NC组。48h后收集细胞,采用MTT法检测细胞增殖。对照组、模型组应用RT-PCR法检测α-SMA和fibronectin基因表达,验证造模效果。6组均用RT-PCR法检测miR-126、VEGF m RNA水平,Western blot法比较各组VEGF、collagen I、collagen III蛋白水平,免疫荧光法观察collagen I、collagen III表达。二:探究加味补阳还五汤含药血清对TGF-β1诱导的MRC-5 miR-126、HIF-lαm RNA及VEGF的影响。MRC-5随机分为4组:对照组,模型组,正常血清组,加味补阳还五汤含药血清组。RT-PCR法检测MRC-5中miR-126、HIF-lαm RNA及VEGF m RNA的水平,Western blot法比较各组中VEGF和collagen I表达情况。结果:1.体内实验:（1）HE及Masson染色结果显示,加味补阳还五汤可以显着减轻纤维化大鼠肺组织炎症及纤维化改变,且疗效优于补阳还五汤;（2）Ⅷ因子染色结果显示,博来霉素诱导大鼠肺纤维化病程中存在病理性血管新生亢进,微血管密度增加;加味补阳还五汤可以显着抑制纤维化大鼠肺组织病理性血管新生;（3）加味补阳还五汤可以降低纤维化大鼠肺组织中miR-126、VEGF及HIF-1α蛋白的表达。2.体外实验:（1）纤维化细胞模型中,miR-126、VEGF m RNA及蛋白表达显着增加;（2）miR-126 mimics可升高miR-126、VEGF m RNA及蛋白表达水平,并促进胶原蛋白合成;miR-126 inhibitor可抑制miR-126、VEGF m RNA及蛋白表达,并降低胶原蛋白合成;（3）加味补阳还五汤含药血清可降低TGF-β1所致MRC-5胶原蛋白I合成;（4）加味补阳还五汤含药血清可降低TGF-β1所致MRC-5中miR-126、HIF-1αm RNA、VEGF m RNA及蛋白表达。结论:加味补阳还五汤对博来霉素所致肺纤维化大鼠具有明显的保护作用,且疗效优于补阳还五汤,其作用机制可能与抑制miR-126/VEGF表达从而抑制肺组织中病理性血管新生相关。
贾新华[9]（2020）在《基于Notch信号通路探讨贝母组分干预TGF-β1诱导MRC-5氧化损伤的作用机制》文中认为目的:肺纤维化（pulmonary fibrosis,PF）是一种慢性弥漫性肺间质性疾病,其特征是基底膜和间质组织中细胞外基质蛋白的大量沉积,以及损伤的上皮细胞和肌成纤维细胞的增殖。肺纤维化患者临床表现为进行性呼吸困难,限制性通气功能障碍以及低氧血症等,最终会导致患者出现难以治愈的呼吸困难,患者大多死于呼吸衰竭。Notch信号通路是一种高度保守的信号传导通路,对细胞的增殖、分化、凋亡等过程起到调控作用,同时也是多种组织和器官早期发育必需的细胞间调节信号。近年来,越来越多的研究发现Notch信号通路与肺纤维化密切相关。本研究是在国家自然科学基金“化痰类中药多途径调节肺间质纤维化抗氧化机制的研究（编号:81273704）”的实验结果基础上,通过使用TGF-β1对MRC-5细胞进行造模,给予不同贝母组分（贝母甲素、贝母乙素、贝母辛和西贝母碱）进行干预,观察不同贝母组分对造模后MRC-5细胞氧化损伤的保护作用;同时使用DAPT阻断干预Notch信号通路,观察贝母组分保护MRC-5细胞以抗氧化损伤的具体作用机制。方法:1.MRC-5氧化损伤模型的构建及贝母组分最大无毒浓度的选择。通过5ng/ml的TGF-β1对MRC-5细胞的不同作用时间,MTT法检测细胞增殖抑制率,Real-time PCR、Western Blotting法检测不同作用时间的TGF-β1对MRC-5细胞内collagenⅠ、collagenⅢ的表达,ELISA法检测细胞内8-OHdG蛋白浓度的表达,选取TGF-β1造模的最佳作用时间。贝母组分对MRC-5的最佳无毒浓度,选取IC10为最佳无毒浓度,以备后续实验进行。2.观察贝母组分对TGF-β1诱导的MRC-5细胞氧化损伤模型的保护作用。分为空白组、模型组（TGF-β1组）、贝母甲素组（贝母甲素+TGF-β1）、贝母乙素组（贝母乙素+TGF-β1）、贝母辛组（贝母辛+TGF-β1）和西贝母碱组（西贝母碱+TGF-β1）,共6组。通过RT-PCR法检测并比较各组细胞中collagenⅠ、collagenⅢmRNA的表达;Western Blotting法检测并比较各组细胞中collagenⅠ、collagenⅢ、α-SMA蛋白的表达;免疫荧光观察各组细胞中α-SMA的阳性肌成纤维细胞的数量及荧光表达强度。并筛选对MRC-5细胞保护能力较好、抗纤维化能力较强的贝母组分,进行后续具体抗纤维化及抗氧化损伤机制的探寻。3.贝母乙素通过调控TGF-β1/Notch1信号通路介导的氧化损伤改善肺纤维化的机制。分为空白组、模型组（TGF-β1组）、贝母乙素组（贝母乙素+TGF-β1）、TGF-β1+DAPT组和贝母乙素组+DAPT,共5组。通过Western Blotting、RT-PCR法检测各组collagenⅠ、Ⅲ,Notch1-4、Jag1-2,Hes1和DLL1、3、4的蛋白及mRNA的表达并进行组内比较;ELISA法检测各组8-OHdG的表达水平;生化检测并比较各组SOD、GSH的表达;慢病毒转染Notch1目的基因至MRC-5细胞,检测贝母乙素用药后collagenⅠ、collagenⅢ、α-SMA和Notch1的蛋白表达。结果:1.MRC-5氧化损伤模型的构建及贝母组分最大无毒浓度的选择。1.1选定以5ng/ml TGF-β1预刺激MRC-5 48小时进行氧化损伤造模的构建。1.2 TGF-β1不仅可以诱导MRC-5细胞产生氧化损伤,同时也使其产生纤维化损害。1.3选定以贝母甲素3.125μg/ml、贝母乙素6.25μg/ml、贝母辛6.25μg/ml及西贝母碱6.25μg/ml作为该实验药物的最大无毒浓度,以备后续实验进行。2.观察贝母组分对TGF-β1诱导的MRC-5细胞氧化损伤模型的保护作用。2.1贝母甲素、贝母乙素、贝母辛和西贝母碱均可对TGF-β1所诱导的MRC-5细胞起到不同程度的保护作用,其中贝母乙素、贝母辛相对于其他的贝母组分而言,降低collagenⅠ、collagenⅢ、α-SMA纤维化因子的mRNA和蛋白表达量更明显,说明这两种贝母组分对TGF-β1所诱导的MRC-5细胞抗纤维化作用更强。2.2贝母乙素组相较贝母辛组的α-SMA阳性肌成纤维细胞数量及荧光表达改善更为明显,说明贝母乙素对MRC-5细胞的保护作用更强,抗纤维化作用更明显,故选择贝母乙素作为后续实验药物。3.贝母乙素通过调控TGF-β1/Notch1介导的氧化损伤改善纤维化的机制研究3.1贝母乙素组+DAPT与TGF-β1+DAPT组之间Notch1、Jag1、Hes1的mRNA和蛋白表达无明显差异性,说明贝母乙素可能通过抑制Notch1、Jag1、Hes1的表达,降低信号通路下游因子的释放,起到保护细胞,减轻纤维化损害的作用;而在Notch2-4、Jag2、DLL1、DLL3及DLL4中无表达或表达无意义。3.2贝母乙素可显着改善GSH和SOD的表达,减少8-OHdG的表达具有抗氧化作用;且DAPT+TGF-β1组可见GSH、SOD表达的上调,与贝母乙素组相比无明显差异性,说明贝母乙素可能通过阻断Notch信号通路起到抗氧化作用;同时贝母乙素组与DAPT+TGF-β1组相比,其collagenⅠ、collagenⅢ的蛋白和mRNA表达无明显差异,且较TGF-β1组明显减少,说明贝母乙素可能通过Notch信号通路抗氧化以减轻纤维化损害。3.3转染Notch1病毒的MRC-5细胞内collagenⅠ、collagenⅢ、α-SMA、Notch1的蛋白表达明显上升,贝母乙素组MRC-5细胞内collagenⅠ、collagenⅢ、α-SMA、Notch1的蛋白表达明显降低,说明贝母乙素可以抑制Notch信号通路,降低通路下游产物表达,进而可以起到保护细胞,减缓FB向MFB的转化过程,对纤维化具有治疗作用。结论:1.TGF-β1可诱导MRC-5细胞产生氧化损伤,导致其纤维化产生。2.给予最大无毒浓度的贝母组分均可使TGF-β1诱导的MRC-5细胞内降低纤维化因子的表达,说明安全浓度下的贝母组分可对氧化损伤的MRC-5细胞起到保护作用,减少纤维化损害。3.贝母乙素可通过上调SOD、GSH的表达而发挥抗氧化、减少纤维化因子的产生的作用,其机制可能与Notch1/Jag1/Hes1信号通路有关。4.贝母乙素可以通过抑制Notch信号通路,降低通路下游产物表达,进而起到保护细胞,减少氧化损伤,减缓FB向MFB的转化过程,对纤维化具有治疗作用。
冯菲菲[10]（2020）在《丹参酮IIA对矽肺肺损伤及纤维化的保护作用及机制研究》文中研究说明研究背景目前,职业性尘肺病依然是我国最为严重的职业病,而矽肺是尘肺中最常见的类型。矽肺由长久暴露于含大量游离二氧化硅的粉尘所引起,以肺脏弥漫性结节性纤维化为特征,并呈进行性发展,最终严重损害肺功能,导致呼吸衰竭甚至死亡。近年来,由于工业化进程的发展,矽肺的发病率和流行率一直在上升,特别是在发展中国家。中国拥有最大的矽肺患者人群,每年全国因矽肺病导致的直接经济损失达80多亿,间接损失难以计数。在发达国家,矽肺同样也是一个备受瞩目的职业健康问题。但矽肺的发病机制目前尚不明确,且缺乏有效的治疗措施,因此,研究和探索矽肺的发病机制及新的防治方法十分必要。矽肺的发病与进展是一个多因素的复杂过程,其中包括二氧化硅引起的持续性肺部炎症和细胞外基质（extracellular matrix,ECM）的过度沉积,最终导致正常肺组织结构的不可逆性破坏和肺纤维化。既往研究已经发现了许多矽肺的重要致病机制,其中氧化应激是调节多种生物过程和信号转导途径的重要分子机制。当机体吸入二氧化硅颗粒时,它们被肺泡巨噬细胞吞噬并持续存在,通过活性氧（reactive oxygen species,ROS）和活性氮的形成引起氧化应激反应。氧化应激可导致上皮细胞表型异常,包括激发细胞因子产生、促进上皮间充质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）和诱导上皮细胞凋亡,导致成纤维细胞的增殖和ECM在肺组织中的过度沉积,并进一步诱导细胞毒性、氧化应激和肺部炎症,最终导致矽肺的发生。在此过程中,许多细胞因子成分参与了对肺纤维化的正向或负向的调节,其中转化生长因子β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）是强有力的致纤维化的关键细胞因子。TGF-β1主要通过经典的TGF-β1/Smad信号途径对纤维化疾病中的细胞增殖、分化、迁移、免疫调节及ECM转变过程具有重要的调控功能。大量研究表明TGF-β1/Smad信号通路的失调是组织纤维化的重要致病机制,其作为一种有效的抗纤维化治疗靶点受到了越来越多的关注,因此,抑制TGF-β1/Smad信号通路可能是缓解矽肺肺纤维化的一种治疗策略。为了保持适当的氧化还原平衡,我们的机体形成了一套复杂的氧化应激应答系统,包括一系列内源性抗氧化酶。肺损伤可同时导致TGF-β1和氧化应激水平的升高。越来越多的证据表明,ROS和氧化应激的产生与许多细胞因子和促纤维化生长因子的产生和激活有关。TGF-β1/Smad信号通路的激活是纤维化形成的主要驱动力,而氧化应激是与TGF-β1的促纤维化活性有关的重要有害促进因素。在整个纤维化过程中,TGF-β1与氧化应激信号之间有明显的相关性。TGF-β1可提高肺组织的ROS水平,ROS反过来刺激TGF-β1相关的成纤维细胞活化和肌成纤维细胞分化。研究发现与TGF-β1相关的纤维化事件与活性氧清除酶的降低和/或ROS产生酶的诱导生成增加有关。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH）氧化酶（NADPH oxidases,NOX）是内源性ROS产生的主要来源。其中NOX4具有独特的组成活性,作为细胞外ROS产生的主要酶源,NOX4衍生的ROS已被公认为氧化应激的主要来源。NOX4作为TGF-β1诱导的促纤维化反应的下游介质,诱导ROS的形成,并通过调节TGF-β1诱导的成纤维细胞活化、肌成纤维细胞分化参与了纤维化的发病机制。研究表明NOX4在纤维化疾病中上调,对肝、肾、肺和心脏纤维化的发病机制有重要贡献。NOX4被认为是肺纤维化与TGF-β1信号传导增强相关的潜在治疗靶点。核因子-红系 2 相关因子-2（nuclear factor erythroid 2-related factor-2,Nrf2）是一个重要的氧化还原敏感转录因子,参与宿主防御氧化应激。Nrf2在静止时与其抑制剂胞浆蛋白Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1（Kelch-like ECH-associated protein-1,Keap1）结合,在组织损伤介导的ROS或亲电刺激下从Keap1释放,进入细胞核,激活抗氧化反应原件（antioxidantresponse element,ARE）,诱导下游抗氧化剂和解毒酶的表达,包括血红素加氧酶-1（Hemeoxygenase-1,HO-1）和NADPH 醌氧化还原酶（NADPH quinone oxidoreductase,NQO-1）等,是维持细胞氧化还原稳态的必需因素。研究证明Nrf2参与了纤维化形成的动态过程,并似乎是组织纤维化的负调节因子。Nrf2不仅平衡氧化应激,而且对TGF-β1介导的纤维化促进信号转导有负调节作用。研究证明Nrf2似乎可发挥细胞自主抗纤维化的作用。在持续性的器官纤维化中,Nrf2激活受损,从而改变了 NOX4-Nrf2氧化还原平衡和导致肌成纤维细胞获得抗凋亡表型。Nrf2作为多种抗氧化、抗炎和抗纤维化通路的主调节器的证据使其具有作为治疗目标的潜在价值,Nrf2信号的激活可减轻肺损伤和肺纤维化的进展,提示靶向Nrf2/ARE信号通路的策略具有抗矽肺肺纤维化的潜能。天然产物在药物的研发中起着非常重要的作用。丹参酮ⅡA（Tanshinone ⅡA,Tan ⅡA）是中药丹参中最重要的有效活性成分,具有良好的生物利用度和多种药理效用,其在多种器官中被报道具有抗炎、抗氧化、抗纤维化等特性。然而,对丹参酮ⅡA治疗矽肺的疗效研究甚少,丹参酮ⅡA是否具有对矽肺的治疗作用,以及其分子作用机制仍然未知。它是否可以有效缓解矽肺的肺损伤及肺纤维化呢?研究目的1.研究丹参酮ⅡA腹腔注射对矽肺大鼠模型的治疗作用,从肺组织病理学、气道炎症细胞募集、肺组织炎症因子含量等方面观察丹参酮ⅡA对矽肺的保护和治疗作用。2.体内实验研究丹参酮ⅡA是否可抑制矽肺大鼠的TGF-β1/Smad信号通路;体外实验研究丹参酮ⅡA是否可抑制二氧化硅诱导的A549及HBE细胞的上皮间充质转化（EMT）及TGF-β1/Smad信号通路的激活,从而减轻二氧化硅诱导的肺纤维化。3.体内及体外实验探讨丹参酮ⅡA是否能减轻二氧化硅导致的氧化应激,并通过抑制NOX4表达、激活Nrf2/ARE抗氧化应激信号通路来发挥对二氧化硅诱导的肺损伤及纤维化的保护作用。实验方法1.体内实验1.1动物造模及给药处理1)48只SD大鼠（年龄6～8周,体重200±20g）随机分为四组（每组12只）:ⅰ)对照组;ⅱ)丹参酮ⅡA组;ⅲ)矽肺组;ⅳ)矽肺+丹参酮ⅢA组。气管插管法建立矽肺大鼠模型:SD大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉后,矽肺组及矽肺+丹参酮ⅡA组大鼠气管内置入硬膜外麻醉导管,然后将1 ml二氧化硅粉尘悬浮液（50mg/ml）及0.25ml空气灌入气管。之后,立即旋转大鼠,使注射液均匀地分布在肺部。对照组及丹参酮ⅡA组气管插管法灌入等量生理盐水及空气。2)造模2天后,给予丹参酮ⅡA组和矽肺+丹参酮ⅡA组大鼠每日腹腔注射25 mg/kg体重的丹参酮ⅡA共40天,对照组和矽肺组大鼠同时每日腹腔注射等量无菌生理盐水。造模42天后,4组大鼠均收集支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid,BALF）,后麻醉处死获取肺组织。1.2观察丹参酮ⅡA对矽肺大鼠的治疗作用1)测量各组大鼠肺组织的湿/干重比。2)取各组大鼠肺组织石蜡包埋切片行H&E染色和Masson染色。3)免疫组织化学染色及RT-PCR法检测各组大鼠肺组织中Ⅰ型胶原（CollagenⅠ）、纤维连接蛋白1（FN1）及α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达水平。4)Giemsa染色法计数各组大鼠BALF中的总细胞数及中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞的数量。5)ELISA试剂盒测定各组大鼠肺组织中肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白介素6（IL-6）和白介素1β（IL-1β）的含量。1.3检测各组大鼠肺组织内氧化应激水平采用活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）检测试剂盒检测各组大鼠肺组织内氧化应激水平。1.4 TGF-β1/Smad信号通路关键因子测定1)采用定量RT-PCR法检测各组大鼠肺组织中Tgfb1及其下游Smad2、Smad3和Smad7的mRNA表达水平;2)采用 Western Blot 法检测肺组织中 TGF-β1、p-Smad2/3、Smad2/3、p-Smad3、Smad3及Smad7的蛋白表达水平。1.5 NOX4及Nrf2/ARE信号通路关键因子的测定1)采用定量RT-PCR法检测各组大鼠肺组织中Nox4、Nrf2、Keap1及其下游Ho1、Nqo1的mRNA表达水平;2)采用Western Blot法定量检测各组大鼠肺组织中NOX4、细胞质Nrf2、细胞核Nrf2、Keap1及其下游HO-1、NQO-1的蛋白表达水平。2.体外实验2.1二氧化硅（Si02）及丹参酮ⅡA处理浓度筛选体外培养A549及HBE细胞,接种于96孔板,应用CCK-8试剂盒测定不同浓度二氧化硅及丹参酮ⅡA对A549和HBE细胞活力的影响。将细胞分别用不同浓度的 Si02（0、25、50、100、200、400、800μg/ml）或丹参酮 ⅡA（0、2.5、5、10、20、40、80μM）处理24h。CCK-8试剂盒检测细胞活性。筛选适当的Si02及丹参酮ⅡA处理浓度用于后续实验。2.2细胞分组及处理体外培养A549及HBE细胞,更换无血清培养基后,将A549细胞和HBE细胞分为以下几组:1)空白对照组;2)Si02组:单独Si02（100 μg/ml）处理细胞24 h;3)Si02+丹参酮ⅡA组:Si02（100μg/ml）联合不同剂量的丹参酮ⅡA（5、10 或 20μM）处理细胞 24 h。2.3 EMT标志物及TGF-β1/Smad信号通路关键因子测定1)采用 Western Blot 法检测各组细胞中 E-cadherin、Vimentin、FN1、CollagenⅠ和α-SMA的蛋白表达水平。2)采用 Western Blot 法检测各组细胞中 TGF-β1、p-Smad3、Smad3 及 Smad7 的蛋白表达水平。3)采用细胞免疫荧光法检测各组细胞中TGF-β1的表达水平。2.4检测各组细胞中的ROS水平应用ROS检测试剂盒检测各组细胞中的ROS水平。2.5 NOX4及Nrf2/ARE信号通路关键因子的测定1)采用 Western Blot 法检测各组细胞中 NOX4、Nrf2、Keap1、HO-1 及 NQO-1的蛋白表达水平。2)采用细胞免疫荧光法检测各组细胞中Nrf2的表达水平。3.统计学分析应用IBM SPSS Statistics 19.0统计学软件进行数据处理,计量资料若符合正态分布以平均值±标准差（Mean±SD）表示,组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）或Kruskal-Wallis非参数检验,组间两两比较采用LSD法或Dunn-Bonferroni法。P<0.05为差异有统计学意义。实验结果1.丹参酮ⅡA对矽肺大鼠的治疗作用1.1丹参酮ⅡA可缓解矽肺大鼠的肺损伤及纤维化矽肺组大鼠的肺湿/干重比较对照组显着增加,经丹参酮ⅡA治疗后显着下降。对各组大鼠肺组织进行组织病理染色,H&E染色显示矽肺组大鼠肺组织失去正常肺泡结构,肺泡壁增厚,伴有大量炎性细胞浸润,并在支气管树和血管床周围形成特征性的矽肺结节,表现为弥漫性肺纤维化,而经丹参酮ⅡA治疗后这些破坏作用得到缓解。Masson染色结果提示丹参酮ⅡA治疗能显着降低矽肺大鼠肺组织中的胶原沉积。免疫组织化学染色及RT-PCR检测显示丹参酮ⅡA治疗能显着降低矽肺大鼠肺组织中的Collagen Ⅰ、FN1及α-SMA的表达水平。以上结果表明丹参酮ⅡA治疗可减轻矽肺大鼠的肺损伤及纤维化。1.2丹参酮ⅡA可降低矽肺大鼠的炎症水平与对照组相比,矽肺组大鼠肺泡灌洗液中的总细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞数量均显着增加,而经丹参酮ⅡA治疗后显着减少;矽肺组大鼠肺组织中炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β的水平较对照组显着增加,而经丹参酮ⅡA治疗后显着下降。2.丹参酮ⅡA可抑制二氧化硅诱导的EMT及TGF-β1/Smad信号通路的激活2.1丹参酮ⅡA可抑制矽肺大鼠TGF-β1/Smad信号通路的激活通过RT-PCR和Western Blot分析,我们测定了 TGF-β1及其下游信号通路Smad2、Smad3和Smad7的活性。结果显示,矽肺大鼠肺组织的TGF-β1的mRNA和蛋白表达水平均显着升高,而经丹参酮ⅡA治疗后显着下降;矽肺大鼠肺组织的Smad2和Smad3的mRNA和蛋白水平均无显着改变,而p-Smad3和p-Smad2/3的蛋白表达水平显着升高,而经丹参酮ⅡA治疗后显着下降;作为TGF-β1/Smad通路的负调控因子,Smad7的mRNA和蛋白表达水平在矽肺大鼠肺组织中显着下调,而经丹参酮ⅡA治疗后显着上调。上述结果表明丹参酮ⅡA对TGF-β1/Smad信号通路的抑制作用与其对矽肺肺纤维化的保护作用有关。2.2丹参酮ⅡA抑制二氧化硅诱导的A549和HBE细胞的上皮间质转化（EMT）及TGF-β1/Smad信号通路的激活2.2.1丹参酮ⅡA可抑制二氧化硅诱导的A549及HBE细胞的EMT我们用Western Blot检测丹参酮ⅡA对二氧化硅（Si02）诱导的A549和HBE细胞的EMT的抑制作用。结果显示:用Si02（100μg/ml）处理A549和HBE细胞24 h后,其上皮标志物E-cadherin表达下调,间充质标志物Vimentin、FN1、Collagen Ⅰ和α-SMA的表达均上调。而丹参酮ⅡA共处理可上调两种细胞中E-cadherin的表达,下调Vimentin、FN1、CollagenⅠ和α-SMA的表达,并呈剂量依赖性。这些结果表明丹参酮ⅡA可抑制二氧化硅诱导的A549和HBE细胞的EMT。2.2.2丹参酮ⅡA可抑制二氧化硅诱导的A549及HBE细胞的TGF-β1/Smad信号通路的激活我们用Western Blot检测丹参酮ⅡA对二氧化硅（Si02）诱导的A549和HBE细胞的TGF-β1/Smad信号通路激活的抑制作用。结果显示:Si02（100 μg/ml）处理24 h后,A549和HBE细胞的TGF-β1及其下游p-Smad3表达显着上调,同时Smad7表达显着下调,而Smad3表达无显着变化,表明SiO2刺激对A549和HBE细胞中TGF-β1/Smad信号通路具有激活作用。而丹参酮ⅡA共处理可显着下调TGF-β1和p-Smad3的表达,上调Smad7的表达,并呈剂量依赖性。细胞免疫荧光分析也证实了丹参酮ⅡA对Si02诱导的A549和HBE细胞中TGF-β1表达的抑制作用。以上结果表明,丹参酮ⅡA在体外部分通过抑制TGF-β1/Smad信号通路的激活抑制二氧化硅诱导的肺纤维化。3.丹参酮ⅡA可减轻二氧化硅诱导的氧化应激,抑制NOX4的表达并激活Nrf2/ARE信号通路3.1丹参酮ⅡA可减轻矽肺大鼠的氧化应激,抑制NOX4的表达并激活Nrf2/ARE信号通路我们采用活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）检测试剂盒检测各组大鼠肺组织内氧化应激水平,结果可见矽肺组大鼠的ROS和MDA含量升高,伴随着SOD和GSH-Px活性的下降,而矽肺+丹参酮ⅡA治疗组大鼠的ROS和MDA含量相对于矽肺组大鼠下降,SOD和GSH-Px活性上升。以上结果表明丹参酮ⅡA具有减轻矽肺大鼠氧化应激的作用。我们通过RT-PCR和Western Blot检测丹参酮ⅡA是否可抑制NOX4的表达,并激活矽肺大鼠的Nrf2/ARE信号通路,从而对矽肺大鼠的氧化应激损伤起保护作用。结果显示矽肺组大鼠肺组织中NOX4的mRNA及蛋白表达水平显着升高,经丹参酮ⅡA治疗后其mRNA及蛋白表达水平均显着下降。矽肺组Nrf2及其下游HO-1和NQO-1的mRNA水平显着升高,经丹参酮ⅡA治疗后进一步上调。由于Nrf2核移位是Nrf2活化的必要步骤,因此我们分别评估了 Nrf2在细胞核内和细胞质中的表达,结果显示:矽肺组细胞核Nrf2蛋白表达上调,而胞质Nrf2蛋白表达降低,经丹参酮ⅡA治疗后这些作用进一步增强。与Nrf2一致,其下游蛋白HO-1和NQO-1的蛋白表达水平在矽肺组也显着上调,而丹参酮ⅡA治疗后这两种蛋白的表达水平进一步上调。与Nrf2相反,其抑制剂Keap1的mRNA和蛋白表达水平在矽肺组下调,而丹参酮ⅡA治疗进一步下调了 Keap1的表达。以上结果表明,丹参酮ⅡA部分通过抑制NOX4的表达并激活Nrf2/ARE信号通路,来对矽肺的氧化应激损伤起保护作用。3.2丹参酮ⅡA减轻二氧化硅诱导的A549和HBE细胞的氧化应激,抑制NOX4的表达并激活Nrf2/ARE信号通路我们采用活性氧（ROS）检测试剂盒检测丹参酮ⅡA对二氧化硅（Si02）诱导的A549和HBE细胞的氧化应激的抑制作用。用SiO2（100μg/ml）处理A549和HBE细胞24 h后,采用DCFH-DA检测ROS显示,A549细胞和HBE细胞的绿色荧光强度显着增强,而与丹参酮ⅡA共处理组绿色荧光强度显着下降。为了进一步阐明丹参酮ⅡA的抗氧化机制,我们用Western Blot检测了 A549和HBE细胞中NOX4的表达及Nrf2/ARE信号通路的活性。结果显示,Si02刺激导致细胞中NOX4蛋白表达增加,而丹参酮ⅡA共处理抑制了 NOX4蛋白的表达。Si02刺激导致细胞中Nrf2蛋白表达增加,而丹参酮ⅡA共处理进一步增加了 Nrf2蛋白的表达。细胞免疫荧光分析显示丹参酮ⅡA可增加Nrf2的表达并促进其在A549和HBE细胞中的核内聚集。相应的,SiO2刺激导致Nrf2下游HO-1和NQO-1的蛋白表达水平上调,丹参酮ⅡA共处理可进一步上调其表达。与Nrf2相反,其抑制剂Keap1的蛋白表达水平在SiO2组下调,而丹参酮ⅡA共处理进一步下调其表达。这些数据表明,丹参酮ⅡA在体外部分通过抑制NOX4的表达并激活Nrf2/ARE信号通路来减轻二氧化硅诱导的氧化应激。结论1.丹参酮ⅡA可有效缓解矽肺大鼠的肺组织结构破坏及纤维化,并减轻矽肺大鼠的肺部炎症反应。2.丹参酮ⅡA可抑制二氧化硅诱导的上皮间充质转化（EMT）及TGF-β1/Smad致纤维化信号通路的激活。3.丹参酮ⅡA可通过抑制NOX4的表达、激活Nrf2/ARE信号通路来减轻二氧化硅诱导的氧化应激,从而发挥对矽肺的保护作用。意义在本研究中,我们应用矽肺大鼠模型和体外细胞实验,明确了中药单体丹参酮ⅡA对矽肺的抗炎、抗氧化及抗纤维化的保护作用,并进一步探讨了其分子效用机制,证明了丹参酮ⅡA可通过抑制二氧化硅诱导的上皮间充质转化（EMT）及TGF-β1/Smad信号通路的激活来减轻矽肺肺纤维化,并通过抑制NOX4的表达并激活Nrf2/ARE信号通路来减轻二氧化硅诱导的氧化应激,从而发挥对矽肺肺损伤及纤维化的保护和治疗作用。本研究表明丹参酮ⅡA可作为矽肺治疗的潜在药物,为矽肺防治提供了理论支持,并为新药的研发提供了理论基础。
二、纤维连接蛋白在大鼠肺纤维化中的作用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、纤维连接蛋白在大鼠肺纤维化中的作用（论文提纲范文）
（1）基于“阳化气，阴成形”理论研究TGF-β1/Smads影响黄韧带肥厚的机制及模型的建立（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 黄韧带肥厚的机制及动物模型建立的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 TGF-β1/Smads信号通路与纤维化 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验一 基于“阳化气,阴成形”理论研究IL-1β、TNF-α和TGF-β1/Smads在LFH中的表达及相关性 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 标本收集 |
| 1.2 纳入与排除标准 |
| 1.3 影像学测量 |
| 1.4 主要器械、设备、试剂等 |
| 1.5 手术方式 |
| 1.6 标本的取材、运输等标准操作规程 |
| 1.7 HE染色与组织形态学观察 |
| 1.8 Masson染色与纤维化观察 |
| 1.9 免疫组化法检测两组黄初带IL-lp、TNF-α、TGF-β1/Smads (TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7)、Col1和Col3蛋白的定位、半定量表达 |
| 1.10 实时焚光聚合酶链式反应（Real-Time PCR)检测IL-1β、TNF-α、TGF-β1/Smads (TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7)、Col1、Col3&mRNA表达 |
| 1.11 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 一般资料 |
| 2.2 HE染色结果 |
| 2.3 Masson染色结果 |
| 2.4 免疫组化结果 |
| 2.5 Real-Time PCR结果 |
| 2.6 DLSS组内黄韧带厚度和各层纤维化分级的相关性分析 |
| 2.7 DLSS组内黄韧带厚度和各层弹性-胶原纤维比的相关性分析 |
| 2.8 DLSS组内黄韧带厚度和各层mRNA表达的相关性分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 炎症与纤维化是黄韧带肥厚的主要病理机制 |
| 3.2 黄韧带背侧层是退变的起点 |
| 3.3 基于“阳化气,阴成形”理论探讨黄韧带“炎症-纤维化”病理过程 |
| 3.4 基于“阳化气,阴成形”理论探讨DLSS的中医药治疗 |
| 3.5 其他 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 实验二 基于三种造模方法诱导大鼠黄韧带肥厚动物模型的建立与评价 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要器械、设备、试剂等 |
| 1.3 实验动物的分组与取材 |
| 1.4 实验动物的造模 |
| 1.5 影像学测量 |
| 1.6 HE染色与大鼠黄韧带厚度的测量 |
| 1.7 Masson染色与大鼠黄韧带纤维化观察 |
| 1.8 免疫组化法检测各组黄初带IL-1β、TNF-α、TGF-β1/Smads (TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7)、Col1、Col3蛋白的定位、半定量表达 |
| 1.9 免疫印迹法定性、半定量分析IL-1β、TNF-α、TGF-β1和Coll蛋白在各组黄韧带内表达 |
| 1.10 Real-Time PCR检测 IL-1β、TNF-α、TGF-β1/Smads (TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7)、Col1、Col3的mRNA表达 |
| 1.11 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 HE染色与大鼠黄韧带厚度的结果 |
| 2.2 Masson染色与大鼠黄韧带纤维化的结果 |
| 2.3 影像学测量结果 |
| 2.4 免疫组化结果 |
| 2.5 免疫印迹结果 |
| 2.6 Real-Time PCR结果 |
| 2.7 大鼠黄韧带与人增厚黄韧带的比较 |
| 2.8 模型成功率 |
| 3 讨论 |
| 3.1 大鼠黄韧带肥厚模型的建立方法 |
| 3.2 大鼠黄韧带肥厚的病理表现 |
| 3.3 机械应力是诱发或加速黄韧带肥厚的重要因素 |
| 3.4 基于“阳化气,阴成形”理论探讨大鼠黄韧带增厚模型的建立 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 不足与展望 |
| 创新点 |
| 致谢 |
| 附件 |
（2）CB2受体激动剂JWH133和抑制剂SR144528对卵蛋白诱导大鼠气道重塑的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英汉缩略词对照表 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 实验试剂 |
| 1.1.3 实验仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 实验动物模型的制备 |
| 1.2.2 实验动物模型标本的采集及保存 |
| 1.2.3 肺组织病理学检查 |
| 1.2.5 Elissa检测支气管肺泡灌洗中 VEGF 浓度 |
| 1.2.5.1 试剂配制 |
| 1.2.5.2 检测步骤 |
| 1.2.6 Elissa检测支气管肺泡灌洗中 MMP-2 的浓度 |
| 1.2.6.1 试剂准备 |
| 1.2.6.2 检测步骤 |
| 1.2.7 Elissa检测支气管肺泡灌洗中 MMP-9 的浓度 |
| 1.2.8 WesternBlot检测肺组织中MMP-2、MMP-9、VEGF的蛋白表达水平 |
| 1.3 统计学处理 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 大鼠肺组织HE 染色病理形态学学分析 |
| 2.2 大鼠肺组织石蜡切片 Masson 染色胶原纤维结果 |
| 2.3 Elissa检测各组大鼠BALF中 MMP-2、MMP-9、VEGF的浓度 |
| 2.4 MMP-2、MMP-9、VEGFA 在各组大鼠肺组织中的蛋白表达 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 内源性大麻素抗肺纤维化的作用研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 致谢 |
（3）矽肺纤维化靶向LncRNAs和mRNAs的筛选、验证及其调控机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略表 |
| 引言 |
| 第1章 矽肺纤维化相关的差异LncRNAs的筛选、验证及Lnc771和Lnc714对矽肺纤维化的调控机制 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 实验材料 |
| 1.1.2 动物实验 |
| 1.1.3 细胞实验 |
| 1.1.4 关键的实验技术和实验方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 矽肺模型大鼠肺组织病理形态学观察 |
| 1.2.2 α-SMA和 COLI在矽肺大鼠肺组织中的表达 |
| 1.2.3 矽肺大鼠肺组织差异LncRNA的筛选 |
| 1.2.4 矽肺大鼠肺组织差异LncRNA的生物信息学分析 |
| 1.2.5 矽肺相关差异LncRNA在矽肺大鼠模型中的验证分析 |
| 1.2.6 候选差异LncRNA在单核巨噬细胞RAW264.7 中的验证分析 |
| 1.2.7 候选差异LncRNA在肺泡II型上皮细胞MLE-12 中的验证分析 |
| 1.2.8 候选差异LncRNA在原代肺成纤维细胞中的验证分析 |
| 1.2.9 候选差异LncRNA在尘肺患者肺泡灌洗液的巨噬细胞中的表达 |
| 1.2.10 候选差异LncRNALnc771和Lnc714 对肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转化的调节作用 |
| 1.2.11 Lnc771和Lnc714对TGF-β1-Smad2/3 信号通路的调控作用 |
| 1.2.12 候选差异LncRNAs的靶miRNA筛选验证 |
| 1.2.13 联合转染miR-873-3p和 Lnc714 对肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转化的调控作用 |
| 1.2.14 联合转染miR-873-3p和 Lnc714对TGF-β1-Smad2/3 信号通路的调控作用 |
| 1.2.15 联合转染miR-873-3p和 Lnc714 对成纤维细胞迁移的作用 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 矽肺大鼠肺组织中差异LncRNA的筛选、验证及生物信息学分析 |
| 1.3.2 候选差异LncRNA在矽肺纤维化中的作用 |
| 1.3.3 Ln771 和Lnc714 在矽肺纤维化中的作用机制 |
| 1.3.4 Lnc714 通过miR-873-3p靶向调控TGF-β/Smad2/3 信号通路 |
| 1.4 小结 |
| 参考文献 |
| 第2章 矽肺纤维化相关的差异mRNAs的筛选、验证及SPP1 对矽肺纤维化的调控机制 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 试剂和耗材 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 实验所需配制的试剂 |
| 2.1.5 动物实验 |
| 2.1.6 细胞实验 |
| 2.1.7 实验关键技术操作步骤 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 矽肺大鼠肺组织差异mRNA的筛选 |
| 2.2.2 矽肺大鼠肺组织差异mRNA的筛选 |
| 2.2.3 矽肺相关差异mRNA在矽肺大鼠模型中的验证 |
| 2.2.4 具有差异代表性的mRNA SPP1 在矽肺大鼠中的表达 |
| 2.2.5 mRNA SPP1 在矽肺患者血清中的表达 |
| 2.2.6 Ac-SDKP抑制SPP1 在矽肺大鼠中的表达 |
| 2.2.7 Ac-SDKP抑制SPP1 在巨噬细胞中的表达 |
| 2.2.8 Ac-SDKP抑制SPP1 在巨噬细胞培养基中的表达 |
| 2.2.9 Ac-SDKP抑制SPP1/TGF-β1 信号通路 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 矽肺大鼠肺组织中差异mRNA筛选、验证和生物学分析 |
| 2.3.2 SPP1 在激活的巨噬细胞中高表达 |
| 2.3.3 SPP1 通过调控TGF-β1 促进矽肺纤维化 |
| 2.3.4 Ac-SDKP抑制SPP1/TGF-β1 信号拮抗矽肺纤维化 |
| 2.4 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 第3章 综述 长链非编码RNA与肺纤维化的研究进展 |
| 3.1 LncRNA的概述 |
| 3.2 LncRNA在肺纤维化中的作用 |
| 3.3 LncRNA在其他器官和组织中的作用 |
| 3.4 LncRNA的诊断及预后 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间研究成果 |
（4）黄芪甲苷Ⅳ通过PPM1A调控TGF-β1/Smad信号通路减轻矽肺肺损伤和纤维化（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 黄芪甲苷Ⅳ(ASV)可缓解矽肺损伤及纤维化 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 实验材料及方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二部分 黄芪甲苷Ⅳ通过调控TGF-β1/Smad信号通路抑制炎症和氧化应激发挥抗纤维化作用 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三部分 ASV通过调节PPM1A的表达调控TGF-β1/Smad信号通路 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 课题的创新点及局限性 |
| 创新点 |
| 局限性 |
| 综述 矽肺发病机制及黄芪甲苷Ⅳ抗纤维化治疗进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| English paper Ⅰ |
| English Paper Ⅱ |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（5）LncRNA MRAK050699通过调控EMT过程在矽肺纤维化中的作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 SiO_2诱导矽肺纤维化动物模型中LncRNA表达谱的改变 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 LncRNA MRAK050699通过调控EMT过程在矽肺纤维化中的作用研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 长链非编码RNA在特发性肺纤维化中作用机制的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 个人简介 |
| 开题、中期及学位论文答辩委员组成 |
（6）LncRNA MEG3介导的PI3K/AKT通路和EMT在纳米氧化镍致大鼠肺纤维化中的作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 纳米材料与纳米毒理学 |
| 1.2 纳米颗粒致肺纤维化 |
| 1.3 肺纤维化的机制 |
| 1.4 NiO NPs的毒作用及其机制 |
| 1.5 本研究的目的及意义 |
| 1.6 技术路线图 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验动物和细胞 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要溶液及配制 |
| 2.4 主要仪器设备 |
| 2.5 实验方法 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 体内实验 |
| 3.2 体外实验 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 建立大鼠肺纤维化模型 |
| 4.2 建立A549 细胞胶原沉积模型 |
| 4.3 NiO NPs对 TGF-β1、PI3K/AKT通路、EMT和 MEG3 的影响 |
| 4.4 TGF-β1在NiO NPs诱导的胶原沉积中的作用 |
| 4.5 PI3K/AKT通路介导的EMT在 NiO NPs诱导的胶原沉积中的作用 |
| 4.6 MEG3在NiO NPs诱导的胶原沉积中的作用 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（7）Smad7泛素化修饰对博来霉素致小鼠肺纤维化的影响（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（8）基于血管新生机制探讨miR-126对肺纤维化大鼠VEGF调控及加味补阳还五汤的干预作用（论文提纲范文）
| 提要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 理论探讨 |
| 1 中医学对肺纤维化的认识 |
| 1.1 病名探究 |
| 1.2 病因病机浅析 |
| 1.3 中医辨证论治 |
| 2 现代医学对特发性肺纤维化的认识 |
| 2.1 特发性肺纤维化的病因及发病机制 |
| 2.2 血管新生在特发性肺纤维发病中的作用 |
| 2.3 特发性肺纤维化的西医治疗现状 |
| 第二部分 实验研究 |
| 1 加味补阳还五汤对肺纤维化大鼠肺组织形态学、mi R-126、VEGF及 HIF-1α的影响 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 结论 |
| 2 TGF-β1 诱导的MRC-5中mi R-126 转染对VEGF的影响 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 结论 |
| 3 加味补阳还五汤含药血清对TGF-β1 诱导的MRC-5 mi R-126、VEGF及 HIF-1α的影响 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 结论 |
| 讨论 |
| 1 导师治疗肺纤维化学术思想浅析 |
| 1.1 气运失常 |
| 1.2 血运失常 |
| 1.3 肺络痹阻 |
| 2 加味补阳还五汤组方配伍及研究 |
| 3 疗效分析 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 综述 VEGF 在肺纤维化中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 中英文缩略词 |
| 致谢 |
| 科技查新 |
| 发表论文 |
| 附件 |
（9）基于Notch信号通路探讨贝母组分干预TGF-β1诱导MRC-5氧化损伤的作用机制（论文提纲范文）
| 提要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 从肺虚络瘀探讨肺纤维化氧化应激机制 |
| 1.肺虚络瘀 |
| 1.1 肺虚 |
| 1.2 络瘀 |
| 2.氧化应激 |
| 2.1 氧化/抗氧化系统 |
| 2.2 氧化应激与肺纤维化 |
| 3.肺虚络瘀和氧化应激 |
| 3.1 肺虚与氧化应激 |
| 3.2 络瘀与氧化应激 |
| 4.补肺活血法治疗肺纤维化 |
| 4.1 补肺气 |
| 4.2 润肺阴 |
| 4.3 通肺络 |
| 5.中医药对肺纤维化的抗氧化治疗 |
| 5.1 单味药 |
| 5.2 复方 |
| 6.小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 氧化应激在肺纤维化中的作用机制 |
| 1.自由基与氧化应激 |
| 2.氧化应激 |
| 2.1 体内氧化剂 |
| 2.2 体内抗氧化剂 |
| 3.氧化失衡所致的氧化损伤与肺纤维化 |
| 3.1 脂质的过氧化损伤 |
| 3.2 蛋白质的过氧化损伤 |
| 3.3 DNA的损伤 |
| 4.炎性因子网络 |
| 5.成纤维细胞的增殖 |
| 6.肺泡上皮细胞的凋亡 |
| 7.功能蛋白:蛋白酶/抗蛋白酶系统的损伤 |
| 8.肺纤维化的抗氧化治疗 |
| 9.小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 Notch信号通路与肺纤维化的研究进展 |
| 1.Notch信号通路的组成及传导过程 |
| 1.1 Notch信号通路的构成 |
| 1.2 Notch信号通路的传导过程 |
| 2.Notch信号通路与肺纤维化 |
| 2.1 Notch信号通路与肺的相关性 |
| 2.2 Notch信号通路调控肺纤维化的机制 |
| 2.3 Notch信号通路与EMT的关系 |
| 2.4 EMT与肺纤维化 |
| 参考文献 |
| 第四部分 Notch信号通路与氧化应激的研究进展 |
| 1.Notch信号通路 |
| 1.1 Notch信号通路的结构与转导途径 |
| 1.2 与肺纤维化的相关性 |
| 2.氧化应激 |
| 3.氧化应激与Notch信号通路相关性 |
| 参考文献 |
| 第五部分 MRC-5 氧化损伤模型的构建及贝母组分最佳作用的无毒浓度选择 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 细胞信息 |
| 1.2 主要耗材、试剂 |
| 1.3 主要仪器与设备 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 细胞传代 |
| 2.3 细胞冻存 |
| 2.4 MTT法检测细胞增殖 |
| 2.5 Real-time PCR法检测基因表达 |
| 2.6 Western Blotting检测蛋白表达 |
| 2.7 ELISA法检测8-OHdG蛋白浓度表达 |
| 3.统计学分析 |
| 4.实验结果及分析 |
| 4.1 TGF-β1的不同作用时间对MRC-5细胞增殖抑制作用 |
| 4.2 贝母组分最佳无毒浓度的选择 |
| 5.实验结论 |
| 第六部分 贝母组分对TGF-β1诱导的MRC-5细胞的保护作用 |
| 1.材料 |
| 1.1 细胞信息 |
| 1.2 主要耗材、试剂 |
| 1.3 主要仪器与设备 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 实验分组 |
| 2.2 细胞培养 |
| 2.3 细胞传代 |
| 2.4 细胞冻存 |
| 2.5 Real-time PCR法检测基因表达 |
| 2.6 Western Blotting检测蛋白表达 |
| 2.7 免疫荧光法 |
| 3.统计学分析 |
| 4.实验结果及分析 |
| 4.1 .Real-time PCR法检测collagenⅠ、collagenⅢmRNA表达量 |
| 4.2 Western Blotting检测CollagenⅠ、CollagenⅢ、α-SMA蛋白表达量 |
| 4.3 免疫荧光法检测各组α-SMA的表达 |
| 5.实验结论 |
| 第七部分 贝母乙素通过调控TGF-β1/Notch介导的氧化应激改善肺纤维化的机制研究 |
| 1.材料 |
| 1.1 细胞信息 |
| 1.2 主要耗材、试剂 |
| 1.3 主要仪器与设备 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 实验分组 |
| 2.2 细胞培养 |
| 2.3 细胞传代 |
| 2.4 细胞冻存 |
| 2.5 Real-time PCR法检测基因表达 |
| 2.6 Western Blotting检测蛋白表达 |
| 2.7 ELISA法检测8-OHdG蛋白浓度表达 |
| 2.8 超氧化物岐化酶(SOD)检测 |
| 2.9 微量还原性谷胱甘肽(GSH)检测 |
| 2.10 慢病毒转染实验 |
| 3.统计学分析 |
| 4.实验结果及分析 |
| 4.1 Real-time PCR法检测Notch1-4,Jag1-2,DLL1、3、4,Hes1及collagenⅠ、ⅢmRNA表达情况 |
| 4.2 Western Blotting检测collagenⅠ、Ⅲ,Notch1-4、Jag1-2,Hes1及DLL1、3、4 的蛋白表达水平 |
| 4.3 ELISA法检测各组8-OHdG的表达水平 |
| 4.4 生化检测各组细胞中SOD、GSH的表达 |
| 4.5 Notch-1 慢病毒转染MRC-5 细胞 |
| 5.讨论 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 发表论文 |
（10）丹参酮IIA对矽肺肺损伤及纤维化的保护作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一部分 丹参酮ⅡA对矽肺大鼠肺损伤及纤维化的保护作用研究前言 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 丹参酮ⅡA对二氧化硅诱导的EMT及TGF-β1/Smad信号通路激活的抑制作用研究前言 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 丹参酮ⅡA通过抑制NOX4表达、激活Nrf2/ARE信号通路减轻二氧化硅诱导的氧化应激研究前言 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 英文论文1 |
| 英文论文2 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
四、纤维连接蛋白在大鼠肺纤维化中的作用（论文参考文献）
- [1]基于“阳化气，阴成形”理论研究TGF-β1/Smads影响黄韧带肥厚的机制及模型的建立[D]. 王宝剑. 中国中医科学院, 2021(02)
- [2]CB2受体激动剂JWH133和抑制剂SR144528对卵蛋白诱导大鼠气道重塑的影响[D]. 喻娟娟. 桂林医学院, 2021(01)
- [3]矽肺纤维化靶向LncRNAs和mRNAs的筛选、验证及其调控机制研究[D]. 蔡文臣. 华北理工大学, 2021(02)
- [4]黄芪甲苷Ⅳ通过PPM1A调控TGF-β1/Smad信号通路减轻矽肺肺损伤和纤维化[D]. 李楠楠. 山东大学, 2021(12)
- [5]LncRNA MRAK050699通过调控EMT过程在矽肺纤维化中的作用研究[D]. 高芳瑜. 宁夏医科大学, 2021(02)
- [6]LncRNA MEG3介导的PI3K/AKT通路和EMT在纳米氧化镍致大鼠肺纤维化中的作用[D]. 占海兵. 兰州大学, 2021(09)
- [7]Smad7泛素化修饰对博来霉素致小鼠肺纤维化的影响[D]. 杨珣. 遵义医科大学, 2020
- [8]基于血管新生机制探讨miR-126对肺纤维化大鼠VEGF调控及加味补阳还五汤的干预作用[D]. 田丽. 山东中医药大学, 2020(01)
- [9]基于Notch信号通路探讨贝母组分干预TGF-β1诱导MRC-5氧化损伤的作用机制[D]. 贾新华. 山东中医药大学, 2020(02)
- [10]丹参酮IIA对矽肺肺损伤及纤维化的保护作用及机制研究[D]. 冯菲菲. 山东大学, 2020(11)