一、快速构建腺病毒载体的新方法（论文文献综述）
武静桥[1]（2021）在《共表达Apoptin与MEL基因重组腺病毒的构建及其对肝癌抑制作用研究》文中研究表明肝细胞癌（HCC）异质性、死亡率和转移程度高,以血管增生为主要特征。早期患者临床症状不明显,晚期难以治愈,临床治疗较为棘手。人和动物患病率都逐年升高,耐药现象不断增加,因此,具靶向性的基因治疗成为肝癌治疗的研究热点。HIV反式激活转录（TAT）蛋白,源自人类HIV病毒TAT蛋白,可穿透细胞膜,促进大分子物质进入细胞质;Apoptin诱导的细胞凋亡受到Bcl-2和Apaf-1凋亡小体的调控,通过激活凋亡小体和Bcl-2调节的死亡途径,同时激活自噬和线粒体凋亡途径特异性诱导肿瘤细胞凋亡;肿瘤归巢肽RGD能够识别存在于癌细胞表面的整联蛋白,特异性靶向肿瘤的血管区;MEL通过与细胞膜结合,形成跨膜环状孔而使细胞膜破坏,细胞中的物质泄漏,细胞膜通透性增加,最终导致细胞溶解。本课题选择凋亡素Apoptin与蜂毒肽MEL作为肝癌靶向治疗基因,借助腺病毒作为载体,高效传递至靶细胞。将穿膜肽TAT与Apoptin融合表达,促进裂解的肝癌细胞中Apoptin蛋白二次内化进癌细胞;以靶向肽RGD靶向肝癌血管中的整合素受体,使其与MEL融合表达,引导MEL特异性杀伤肿瘤细胞,减轻对正常组织的非特异性损伤。共表达Apoptin与MEL基因,利用Apoptin以线粒体凋亡和自噬特异性诱导杀伤肿瘤细胞,同时,结合MEL溶解癌细胞的细胞膜、破坏细胞的完整结构特性,实现双基因协调抑瘤的目的,为肝癌的基因靶向治疗奠定基础。试验中将pMD-TAT-Apoptin+UBI-RGD-MEL基因片段利用高保真特异性扩增,无缝克隆连接至线性化的GV314,构建腺病毒穿梭载体GV-TAT-Apoptin+UBI-RGD-MEL。将腺病毒穿梭载体与大骨架质粒共转染至HEK293A细胞,包装纯化获得的重组腺病毒Ad-TAT-Apoptin滴度为1010.75 pfu/m L,Ad-RGD-MEL的滴度为1010.38 pfu/m L,TAT-Apoptin+UBI-RGD-MEL的滴度为1010.25 pfu/m L,Ad-EGFP的滴度为1011 pfu/m L。将各重组腺病毒分别侵染SMMC-7721细胞,间接免疫荧光和Western Blotting检测到肝癌细胞中目的基因成功表达;重组腺病毒Ad-TAT-Apoptin+UBI-RGD-MEL增加了活性氧的表达含量,促使细胞核DNA碎片化;重组腺病毒对L-02无显着抑制作用,对SMMC-7721与Huh 7细胞抑制作用呈现时间和剂量依赖性;流式细胞术检测1000 MOI重组腺病毒侵染SMMC-7721细胞36 h后,与对照组相比,Ad-TAT-Apoptin+UBI-RGD-MEL的早期和晚期凋亡率均存在极显着升高（P<0.01）;重组腺病毒Ad-TAT-Apoptin+UBI-RGD-MEL极显着抑制SMMC-7721细胞的迁移,极显着抑制FBS介导的SMMC-7721细胞的侵袭和趋化作用（P<0.01）。重组腺病毒Ad-TAT-Apoptin+UBI-RGD-MEL能够延缓裸鼠体重下降趋势;Ad-TAT-Apoptin+UBI-RGD-MEL组靶向性强,对正常组织器官损伤小,同时诱导肿瘤与肝脏中Caspase3和P53蛋白表达,凋亡细胞数增多。本实验成功包装了重组腺病毒Ad-TAT-Apoptin+UBI-RGD-MEL,体外试验结果证实重组腺病毒Ad-TAT-Apoptin+UBI-RGD-MEL能够显着抑制SMMC-7721的增殖、迁移和侵袭。经异位瘤模型验证,重组腺病毒Ad-TAT-Apoptin+UBI-RGD-MEL治疗组肿瘤中P53、Casepase3蛋白表达量增加,延缓裸鼠体重下降趋势,对正常组织无明显杀伤作用。综上所述,本试验表明重组腺病毒Ad-TAT-Apoptin+UBI-RGD-MEL能够靶向抑制肝癌细胞,为比较医学和肿瘤靶向治疗提供理论基础。
李志[2]（2021）在《IL-28B通过下调调节性T细胞抗肝癌的机制研究》文中研究说明研究背景与目的2020年世界卫生组织公布的癌症数据显示,肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）发病率在世界癌症中占第6位,死亡率占第3位。肝癌的治疗目前仍是全球医疗的一大挑战,迫切需要新的治疗方法。调节性T细胞（regulatory T cells,Treg cells）具有抑制抗肿瘤免疫的作用,因此抑制Treg成为HCC免疫治疗的潜在策略。IL-28B是IFN-λ成员之一,已报道IL-28B具有抗肿瘤作用且下调Treg,但目前仍不清楚其抗肿瘤的免疫机制。因此本文评价IL-28B下调Treg对小鼠肝癌的治疗效应,阐明其对免疫微环境中T细胞亚群和细胞因子的影响,并研究IL-28B在体外对Treg生成的影响。研究方法（1）利用HEK 293细胞扩增腺病毒载体rAd-mIL-28B,PCR鉴定目的基因,TCID50法测定病毒滴度。（2）MTT法检测IL-28B体外对宫颈癌TC-1细胞增殖的抑制效应。（3）第0天BALB/c雌性小鼠皮下注射1 × 106个小鼠肝癌H22细胞,分别于第4、7和10天瘤内注瘤组织、脾脏、肺脏、肝脏和胸腺湿重;取肿瘤组织HE染色后观察细胞形态;注射1 × 108 PFUs rAd-mIL-28B,测量肿瘤直径。第1 1天处死小鼠,称量肿分离脾脏和肿瘤组织的淋巴细胞,流式细胞术（flow cytometer,FCM）检测T细胞CD4、CD8、Foxp3和PD-1分子的表达;分离血清及制备肿瘤组织匀浆,蛋白芯片技术检测Th1、Th2、Th17、IL-10和单核细胞相关细胞因子水平。（4）分离BALB/c小鼠脾细胞,利用CD3单抗/CD28单抗、IL-2、TGF-β诱导生成iTreg细胞,在此诱导条件下加入IL-28B培养3天后,FCM检测CD4、CD25 和 Foxp3 分子,RT-PCR 检测 Foxp3 和 PD-1 mRNA 水平,ELISA 检测细胞培养上清IL-10水平。（5）构建H22荷瘤小鼠,每天给予E2-a灌胃治疗,剂量为100 mg/kg/day并于第4、7和10天瘤内注射1 × 108 PFUs rAd-mIL-28B,测量肿瘤直径。第11天处死小鼠,称量肿瘤组织湿重;取肿瘤组织HE染色后观察细胞形态;分离脾脏和肿瘤组织的淋巴细胞,FCM检测T细胞CD4、CD8、Foxp3和PD-1分子的表达;分离血清蛋白芯片技术检测Th1、Th2、Th17、IL-10和单核细胞相关细胞因子水平。研究结果（1）PCR法鉴定扩增的腺病毒载体rAd-mIL-28B含有IL-28B基因,TCID50法检测 rAd-mIL-28B 滴度为 1 × 1010.6 PFU/ml,rAd-EGFP 滴度为 1 X 109.55 PFU/ml。（2）MTT试验证明50 μg/ml IL-28B和100 μg/ml IL-28B作用宫颈癌TC-1细胞72h后,OD值分别为0.80±0.09和0.85±0.08,低于阴性对照组（0.92±0.06）（p<0.05）。（3）在肝癌皮下移植瘤小鼠模型中,rAd-mIL-28B组肿瘤体积为796.74 ±447.58 mm3,低于 rAd-EGFP 组（1415.27±513.37 mm3）（p<0.05）;rAd-mIL-28B组平均肿瘤重量为 0.63±0.30 g,低于 rAd-EGFP 组（1.16±0.34 g）（p<0.05）,抑瘤率为 45.69%;肿瘤组织HE染色后,rAd-mIL-28B组可见肿瘤细胞坏死;rAd-mIL-28B 组的肿瘤微环境（tumor microenvironment,TME）中 CD8+T 细胞占淋巴细胞的比例（8.65±5.49%）高于未治疗组（3.21±1.45%）（p<0.05）;与 rAd-EGFP 组相比,rAd-mIL-28B 组 TME 中 Foxp3+T 和 CD4+Foxp3+细胞占淋巴细胞的比例无统计学差异（p>0.05）;rAd-mIL-28B组脾脏CD4+Foxp3+占CD4+T 细胞的比例为 16.78±2.93%,低于 rAd-EGFP 组（21.47±4.17%）（p<0.05）;rAd-mIL-28B组脾脏中CD4+PD-1+T细胞占淋巴细胞比例为1.46±0.08%,明显低于 rAd-EGFP 组（2.40±0.31%）（p<0.05）;与 rAd-EGFP 组相比,rAd-mIL-28B 组血清 CXCL13,ICAM-1,MCP-5 和 IL-7 水平降低（p<0.05）,rAd-mIL-28B肿瘤组织内IL-15和sFasL的表达降低（p<0.05）。（4）与未刺激的脾细胞相比,脾细胞刺激组（500 ng/ml CD3单抗/CD28单抗、5 ng/ml IL-2和1.25 ng/ml TGF-β）培养三天后,Foxp3+细胞占淋巴细胞的比例增加（p<0.05）。与脾细胞刺激组相比,加入50 ng/ml IL-28B后,Foxp3+细胞占淋巴细胞的比例下降,Foxp3 mRNA的水平显着降低（p<0.05）,PD-1 mRNA的水平无明显差异（p>0.05）,细胞培养上清IL-10的水平显着降低（p<0.05）。（5）E2-a联合rAd-mIL-28B作用于H22荷瘤小鼠后抑制了肿瘤体积（p<0.05）;与未治疗组相比,E2-a 联合 rAd-mIL-28B 组 TME 中 Foxp3+、CD4+Foxp3+、CD8+Foxp3+和PD-1+Foxp3+细胞比例明显增加（p<0.05）;血清细胞因子IL-1α、IL-12p40、TNFRI 明显降低,而 MIP-1γ 明显升高（p<0.05）。研究结论（1）rAd-mIL-28B可通过下调H22荷瘤小鼠Treg抑制肿瘤生长。（2）rAd-mIL-28B可影响H22荷瘤小鼠肿瘤免疫微环境。（3）IL-28B具有体外直接抑制Treg细胞生成的作用。（4）rAd-mIL-28B联合E2-a未增强E2-a的抗肿瘤作用。
王子璇[3]（2020）在《TRAIL修饰溶瘤腺病毒靶向治疗急性髓系白血病的研究》文中认为急性髓系白血病（Acute myeloid leukemia,AML）是一种异质性的血液系统恶性肿瘤,对人类的健康构成了严重的威胁。目前,AML的临床治疗仍旧是以放化疗、骨髓移植为主。尽管治疗手段在逐渐进步,但AML患者的整体存活率仍旧很低。对于一线化疗药物产生耐药反应是导致治疗失败的最主要原因,因此继续寻求新的治疗方式是当前AML治疗的首要任务。随着生命科学和医学研究的深入发展,溶瘤病毒（Oncolytic virus）成为目前治疗恶性肿瘤的一个重要发展方向。然而,由于靶向性较弱和感染效率不足,利用溶瘤病毒治疗白血病等血液系统恶性肿瘤目前仍然受到限制。溶瘤腺病毒是恶性肿瘤溶瘤病毒疗法研究中应用最为广泛的病毒类型之一。然而,受给药方式（目前主要通过瘤内给药）的限制,溶瘤腺病毒治疗血液恶性肿瘤的研究较少。在课题组的前期研究中,我们利用亮氨酸拉链异二聚体系统,通过对腺病毒衣壳蛋白进行结构改造修饰,成功构建了一种靶向型溶瘤腺病毒载体（rAd5pz-zTRAIL-RFP-SΔ24E1a,A4）。该载体可以通过静脉给药对乳腺癌小鼠模型产生较好的治疗效果。因此,本论文希望通过对载体进行优化,进一步考察其应用于AML治疗的潜力。溶瘤腺病毒A4可以表达肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）,且能够利用亮氨酸拉链（zipper）连接于病毒表面,从而靶向肿瘤细胞并增强肿瘤杀伤能力。因此,论文首先检测了AML细胞系和原代细胞表面腺病毒受体和TRAIL受体的表达水平。结果显示:在永生型AML细胞系THP-1和MV4-11均表达较高水平的死亡受体DR4、DR5,但假死亡受体（DcR1和DcR2）表达水平较低,并且两株细胞均表达较低水平的腺病毒受体（CAR,整合素αvβ3和整合素αvβ5）。而在所检测的19例AML患者来源的原代细胞中,有50%以上的样本表达中等水平的DR4、DR5。这一结果对经过我们改造的重组溶瘤腺病毒载体的应用奠定了基础。前期研究发现,尽管A4病毒的衣壳表面通过zipper修饰有TRAIL,但病毒衣壳修饰的TRAIL量小于理论值。所以,为了进一步提升A4的肿瘤靶向能力,我们首先构建了C端融合亮氨酸拉链zipper E·E34单链的截短型TRAIL的融合蛋白z-sTRAIL的原核表达质粒pET-28a-z-sTRAIL,并在大肠杆菌内成功表达并纯化出z-sTRAIL蛋白。在验证了z-sTRAIL的基本生物学活性后,将z-sTRAIL蛋白与腺病毒衣壳pIX修饰有zipper R·R34单链的病毒进行体外共孵育,经过CsCl密度梯度离心的方法对其进行纯化。通过对其进行dot blot和ELISA检测后证实,经过体外优化可以得到比A4病毒衣壳TRAIL修饰量多出一倍的重组溶瘤腺病毒载体,优化后的载体命名为zA4。通过对THP-1和MV4-11细胞进行感染分析,我们发现zA4对AML细胞的感染能力明显优于A4和衣壳未经修饰的A3病毒。并且通过THP-1与病毒的结合与内在化实验进一步证明了病毒载体表面修饰的TRAIL蛋白越多,越有利于增强病毒载体对THP-1细胞的结合能力。随后通过体外的抑瘤效果评价我们可以发现,以不同MOI病毒（A3、A4和zA4）分别感染THP-1和MV4-11细胞,三种溶瘤腺病毒均可以诱导剂量依赖的AML细胞毒性。并且对人正常淋巴T细胞H9无明显杀伤。并且以相同方法对19例AML患者的原代细胞样本进行相同的细胞毒性分析,结果表明三种溶瘤腺病毒均可以对原代AML细胞造成明显杀伤,并且杀伤能力随着病毒衣壳TRAIL蛋白修饰量的增加而增强。之后,使用THP-1细胞在Balb/c裸鼠中进行了体内抑瘤效果评价。我们成功建立了皮下荷瘤模型和静脉荷瘤模型两种AML模型。在两种模型中,三种病毒均有较明显的肿瘤靶向效果和抑制肿瘤效果,并且zA4显示出最佳的肿瘤靶向能力和效果最明显肿瘤细胞杀伤能力。由于发现溶瘤病毒在部分TRAIL受体表达较低的原代AML细胞中活性并不理想,因此为了进一步提升重组溶瘤腺病毒zA4在TRAIL死亡受体相对低表达的肿瘤细胞系中的杀伤能力,我们针对TRAIL活性进行了化药筛选。研究结果表明,人参皂苷Rh2能够提升肿瘤细胞的死亡受体表达,从而增强TRAIL引起的细胞凋亡活性。并且发现在同时应用低剂量的Rh2与低剂量的sTRAIL联合后,可以降低sTRAIL的半数抑制浓度IC50,二者之间存在着较强的协同作用。之后我们分别使用永生化AML细胞系THP-1与原代AML细胞分别进行了Rh2联合zA4的体外抑瘤效果评价,发现Rh2在这两类AML细胞中均能够显着增强zA4的肿瘤杀伤能力。最后,我们利用静脉荷瘤模型对这种联合疗法进行了体内评价验证。实验结果表明,这种联合治疗的方式可以有效地抑制肿瘤细胞的增殖及肝浸润现象,并且有效地延长了小鼠的生存期。综上所述,在本论文的研究中,我们通过对前期获得的靶向型溶瘤腺病毒进行优化,获得了具有更多TRAIL蛋白修饰的溶瘤腺病毒载体zA4。然后利用AML细胞系和原代AML细胞在体外细胞水平验证了zA4具有较好的抗肿瘤活性,并在裸鼠荷瘤模型中通过静脉注射的方式进行治疗性评价,证实优化后的zA4具有更强的肿瘤靶向能力及更强的抑瘤效果。此外,Rh2与zA4的联合应用增强了zA4对原代AML细胞和移植型AML裸鼠模型的靶向治疗效果。本研究提供了将溶瘤腺病毒载体应用于治疗包括AML在内的血液系统恶性肿瘤中的可行性。
何武兵[4]（2020）在《重组慢病毒介导的BMP2和TGF-β3共转染修饰大鼠骨髓基质干细胞在脊柱融合中成骨分化的协同作用》文中认为背景:组织工程人工骨中骨髓间充质干细胞（BMSCs）、骨生长因子和合适的载体发挥重要作用。研究编码人骨形态发生蛋白2（hBMP2）和转化生长因子β 3（TGF-β3）的慢病毒（LV）对BMSCs的体内外成骨分化,促进骨形成,协同提高脊柱融合效果。方法:构建编码hBMP2和/或hTGF-β3基因的慢病毒并转染大鼠BMSCs。转染后BMSCs成骨分子的表达使用qRT-PCR和蛋白质印迹进行检测。构建大鼠腰椎后外侧横突间融合模型。术后通过放射学、手工触诊、Micro-CT和组织学进行评估融合效果。结果:hBMP2和/或hTGF-β3基因通过聚合酶链反应扩增,DNA测序,以及BLAST分析来确认。编码hBMP2和/或hTGF-β3基因的慢病毒感染的BMSCs可有效地过表达hBMP2和hTGF-β3,以及上调培养上清液中hBMP2和hTGF-β3的水平。共转染hBMP2和hTGF-β3比单独转染hBMP2或hTGF-β3更有效地诱导BMSCs成骨分化。LV-hBMP2和LV-hTGF-β3共转染组（分别编码hBMP2和hTGF-β 3的LV转染的BMSCs混合使用）和LV-hBMP2-hTGF-β3组（编码hBMP2和hTGF-β3融合基因的LV转染的BMSCs）中骨桥蛋白（OPN）,骨钙蛋白（OCN）和骨保护素（OPG）的表达水平显着高于LV-BMP2（LV携带hBMP2转染的BMSCs）组和 LV-hTGF-β3（LV 携带 hTGF-β3 转染的 BMSCs）组（P<0.05）。hBMP2和/或hTGF-β3过表达上调碱性磷酸酶（ALP）活性。大鼠腰椎后外侧植入术后2周、4周、6周、8周通过放射学评估骨生长情况。大鼠腰椎后外侧植入术后8周,通过手工触诊、Micro-CT和组织学进行评估。LV-hBMP2和LV-hTGF-β3组1只（共5只）,和LV-hBMP2-hTGF-β3组4只（共8只）大鼠脊柱全部融合;LV-空载体组6只（共7只）,LV-hBMP2组1只（共8只）和LV-hTGF-β3组1只（共10只）大鼠脊柱全部植入处均未见明显骨痂生长;其余各组大鼠脊柱植入处可见部分骨痂,但是无法融合。结论:本研究表明慢病毒载体能够成功转导hBMP2和/或hTGF-β3基因,靶向基因可在BMSCs中成功过表达。我们的体外实验表明,联合使用hBMP2和hTGF-β3基因可以协同诱导骨分化。本实验条件下,慢病毒携带hBMP2和hTGF-β3基因感染的BMSCs,分别单独产生BMP2和hTGF-β3,在免疫活性大鼠模型中能诱导成骨,但是无法获得脊柱融合。hBMP2和hTGF-β3融合基因转染比hBMP2和hTGF-β3混合转染的BMSCs更能诱导成骨,脊柱融合率更高。免疫活性大鼠模型中,hBMP2和hTGF-β3基因可以联合使用、融合基因效果更佳,均能协同诱导成骨、促进脊柱融合,预计这两种细胞因子的组合将在未来作为一种治疗策略。
阮晨梅[5]（2020）在《Pdx1、Ngn3、Mnx1、Mafa和Pax4组合转染诱导犬ADSCs向IPCs分化的研究》文中指出目前,通过对胰岛β细胞发育调控基因重编程使脂肪间充质干细胞具有胰岛素分泌功能,从而代替胰岛β细胞用于糖尿病治疗已成为一大研究热点。基因Pdx1、Ngn3、Pax4、Mafa等是胰腺发育的主要调控基因,它们的突变缺失都会严重破坏胰腺内分泌细胞的发育。通过转基因技术使这些基因在干细胞中过表达,但结果发现单基因转染的定向诱导作用并不明显,要实现干细胞向胰岛素分泌阳性细胞的定向分化还需要其他基因的配合,进而筛选最佳基因组合并通过多基因共表达实现干细胞向胰岛素分泌细胞分化具有重要意义。前期本研究小组已通过绝对定量转录组测序分析筛选出在犬ADSCs向胰岛素分泌阳性细胞分化中可能起作用的新表达调控基因Foxa2、Insm1和Mnx1。因此,本试验前期构建了基因Foxa2、Insm1和Mnx1的真核过表达载体和腺病毒过表达载体,并对其在犬ADSCs中的过表达功能进行验证,对比筛选出功能最佳的新表达调控基因Mnx1。此外,试验中发现真核表达载体筛选周期长,筛选效率低,而腺病毒过表达载体操作简单,感染效率高。因此后期实验中,将基因Mnx1与级联调控关键基因Pdx1、Ngn3、Pax4、Mafa以2A肽连接,以不同的排列形式构建5组腺病毒介导的多基因共表达载体,包装扩增为高滴度的腺病毒毒液后感染犬脂肪间充质干细胞并对分化效果进行监测。研究结果如下:1. 成功构建重组真核过表达载体pIRES2-EGFP-Foxa2、pIRES2-EGFP-Insm1、pIRES2-EGFP-Mnx1和重组腺病毒过表达载体pAd-Foxa2、pAd-Insm1、pAd-Mnx1,并经PCR鉴定和双酶切鉴定。分别感染犬ADSCs后对比各时间段胰岛β细胞发育调控基因m RNA表达量,显示腺病毒介导的基因Mnx1过表达可显着提高胰岛β细胞发育调控基因Pdx1、Ngn3、Mnx1、Nkx2.2、Nkx6.1、Gata4在犬ADSCs中的表达水平,并发现腺病毒的感染效率明显高于真核过表达载体。2. 成功构建五组多基因共表达腺病毒载体pAd-Pdx1-E2A-Ngn3、pAd-Pdx1-E2A-Ngn3-P2A-Mnx1、pAd-Pdx1-E2A-Ngn3-P2A-Mafa-F2A-Mnx1、pAd-Pdx1-E2A-Ngn3-P2A-Pax4-E2A-Mnx1、pAd-Pdx1-E2A-Ngn3-P2A-Mafa-F2A-Pax4。经过酶切、PCR鉴定和测序正确。通过RT-q PCR和Western blot检测发现各组合中目的基因在m RNA水平和蛋白水平都有明显表达。3. 五组多基因共表达腺病毒载体包装扩增后感染犬ADSCs,荧光定量PCR结果显示组合三中基因Pdx1、Ngn3、Mafa和Mnx1共表达后,胰岛β细胞发育调控基因Pdx1、Mafa、Nkx2.2、Nkx6.1、Gata4、Ins、Pcsk2、Slc30a8、Abcc8、Ksnj8、G6pc2表达量显着提高,与其他组合相比差异性显着。感染25 d后形成的类圆形细胞团双硫腙染色后呈现红棕色,提示有胰岛素分泌。组合三腺病毒感染的犬ADSCs在高糖（25 mmol/L）和低糖（5 mmol/L）刺激下,上清液中胰岛素分泌量分别是101.810±4.39μIU/105cells和49.439±2.5μIU/105cells,其胰岛素刺激释放指数（Stimulation Index,SI）为2.059±0.175,与其他几组呈现显着性差异。结果表明,基因Mnx1过表达可显着提高胰岛β细胞发育调控基因Pdx1、Ngn3、Mnx1、Nkx2.2、Nkx6.1、Gata4在犬ADSCs中的表达水平。腺病毒的感染效率明显高于真核过表达载体。腺病毒介导基因Pdx1、Ngn3、Mafa和Mnx1在犬脂肪间充质干细胞中共表达,可高效调控其向胰岛素分泌阳性细胞分化,为进一步探究糖尿病的干细胞替代疗法奠定了基础。
李世军[6]（2020）在《牛PLIN1基因转录调控机制及其对前体脂肪细胞增殖、分化和脂类代谢的作用研究》文中指出脂滴包被蛋白（perilipin,PLIN1）是一种在真核生物中由PLIN1基因编码的蛋白质。PAT家族是与脂滴表面蛋白相关的蛋白质家族。PLIN1的磷酸化对脂肪组织中脂肪代谢有重要作用,在脂肪细胞中调节脂肪分解和脂肪储存起重要作用。PLIN1包被在脂滴外层,可阻止体内脂肪酶进入脂滴,如激素敏感性脂肪酶（HSL）和脂肪甘油三酯脂肪酶（ATGL）。PLIN1基因对脂肪分解具有双向调控作用:基础状态下,PLIN1包被于脂滴表面,阻止脂肪酶接触到脂滴内的甘油三酯,从而抑制脂肪分解;能量需求增加时,c AMP-PKA信号通路被激活,PLIN1磷酸化促进脂解。为了探究牛PLIN1基因对牛脂肪细胞增殖分化和脂类代谢的调控作用,本研究以秦川肉牛初生犊牛前体脂肪细胞为实验材料,通过腺病毒介导过表达和干扰PLIN1基因的方法,来探讨PLIN1基因在调控牛前体脂肪细胞增殖分化过程及脂类代谢中作用,主要研究内容如下:1、PLIN1基因多态位点与秦川肉牛生长性状和肉质性状的关联分析检测PLIN1基因在秦川肉牛12个不同组织部位中的表达量,牛PLIN1基因在皮下脂肪组织中表达量显着高于其它组织（p<0.01）。在510头秦川肉牛样本中,通过直接测序检测到PLIN1基因上存在5个SNP位点,分别是g.3579T>C、g.3897G>A、g.8332G>A、g.10516T>C和g.10537G>T。关联分析显示,这5个SNP位点与秦川肉牛部分生长发育性状和肉质性状紧密关联。单倍型组合型H2H4可作为有效分子标记用于秦川肉牛育种。2、转录因子E2F1、PLAG1、C/EBPβ和SMAD3对PLIN1基因的转录调控作用克隆得到PLIN1基因5’端上游序列1978bp,通过逐段缺失及双荧光素酶活检测确定PLIN1基因核心启动子区位于-209～-17bp之间。在核心启动子区域预测并筛选得到C/EBPβ、E2F1、PLAG1和SMAD3等重要转录因子。通过定点突变和干扰试验,C/EBPβ、E2F1、PLAG1和SMAD3等转录因子在维持PLIN1基因启动子活性中起到重要作用。进一步通过EMSA实验,在体外验证C/EBPβ、E2F1、PLAG1和SMAD3等转录因子是PLIN1基因的关键转录因子,验证了PLIN1基因在牛脂肪细胞中有重要调控作用。3、PLIN1基因对牛前体脂肪细胞增殖、分化和脂类代谢作用通过构建牛PLIN1基因腺病毒过表达和干扰载体,并包装获得过表达重组腺病毒Ad-PLIN1和干扰重组腺病毒sh-PLIN1。在牛前体脂肪细胞中,过表达PLIN1基因在m RNA水平上促进PLIN1、FASN、PPARγ、ACC、LPL、FABP4、DGAT2和C/EBPβ等基因的表达,抑制了PLIN2和ATGL等脂肪代谢基因的表达,在蛋白水平上促进PLIN1、FASN、PPARγ、ACC、LPL、FABP4和DGAT2等基因的表达,抑制了ATGL基因的表达;类似地在牛前体脂肪细胞中干扰PLIN1基因则会有相反的结果。在过表达PLIN1基因后,油红O染色结果显示脂肪细胞中脂滴数目增加且体积增大,甘油三酯检测含量也增加;干扰PLIN1基因后,脂肪细胞中脂滴的数目减少且体积变小,甘油三酯含量减少,说明PLIN1基因能够促进牛前体脂肪细胞甘油三酯积累,在脂肪代谢中有重要调节作用。4、基于转录组测序分析PLIN1基因对脂类代谢影响及关键基因挖掘通过转录组测序（RNA-seq）对过表达腺病毒Ad-PLIN1和Ad-NC（空载病毒）处理后的牛前体脂肪细胞差异表达基因进行分析。通过转录组测序分析,共检测到1923个差异表达基因,对差异基因GO分析和KEGG信号通路分析,部分差异基因富集在与脂肪增殖分化相关的AMPK信号通路、Wnt信号通路和PPAR信号通路上,在转录水平说明PLIN1基因对脂肪增殖和代谢有重要调节作用。测序结果也筛选了新的与脂肪代谢相关通路的差异基因,为秦川肉牛的分子育种提供理论支持。5、基于小RNA测序分析PLIN1基因对脂类代谢影响及关键基因挖掘进一步研究PLIN1基因对脂类代谢的影响,对转录组测序个体进行small RNA测序。对测序结果分析,共鉴定到719个已知mi RNAs和112个新的mi RNAs,发现34个差异表达mi RNA,其中18个mi RNA上调,16个mi RNA下调,对差异表达mi RNA靶基因进行预测共得到6000个靶基因。对差异表达mi RNA靶基因进行GO富集分析和KEGG通路分析,其中部分富集在MAPK信号通路、c GMP-PKG信号通路和m TOR信号通路等脂肪代谢、蛋白质代谢和细胞免疫信号通路。通过m RNA-seq与small RNA-seq整合分析,依据mi RNA与其靶基因间的对应关系对差异表达mi RNA的靶基因进行GO富集和KEGG通路分析,主要富集在Wnt信号通路、氨基酸的生物合成、p53信号通路和MAPK信号通路。综上所述,本研究通过构建逐段缺失载体和EMSA实验对牛PLIN1基因的转录调控机制初步研究,运用高通量测序RNA-seq和small RNA-seq运用多组学分析从m RNA-mi RNA水平研究PLIN1基因在脂类代谢中的作用。
高登科[7]（2020）在《Pdx1、Ngn3、Sox9、Pax4和Nkx2.2不同组合重编程犬ADSCs成为IPCs的研究》文中研究指明糖尿病是全球最普遍的全身性代谢病之一,传统的药物疗法和胰岛素注射疗法不能从根本上治疗糖尿病。胰岛移植能够有效的控制血糖变化,避免并发症的发生,然而由于供体不足和免疫排斥,使其应用受到限制。在细胞水平上通过定向诱导的方法,将多潜能性干细胞向具有胰岛素分泌功能的细胞进行诱导分化,为糖尿病治疗研究提供新方法。脂肪间充质干细胞（Adipose-derived mesenchymal stem cells,ADSCs）易于分离培养,且较少涉及到医学伦理问题,并且具有抑制受体淋巴细胞增殖和保护胰岛β细胞免受自体免疫破坏的独特优势,是治疗糖尿病的理想种子细胞。Pdx1、Ngn3、Pax4和Nkx2.2作为级联调控关键基因,在胰腺、胰岛细胞发育和成熟过程中起重要调控作用。将这些基因分别单独转入ADSCs,可诱导其向胰岛素分泌细胞（Insulin producing cells,IPCs）分化,但所分泌的胰岛素含量不随糖浓度而变化,不具有功能性胰岛β细胞的性质,通过其他基因配合组成多基因组合联合转染,为重编程ADSCs的转分化研究提供了新思路。因此,本试验在这些级联调控关键基因的基础上引入经过功能验证的Sox9基因,探究这五种基因组成的不同多基因重组腺病毒感染犬ADSCs后,对犬ADSCs向IPCs分化的影响。主要研究结果如下:1、成功构建了Sox9、Fev、Gata4单基因真核过表达载体和腺病毒过表达载体,用它们分别感染犬ADSCs,通过对感染后细胞的形态学观察结果和胰岛发育相关基因m RNA表达水平进行对比筛选,发现真核过表达载体转染效率过低,不能满足试验要求;而腺病毒过表达载体具有较好的转染效率,是基因治疗中较理想的转染工具,且Sox9基因过表达腺病毒的诱导效果最佳。2、成功构建五组多基因共表达腺病毒载体,分别为A组合:p Ad Track-Pdx1-Ngn3-Ad Easy;B组合:p Ad Track-Pdx1-Ngn3-Sox9-Ad Easy;C组合:p Ad Track-Pdx1-Ngn3-Pax4-Sox9-Ad Easy;D组合:p Ad Track-Pdx1-Ngn3-Nkx2.2-Sox9-Ad Easy;E组合:p Ad Track-Pdx1-Ngn3-Nkx2.2-Pax4-Ad Easy,并将它们成功包装为具有感染性的腺病毒。感染犬ADSCs后第4天,通过RT-q PCR和Western blot检测发现各组合不同外源目的基因均实现过表达。3、通过对感染犬ADSCs后第30天的细胞进行形态学观察、双硫腙染色、糖刺激胰岛素分泌试验、细胞免疫荧光及RT-q PCR等检测,对比筛选得到最佳诱导组合E组合（p Ad Track-Pdx1-Ngn3-Nkx2.2-Pax4-Ad Easy）。该组合重组腺病毒感染细胞在高糖（25 mmol/L）刺激下,胰岛素分泌量和细胞内胰岛素含量分别可达到100.94±3.70和109.08±4.88μIU/105 cells。综上所述,本研究成功构建了携带有Pdx1、Ngn3、Sox9、Pax4和Nkx2.2基因的五组不同的多基因共表达腺病毒载体,包装为腺病毒毒液感染犬ADSCs后进行诱导分化效果检测,结果发现Pdx1、Ngn3、Nkx2.2和Pax4基因联合转染组诱导效果最佳,为进一步探究犬ADSCs向IPCs诱导分化的更高效方案奠定了基础。
郑宁[8]（2019）在《整合嗜神经病毒示踪和磁共振成像建立解析神经网络的新技术》文中研究说明大脑中神经元与神经元的连接构成了复杂而又精密的神经网络。解析神经网络的结构与功能将有助于准确地理解大脑行使功能的机制及神经精神疾病的发病机理。嗜神经病毒示踪技术与磁共振成像（Magnetic Resonance Imaging,MRI）是解析神经网络的两种重要方法。它们主要的优势分别是可实现神经网络的精细解析与全脑尺度的活体观察。通过将两者联合运用,各取所长,已产生了颇具优势的新方法,如光遗传学功能磁共振成像（optogenetic functional MRI,ofMRI）以及化学遗传学功能磁共振成像（chemogentic functional MRI,chemo-fMRI）等。在此基础上,本论文从两方面研究了嗜神经病毒示踪和磁共振成像联用的神经网络解析方法,以期实现在活体水平更精确更特异地解析大脑网络。一方面,通过结合MRI报告基因和工具病毒载体,本论文试图利用MRI在活体水平观察大脑神经连接,从而扩展现有的通过离体荧光成像观察结果的病毒标记方法。首先,我们构建了携带MRI报告蛋白铁蛋白（Ferritin）与绿色荧光蛋白（Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP）融合基因的重组水疱性口炎病毒rVSV（rVSV-Ferritin-EGFP）,将其注射在小鼠体感皮层（Somatosensory Cortex,SC）后,对离体鼠脑进行MRI成像,SC、运动皮层（Motor Cortex,MC）、纹状体（Caudate Putamen,CPu）和丘脑（Thalamus,TH）等多个脑区呈现出明显的T2加权暗信号,并且这些区域和绿色荧光信号的位置几乎完全一致。至此,我们不仅实现了 MRI和荧光的双模态成像,更重要的是实现了 MRI所观察的全脑范围宏观神经网络和显微光学成像所观察的全脑介观神经网络的直接关联。然而,由于VSV相关的生物安全限制,注射了 rVSV-Ferritin-EGFP病毒的小鼠无法进行活体MRI实验。为了能在活体水平上观察神经连接,我们进一步构建了携带Ferritin的无致病性的重组腺相关病毒rAAV2-retro（rAAV-retro-CAG-Ferritin-WPRE-pA）,并将此重组病毒注射在小鼠的CPu脑区,随后不同时间点的活体MRI实验结果显示了基底外侧杏仁核（BasoLateral Amygdaloid nucleus,anterior part,BLA）、海马（Hippocampus,Hipp）、MC 等脑区的 T2加权暗信号。总之,携带Ferritin-EGFP的顺向跨多级突触的rVSV可在全脑范围内通过MRI显示与注射位点有神经连接的下游脑区,携带Ferritin的rAAV2-retro可实现活体长时程地展示神经纤维投射到注射位点的上游脑区。以上方法将有助于在活体水平通过MRI进行啮齿类与非人灵长类动物的嗜神经病毒依赖的大脑结构网络示踪。另一方面,通过结合转基因动物,本论文将rAAV病毒携带的化学遗传学元件表达于特定类型神经元内,从而使chemo-fMRI方法精细到特定类型神经元调控的功能网络解析中。本文以腹侧被盖区（Ventral Tegmental Area,VTA）的多巴胺能神经元为例,评估了该方法解析多巴胺能神经元调控的功能网络的有效性。我们特异性激活VTA的多巴胺能神经元或CamKII阳性神经元（包含部分谷氨酸能神经元与部分多巴胺能神经元）,同时记录全脑的BOLD-fMRI信号响应。结果表明,激活右侧VTA的多巴胺能神经元后,除了 VTA,全脑范围内仅有部分前额叶（medial PreFrontal Cortex,mPFC）、扣带回（Cingulate cortex,Cg）及隔区（Septum）呈现小范围的BOLD信号上升,而在直接接受VTA的多巴胺能神经元调控的腹侧纹状体（伏隔核和嗅结节）区域并未观察到BOLD信号改变。激活右侧VTA的CamKII阳性神经元后,全脑有多个脑区显示出明显的BOLD信号升高,其中包括 VTA、mPFC、Cg、Septum、Hipp、右侧岛叶（Insular）、右侧 TH、右侧MC、右侧顶叶联合皮层（Parietal Association cortex,PtA）和右侧视觉皮层（Visual Cortex,ViC）等区域。此部分结果提示,下游BOLD信号变化与VTA多巴胺能神经元的投射之间不存在一一对应关系,亦即多巴胺作为一种神经调质,其对于远程脑区BOLD信号的调控并不明确。因此,对于ofMRI或chemo-fMRI 方法获得的多巴胺能神经元调控的功能网络结果,还需要谨慎解释。
蒋莉莎[9]（2019）在《miR1976/CD105/整合素αvβ6通路在大肠杆菌与金黄色葡萄球菌感染致阴道炎中的作用及机制研究》文中指出在全世界的女性中阴道炎的发生非常普遍,特别是育龄妇女,并且与炎症性疾病中早产和盆腔感染的风险显着增加有关。阴道菌群的失衡是阴道炎的主要原因,最终促进阴道感染的发生和发展。然而,相关的发病机制仍然知之甚少。研究目的:miR1976/CD105/整合素αvβ6通路在大肠杆菌与金黄色葡萄球菌感染致阴道炎中的作用,了解其可能的机制。研究方法:使用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌感染的小鼠阴道炎模型,采用多种分子生物学手段研究microRNA1976与转化生长因子受体CD105和整合素αvβ6的表达相关性,并证实该信号通路与阴道感染进程的关系。研究结果:我们证明miR1976/CD105/整合素αvβ6通路调节小鼠中大肠杆菌介导的阴道感染,microRNA1976的过度表达使大肠杆菌和金黄色葡萄球菌诱导的阴道感染减轻在小鼠体内得到证实。通过CD105过表达腺病毒载体处理的阴道炎小鼠模型中进一步证实了microRNA1976对CD105和整合素αvβ6的调节作用。研究结论:我们的数据表明microRNA1976部分地通过抑制CD105和整合素αvβ6表达负调节大肠杆菌和金黄色葡萄球菌诱导的小鼠阴道感染。这些发现为大肠杆菌和金黄色葡萄球菌诱导的阴道感染的分子机制提供新的见解,为阴道菌群紊乱导致的阴道炎确定一种新的诊断和预后生物标志物,以期为阴道炎提供潜在的治疗靶点。
王旭晨[10]（2019）在《重组腺病毒表达PD-1单抗（Nivolumab）的研究》文中研究说明Nivolumab是一种全人源IgG4型的免疫检查点抑制剂,与活化的免疫细胞上的PD-1结合,破坏PD-1与PD-L1和PD-L2配体的相互作用,从而减弱抑制信号并增强宿主免疫应答。2014年,FDA批准Nivolumab用于治疗各种类型的癌症,如黑色素瘤,非小细胞肺癌,肾细胞癌和经典霍奇金淋巴瘤等。截止到目前,中国有两款进口PD-1抑制剂和三款国产PD-1抗体由CFDA批准上市。然而,由于PD-1单抗高昂的价格和长时间的治疗周期,许多患者仍得不到充分治疗。我们将Nivolumab抗体全长基因克隆到两种腺病毒载体上,分别命名为AdHu5-Nivo和AdC68-Nivo,以便获得价廉高效的重组Nivolumab单抗,为临床相关的免疫治疗提供新方法。先前许多研究已证明基于人血清型5（AdHu5）的腺病毒载体既安全又高效。与AdHu5相比,黑猩猩血清型腺病毒载体在人群中基本没有预存拮抗的中和抗体,这使它们成为很好的替代型疫苗载体。本研究中,我们通过蛋白免疫印迹分析和夹心ELISA检测到体外Nivolumab的高剂量表达。体内研究显示单剂量注射AdHu5-Nivo或AdC68-Nivo重组腺病毒可以诱导持续的Nivolumab表达。重组腺病毒表达单抗能特异性识别并结合小鼠淋巴细胞表面和人肿瘤细胞表面的PD-1。两种重组单抗的生物学活性与商业化单抗类似。随后我们将验证它们在PR8流感病毒小鼠模型的抗病毒作用和在黑素瘤移植动物模型中的抗肿瘤作用。
二、快速构建腺病毒载体的新方法（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、快速构建腺病毒载体的新方法（论文提纲范文）
（1）共表达Apoptin与MEL基因重组腺病毒的构建及其对肝癌抑制作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 重组腺病毒在肝癌治疗中的研究进展 |
| 1.1.1 肝癌的研究背景 |
| 1.1.2 腺病毒载体的研究现状和问题 |
| 1.1.2.1 腺病毒载体的研究现状 |
| 1.1.2.2 腺病毒载体在肿瘤治疗中的进展 |
| 1.2 肿瘤靶向肽与细胞穿膜肽在肿瘤治疗中的研究进展 |
| 1.2.1 肿瘤靶向肽在肿瘤治疗中的研究进展 |
| 1.2.2 细胞穿膜肽在肿瘤治疗中的研究进展 |
| 1.3 蜂毒肽的抑瘤机制及研究进展 |
| 1.3.1 蜂毒肽的抑瘤机制 |
| 1.3.2 蜂毒肽的研究进展 |
| 1.4 凋亡素的抑瘤机制及研究进展 |
| 1.4.1 凋亡素的抑瘤机制 |
| 1.4.2 凋亡素的研究进展 |
| 1.5 研究方案 |
| 1.5.1 技术路线 |
| 1.5.2 研究内容及意义 |
| 第二章 共表达GV-TAT-Apoptin+UBI-RGD-MEL腺病毒穿梭载体的构建 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.1.1 菌株和载体 |
| 2.1.1.2 试剂 |
| 2.1.1.3 主要仪器 |
| 2.1.1.4 溶液和培养基 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.1.2.1 引物设计 |
| 2.1.2.2 重组质粒pMD-TAT-Apoptin和 pMD-UBI-RGD-MEL提取 |
| 2.1.2.3 高保真扩增目的基因TAT-Apoptin和 UBI-RGD-MEL |
| 2.1.2.4 PCR产物胶回收 |
| 2.1.2.5 重组腺病毒载体构建 |
| 2.1.2.6 连接产物转化DH5α感受态细胞 |
| 2.1.2.7 重组质粒的鉴定 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 目的基因特异性扩增 |
| 2.2.2 GV-TAT-Apoptin+UBI-RGD-MEL重组质粒鉴定 |
| 2.2.3 GV-TAT-Apoptin重组质粒鉴定 |
| 2.2.4 GV-RGD-MEL重组质粒鉴定 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 共表达Ad-TAT-Apoptin+UBI-RGD-MEL重组腺病毒的包装与鉴定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.1.1 菌株、细胞系和载体 |
| 3.1.1.2 主要试剂 |
| 3.1.1.3 主要仪器 |
| 3.1.1.4 溶液和培养基 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.1.2.1 细胞培养 |
| 3.1.2.2 重组腺病毒穿梭质粒与大骨架质粒提取 |
| 3.1.2.3 共转染HEK293A细胞 |
| 3.1.2.4 重组腺病毒扩增与纯化 |
| 3.1.2.5 重组腺病毒滴度测定 |
| 3.1.2.6 RT-PCR检测目的基因的表达 |
| 3.1.2.7 间接免疫荧光检测目的基因表达 |
| 3.1.2.8 Western blotting检测目的蛋白表达 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 各重组腺病毒包装及滴度测定 |
| 3.2.2 RT-PCR检测目的基因转录情况 |
| 3.2.3 各重组腺病毒感染SMMC-7721 肝癌细胞情况 |
| 3.2.4 Western blotting检测SMMC-7721 细胞中目的基因表达情况 |
| 3.2.5 间接免疫荧光检测SMMC-7721 细胞中目的基因表达 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 重组腺病毒体外抑瘤作用研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.1.1 重组腺病毒和细胞系 |
| 4.1.1.2 主要试剂 |
| 4.1.1.3 主要仪器 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.1.2.1 CCK-8 法检测重组腺病毒对SMMC-7721 细胞、Huh7 细胞、L-02 细胞的杀伤作用 |
| 4.1.2.2 Western blotting检测凋亡相关蛋白表达 |
| 4.1.2.3 流式细胞术检测SMMC-7721 细胞凋亡情况 |
| 4.1.2.4 细胞划痕试验检测SMMC-7721 细胞迁移能力 |
| 4.1.2.5 细胞趋化试验检测FBS介导的SMMC-7721 细胞迁移能力 |
| 4.1.2.6 细胞侵袭试验检测SMMC-7721 细胞侵袭能力 |
| 4.1.2.7 ROS检测重组腺病毒对SMMC-7721 细胞活性氧含量影响 |
| 4.1.2.8 TUNEL检测SMMC-7721 细胞凋亡情况 |
| 4.1.2.9 扫描电镜观察 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 各重组腺病毒抑制L-02 细胞增殖 |
| 4.2.2 各重组腺病毒抑制SMMC-7721 细胞增殖 |
| 4.2.3 各重组腺病毒抑制Huh7 细胞增殖 |
| 4.2.4 各重组腺病毒SMMC-7721 细胞凋亡蛋白表达 |
| 4.2.5 流式细胞术检测SMMC-7721 细胞凋亡结果 |
| 4.2.6 细胞划痕试验结果 |
| 4.2.7 细胞趋化试验结果 |
| 4.2.8 细胞侵袭试验结果 |
| 4.2.9 ROS含量检测结果 |
| 4.2.10 TUNEL检测SMMC-7721 细胞凋亡 |
| 4.2.11 扫描电镜观察各重组腺病毒诱导SMMC-7721 细胞形态变化 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 重组腺病毒体内抑瘤作用研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.1.1 细胞系和试验动物 |
| 5.1.1.2 主要试剂 |
| 5.1.1.3 主要仪器 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.1.2.1 SMMC-7721 实体瘤模型的建立与荷瘤裸鼠治疗 |
| 5.1.2.2 病理切片制备及HE染色 |
| 5.1.2.3 免疫组织化学染色 |
| 5.1.2.4 TUNEL染色 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 荷瘤裸鼠体重变化曲线 |
| 5.2.2 各重组腺病毒对荷瘤裸鼠内脏器官及肿瘤重量影响 |
| 5.2.3 裸鼠各组织HE染色结果 |
| 5.2.4 肿瘤组织免疫组织化学结果 |
| 5.2.5 TUNEL染色结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 英文缩写词表 |
| 攻读硕士学位论文期间发表的论文及着作 |
（2）IL-28B通过下调调节性T细胞抗肝癌的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 肝癌概况及其免疫治疗进展 |
| 1.1.1 肝癌概况 |
| 1.1.2 肝脏的免疫系统和HCC诱导的免疫耐受导致了疾病的进展 |
| 1.1.3 肝癌的免疫治疗 |
| 1.2 IL-28B的研究进展 |
| 1.2.1 IL-28B结构 |
| 1.2.2 IL-28B单核酸多态性 |
| 1.2.3 IL-28B信号转导 |
| 1.2.4 IL-28B及IL-28Rα表达 |
| 1.2.5 IL-28B抗感染作用 |
| 1.2.6 IL-28B免疫调节作用 |
| 1.2.7 IL-28B对Treg细胞的调节作用 |
| 1.2.8 IL-28B对肿瘤生长的影响及机制 |
| 1.3 Treg细胞的研究进展 |
| 1.3.1 Treg细胞的发育 |
| 1.3.2 Treg细胞的抑制机制 |
| 1.3.3 Treg细胞成为肿瘤免疫治疗的潜在靶点 |
| 1.3.4 Treg细胞对TME的影响 |
| 1.3.5 TME中Treg细胞富集的机制 |
| 1.3.6 Treg细胞抑制肿瘤免疫的机制 |
| 1.4 本课题立项依据 |
| 1.5 技术路线图 |
| 第二章 重组腺病毒rAd-mIL-28B的制备及体外抑制肿瘤细胞生长的研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料和仪器 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 验证重组腺病毒rAd-mIL-28B |
| 2.3.2 TCID50法检测腺病毒滴度 |
| 2.3.3 IL-28B体外对TC-1细胞生长的作用 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 rAd-mIL-28B抗肝癌效应及免疫机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料和仪器 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 rAd-mIL-28B对H22荷瘤小鼠肿瘤体积的影响 |
| 3.3.2 rAd-mIL-28B对H22荷瘤小鼠瘤重的影响 |
| 3.3.3 肝癌组织HE染色后细胞形态改变 |
| 3.3.4 rAd-mIL-28B对H22荷瘤小鼠脾脏、肺脏、肝脏及胸腺重量的影响 |
| 3.3.5 rAd-mIL-28B对H22荷瘤小鼠脾脏、肺脏、肝脏及胸腺脏器指数的影响 |
| 3.3.6 rAd-mIL-28B对H22荷瘤小鼠脾脏T细胞亚群的影响 |
| 3.3.7 rAd-mIL-28B对H22荷瘤小鼠脾脏CD4~+Foxp3~+Treg细胞的影响 |
| 3.3.8 rAd-mIL-28B对H22荷瘤小鼠脾脏PD-1~+T细胞的影响 |
| 3.3.9 rAd-mIL-28B对H22荷瘤小鼠肿瘤组织T细胞亚群的影响 |
| 3.3.10 rAd-mIL-28B对H22荷瘤小鼠肿瘤组织CD4~+Foxp3~+Treg细胞的影响 |
| 3.3.11 rAd-mIL-28B对H22荷瘤小鼠肿瘤组织PD-1~+T细胞的影响 |
| 3.3.12 rAd-mIL-28B对H22荷瘤小鼠血清细胞因子的影响 |
| 3.3.13 rAd-mIL-28B对H22荷瘤小鼠肿瘤组织细胞因子的影响 |
| 3.3.14 rAd-mIL-28B在H22荷瘤小鼠血清和肿瘤组织中细胞因子的差异表达 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 IL-28B对调节性T细胞分化的体外研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料和仪器 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 体外脾脏Treg细胞不同时间CD4、CD25和Foxp3分子表达情况 |
| 4.3.2 IL-28B体外抑制i Treg细胞生成的研究 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 rAd-mIL-28B联合生物碱对肝癌抑制作用实验研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 实验材料和仪器 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 rAd-mIL-28B联合E2-a对H22荷瘤小鼠肿瘤体积变化的影响 |
| 5.3.2 rAd-mIL-28B联合E2-a对H22荷瘤小鼠肿瘤重量变化的影响 |
| 5.3.3 HE染色观察肝癌组织细胞形态 |
| 5.3.4 rAd-mIL-28B联合E2-a对H22荷瘤小鼠脾脏T细胞亚群的影响 |
| 5.3.5 rAd-mIL-28B联合E2-a对H22荷瘤小鼠脾脏CD4~+Foxp3~+Treg细胞的影响 |
| 5.3.6 rAd-mIL-28B联合E2-a对H22荷瘤小鼠脾脏PD1~+T细胞的影响 |
| 5.3.7 rAd-mIL-28B联合E2-a对H22荷瘤小鼠肿瘤组织T细胞亚群的影响 |
| 5.3.8 rAd-mIL-28B联合E2-a对H22荷瘤小鼠肿瘤组织CD4~+Foxp3~+Treg细胞的影响 |
| 5.3.9 rAd-mIL-28B联合E2-a对H22荷瘤小鼠肿瘤组织PD-1~+T细胞的影响 |
| 5.3.10 rAd-mIL-28B联合E2-a对H22荷瘤小鼠血清细胞因子的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 结论 |
| 6.1 主要结论 |
| 6.2 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（3）TRAIL修饰溶瘤腺病毒靶向治疗急性髓系白血病的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 急性髓系白血病治疗研究进展 |
| 1.1.1 急性髓系白血病 |
| 1.1.2 AML治疗现状 |
| 1.1.3 AML的新型疗法 |
| 1.2 溶瘤腺病毒与AML治疗 |
| 1.2.1 溶瘤病毒 |
| 1.2.2 溶瘤腺病毒 |
| 1.2.3 溶瘤腺病毒治疗AML的限制 |
| 1.3 溶瘤腺病毒的改造策略 |
| 1.3.1 溶瘤腺病毒的肿瘤靶向策略 |
| 1.3.2 基于pIX的靶向性改造 |
| 1.3.3 TRAIL修饰溶瘤腺病毒 |
| 1.4 立题依据与论文设计 |
| 1.4.1 立题依据 |
| 1.4.2 设计思路 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料、仪器设备与常用试剂 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 常用试剂及缓冲液配置 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 质粒构建 |
| 2.2.2 蛋白表达及纯化 |
| 2.2.3 SDS-PAGE |
| 2.2.4 Western Blot |
| 2.2.5 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 2.2.6 MTT法检测腺病毒诱导的细胞死亡 |
| 2.2.7 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 2.2.8 重组腺病毒扩增 |
| 2.2.9 重组腺病毒纯化 |
| 2.2.10 腺病毒的体内注射后肿瘤靶向检测 |
| 2.2.11 溶瘤腺病毒体内抗肿瘤活性检测 |
| 第三章 结果与讨论 |
| 3.1 急性髓系白血病细胞系及样本受体表达分析 |
| 3.1.1 不同急性髓系白血病细胞株相关受体表达 |
| 3.1.2 急性髓系白血病样本相关受体表达检测 |
| 3.1.3 小结 |
| 3.2 sTRAIL与zipper融合表达质粒的构建及蛋白表达纯化 |
| 3.2.1 sTRAIL与zipper融合表达质粒的构建 |
| 3.2.2 重组z-sTRAIL蛋白的表达纯化 |
| 3.2.3 小结 |
| 3.3 重组溶瘤腺病毒的优化 |
| 3.3.1 重组溶瘤腺病毒的体外优化 |
| 3.3.2 优化后重组溶瘤腺病毒zA4性质评价 |
| 3.3.3 重组溶瘤腺病毒的抗肿瘤活性分析 |
| 3.3.4 小结 |
| 3.4 重组溶瘤腺病毒体外抗AML检测 |
| 3.4.1 重组溶瘤腺病毒对AML细胞系感染性差异分析 |
| 3.4.2 重组溶瘤腺病毒体外抗AML活性 |
| 3.4.3 小结 |
| 3.5 重组溶瘤腺病毒体内抗AML评价 |
| 3.5.1 重组溶瘤腺病毒体内靶向效果评价 |
| 3.5.2 重组溶瘤腺病毒皮下荷瘤模型抗AML活性 |
| 3.5.3 重组溶瘤腺病毒体内肝肾毒性检测 |
| 3.5.4 重组溶瘤腺病毒静脉荷瘤模型抗AML活性 |
| 3.5.5 小结 |
| 3.6 Rh2 联合重组溶瘤腺病毒体外抗肿瘤效果评价 |
| 3.6.1 MTT法检测Rh2联合sTRAIL对THP-1细胞体外杀伤评价 |
| 3.6.2 Rh2联合sTRAIL诱导细胞凋亡 |
| 3.6.3 MTT法检测Rh2联合zA4对THP-1细胞体外杀伤评价 |
| 3.6.4 MTT法检测Rh2联合zA4对原代AML细胞体外杀伤评价 |
| 3.6.5 小结 |
| 3.7 Rh2联合重组溶瘤腺病毒体内抗肿瘤效果评价 |
| 3.7.1 Rh2联合重组溶瘤腺病毒体内抗肿瘤效果评价 |
| 3.7.2 Rh2联合重组溶瘤腺病毒对AML细胞组织浸润能力的影响 |
| 3.8 小结 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 作者简历及攻读博士学位期间发表论文 |
| 致谢 |
（4）重组慢病毒介导的BMP2和TGF-β3共转染修饰大鼠骨髓基质干细胞在脊柱融合中成骨分化的协同作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第1章 构建hBMP2、hTGF-β3以及hBMP2-hTGF-β 3真核表达质粒、病毒的包装和转染BMSCs细胞 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 动物 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.1.4 主要试剂配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 SD大鼠的BMSCs的提取、体外培养和鉴定 |
| 1.2.2 构建PCDH-CMV-EGFP-hBMP2、PCDH-CMV-EGFP-hTGF-β3以及PCDH-CMV-EGFP-hBMP2-hTGF-β3真核表达质粒,并筛选、鉴定、扩增和抽提 |
| 1.2.3 包装病毒的过程 |
| 1.2.4 慢病毒携带重组质粒单个和联合转染BMSCs细胞 |
| 1.2.5 检测经过转染的BMSCs细胞中的目的基因表达 |
| 1.2.6 转染后BMSCs细胞形态变化 |
| 1.2.7 转染后的BMSCs细胞成骨分子的表达 |
| 1.2.8 统计学分析 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 大鼠BMSCs的形态学观察 |
| 1.3.2 大鼠BMSCs的表型鉴定 |
| 1.3.3 目的基因PCR扩增产物电泳分析 |
| 1.3.4 酶切验证重组质粒 |
| 1.3.5 重组质粒经公司测序后结果 |
| 1.3.6 慢病毒包装结果 |
| 1.3.7 慢病毒介导的重组目的质粒感染BMSCs细胞 |
| 1.3.8 免疫印记分析检测目的基因的表达 |
| 1.3.9 实时荧光定量PCR检测BMSCs中目的基因的表达 |
| 1.3.10 感染后的细胞形态变化 |
| 1.3.11 利用细胞爬片和免疫组化染色检测各组细胞转染后的细胞形态和目的蛋白表达 |
| 1.3.12 转染后各组BMSCs的成骨分子的表达 |
| 1.4 讨论 |
| 第2章 慢病毒介导的BMP2和TGF-β3重组质粒感染BMSCs后对大鼠脊柱融合的协同成骨作用 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要实验仪器 |
| 2.1.3 主要试剂配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 实验动物分组 |
| 2.2.2 大鼠BMSCs的分离、培养和鉴定 |
| 2.2.3 各组LV转染大鼠BMSCs移植材料的准备 |
| 2.2.4 手术方法 |
| 2.2.5 标本收集 |
| 2.2.6 观察指标 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 X线片观察 |
| 2.3.2 手动测量评估 |
| 2.3.3 微计算机断层扫描(Micro-CT)分析 |
| 2.3.4 组织学观察标本 |
| 2.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
（5）Pdx1、Ngn3、Mnx1、Mafa和Pax4组合转染诱导犬ADSCs向IPCs分化的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 糖尿病概况 |
| 1.2 干细胞与糖尿病治疗 |
| 1.2.1 胚胎干细胞 |
| 1.2.2 诱导多能干细胞 |
| 1.2.3 间充质干细胞 |
| 1.3 胰岛β细胞发育调控基因的研究进展 |
| 1.3.1 Pdx1 |
| 1.3.2 Foxa2 |
| 1.3.3 Insm1 |
| 1.3.4 Ngn3 |
| 1.3.5 Mafa |
| 1.3.6 Mnx1 |
| 1.3.7 Pax4 |
| 1.4 干细胞体外定向分化为胰岛β细胞的研究进展 |
| 1.4.1 诱导剂法 |
| 1.4.2 联合培养法 |
| 1.4.3 转基因法 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 基因Foxa2、Insm1、Mnx1 的功能验证及筛选 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株、质粒和细胞 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 基因Foxa2、Insm1、Mnx1 的合成与体外扩增 |
| 2.2.2 目的序列PCR扩增 |
| 2.2.3 目的序列的鉴定与回收 |
| 2.2.4 重组腺病毒穿梭载体的构建 |
| 2.2.5 重组腺病毒穿梭载体双酶切鉴定及二次转化扩增 |
| 2.2.6 重组腺病毒载体的构建和PacⅠ酶切鉴定 |
| 2.2.7 重组腺病毒的包装、扩增、滴度测定 |
| 2.2.8 感染犬脂肪间充质干细胞 |
| 2.2.9 荧光定量PCR检测胰岛β细胞发育调控基因表达 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 含目的基因的真核过表达载体的构建及鉴定 |
| 2.3.2 含目的基因的腺病毒过表达载体的构建及鉴定 |
| 2.3.3 荧光定量PCR检测胰岛β细胞发育调控基因表达水平 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 多基因共表达重组腺病毒载体的构建 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 菌株、质粒和细胞 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 目的基因的合成和体外扩增 |
| 3.2.2 目的序列的PCR扩增与鉴定 |
| 3.2.3 重组腺病毒穿梭载体的构建 |
| 3.2.4 重组腺病毒穿梭载体的PCR、双酶切鉴定及二次转化扩增 |
| 3.2.5 重组腺病毒载体的构建 |
| 3.2.6 重组腺病毒载体的鉴定和二次转化扩增 |
| 3.2.7 重组腺病毒载体的包装、扩增、滴度测定 |
| 3.2.8 目的基因表达水平的检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 目的基因扩增及重组腺病毒穿梭载体PCR鉴定 |
| 3.3.2 重组腺病毒穿梭载体的双酶切鉴定 |
| 3.3.3 重组腺病毒载体的PacⅠ酶切鉴定 |
| 3.3.4 多基因共表达腺病毒的包装与扩增 |
| 3.3.5 病毒滴度 |
| 3.3.6 目的基因表达水平 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 多基因重组腺病毒载体感染犬ADSCs诱导其向IPCs分化 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 细胞 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 重组腺病毒感染犬ADSCs |
| 4.2.2 诱导阶段细胞形态学观察及双硫腙染色 |
| 4.2.3 荧光定量PCR检测胰岛β细胞发育调控基因表达 |
| 4.2.4 葡萄糖刺激胰岛素分泌试验 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 诱导阶段细胞形态学观察及双硫腙染色 |
| 4.3.2 胰岛β细胞发育调控基因表达水平 |
| 4.3.3 葡萄糖刺激胰岛素分泌水平 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 结论 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）牛PLIN1基因转录调控机制及其对前体脂肪细胞增殖、分化和脂类代谢的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 脂肪细胞分化研究进展 |
| 1.1.1 脂肪组织和脂肪细胞概述 |
| 1.1.2 脂肪代谢研究进展 |
| 1.1.3 研究脂肪细胞增殖分化的模型 |
| 1.2 PAT家族研究进展 |
| 1.2.1 PLIN1基因研究进展 |
| 1.2.2 PLIN2基因研究进展 |
| 1.2.3 TIP47基因研究进展 |
| 1.2.4 S3-12基因研究进展 |
| 1.2.5 非哺乳动物PAT家族蛋白研究进展 |
| 1.3 分子标记辅助育种 |
| 1.4 真核生物转录调控及重要转录因子研究进展 |
| 1.4.1 C/EBPs家族C/EBPβ |
| 1.4.2 E2F家族E2F1 |
| 1.4.3 PLAG基因家族PLAG1 |
| 1.4.4 Smads家族Smad3 |
| 1.5 多组学高通量测序研究进展 |
| 1.5.1 转录组测序研究进展 |
| 1.5.2 small RNA测序研究进展 |
| 1.5.3 miRNA-mRNA联合分析研究进展 |
| 1.6 脂质代谢的重要通路研究进展 |
| 1.6.1 AMPK信号通路的组成及调控机制 |
| 1.6.2 Wnt信号通路的组成及调控机制 |
| 1.6.3 PPAR信号通路的组成及调控机制 |
| 1.7 本研究的目的与意义 |
| 第二章 PLIN1基因表达模式及其多态位点与秦川肉牛生长性状和肉质性状的关联分析 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 主要仪器与试剂耗材 |
| 2.2.2 组织样品及血液采集与冷冻保存 |
| 2.2.3 血样DNA的提取、组织样品总RNA的提取和cDNA的合成 |
| 2.2.4 实时荧光定量qRT-PCR检测 |
| 2.2.5 数据采集 |
| 2.2.6 多态位点检测 |
| 2.2.7 多态位点分型 |
| 2.2.8 数据分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 组织总RNA电泳检测 |
| 2.3.2 PLIN1 基因mRNA表达谱分析 |
| 2.3.3 牛PLIN1基因序列分析 |
| 2.3.4 PLIN1基因序列同源性分析 |
| 2.3.5 PLIN1基因系统进化树 |
| 2.3.6 PLIN1基因多态性位点遗传分析 |
| 2.3.7 PLIN1 基因SNP位点对秦川肉牛肉质和生长性状的影响 |
| 2.3.8 PLIN1基因的连锁不平衡和单倍型关联分析 |
| 2.3.9 PLIN1 基因SNP单倍型组合对秦川肉牛肉质和生长性状的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 转录因子E2F1、PLAG1、C/EBPβ和SMAD3对PLIN1基因的转录调控作用 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 主要仪器与试剂耗材 |
| 3.2.2 启动子双荧光素酶报告载体的构建 |
| 3.2.3 细胞培养和报告载体的转染 |
| 3.2.4 转录因子的定点突变与基因干扰 |
| 3.2.5 凝胶阻滞试验(EMSA) |
| 3.2.6 数据分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 PCR扩增牛PLIN1 基因启动子区域 |
| 3.3.2 重组质粒pGL3-PLIN1 Promoter的鉴定 |
| 3.3.4 双荧光素酶报告系统检测牛PLIN1基因启动子逐段缺失片段活性 |
| 3.3.5 PLIN1基因核心启动子区域关键转录因子的预测和分析 |
| 3.3.6 C/EBPβ,E2F1,PLAG1和SMAD3 结合位点突变对PLIN1 基因启动子活性影响 |
| 3.3.7 siC/EBPβ,siE2F1,siPLAG1和siSMAD3 对各转录因子和PLIN1 基因表达量的影响 |
| 3.3.8 干扰C/EBPβ,E2F1,PLAG1和SMAD3 表达对PLIN1 基因的启动子活性的影响 |
| 3.3.9 C/EBPβ,E2F1,PLAG1和SMAD3 转录因子特异结合PLIN1 基因启动子 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 牛PLIN1基因重组过表达腺病毒和干扰腺病毒包装、对牛脂肪细胞增殖、分化和脂类代谢作用 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 主要仪器与试剂耗材 |
| 4.2.2 实时荧光定量PCR分析 |
| 4.2.3 PLIN1基因过表达腺病毒的包装 |
| 4.2.4 PLIN1基因干扰腺病毒的包装 |
| 4.2.5 细胞免疫荧光 |
| 4.2.6 流式细胞技术分析细胞周期 |
| 4.2.7 细胞edu染色 |
| 4.2.8 蛋白质免疫印迹分析 |
| 4.2.9 油红O染色 |
| 4.2.10 甘油三酯(TG)测定 |
| 4.2.11 数据分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 牛PLIN1 基因CDS区克隆与鉴定 |
| 4.3.2 牛PLIN1基因过表达腺病毒载体的构建与重组腺病毒包装 |
| 4.3.3 牛PLIN1基因干扰腺病毒载体的构建与重组腺病毒包装 |
| 4.3.4 PLIN1基因细胞免疫荧光 |
| 4.3.5 PLIN1基因过表达和干扰腺病毒的效率检测 |
| 4.3.6 干扰和过表达PLIN1基因对牛前体脂肪细胞增殖的影响 |
| 4.3.7 过表达和干扰PLIN1基因对牛脂肪细胞分化的影响 |
| 4.3.8 过表达和干扰PLIN1 对牛脂肪代谢相关基因的mRNA表达水平的影响 |
| 4.3.9 过表达和干扰PLIN1对牛脂肪代谢相关基因的蛋白表达水平的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 基于转录组测序分析PLIN1基因对脂类代谢影响及关键基因挖掘 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 主要仪器设备与试剂耗材 |
| 5.2.2 牛前体脂肪细胞的分离培养及冷冻保存 |
| 5.2.3 牛前体脂肪细胞的复苏、培养及诱导分化 |
| 5.2.4 转录组测序(RNA-Seq)研究 |
| 5.2.5 实时荧光定量PCR分析 |
| 5.2.6 数据分析 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 牛前体脂肪细胞总RNA质量检测 |
| 5.3.2 转录组测序数据质量评估 |
| 5.3.3 转录组测序的可变剪切(AS)事件分析 |
| 5.3.4 基因表达水平及RNA-Seq相关性分析 |
| 5.3.5 转录组差异表达基因筛选 |
| 5.3.6 转录组测序差异表达基因的RT-PCR验证 |
| 5.3.7 转录组差异基因GO富集分析 |
| 5.3.8 转录组差异基因KEGG富集分析及调控通路 |
| 5.3.9 转录组差异基因与脂类代谢相关的KEGG通路分析 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 秦川肉牛脂肪细胞small RNA测序及转录组测序关联分析 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 主要仪器设备与试剂耗材 |
| 6.2.2 牛前体脂肪细胞的分离培养及冷冻保存 |
| 6.2.3 牛前体脂肪细胞的复苏、培养及诱导分化 |
| 6.2.4 small RNA测序(small RNA-Seq)研究 |
| 6.2.5 small RNA测序数据处理及生物信息学分析 |
| 6.2.6 数据分析 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 small RNA测序结果分析 |
| 6.3.2 参考序列比对结果 |
| 6.3.3 miRNA碱基偏好性 |
| 6.3.4 已知miRNA、新mi RNA预测、ncRNA和 sRNA分类注释统计的分析 |
| 6.3.5 miRNA表达及差异分析 |
| 6.3.6 整合分析RNA-seq与 small RNA-seq |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 第七章 结论 |
| 7.1 实验结论 |
| 7.2 创新点 |
| 7.3 展望 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（7）Pdx1、Ngn3、Sox9、Pax4和Nkx2.2不同组合重编程犬ADSCs成为IPCs的研究（论文提纲范文）
| 基金项目 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 糖尿病研究现状 |
| 1.2 干细胞治疗与糖尿病 |
| 1.2.1 胚胎干细胞与糖尿病 |
| 1.2.2 胰腺干细胞与糖尿病 |
| 1.2.3 肝脏干细胞与糖尿病 |
| 1.2.4 间充质干细胞与糖尿病 |
| 1.3 胰岛β细胞发育相关基因的研究进展 |
| 1.3.1 胰十二指肠同源盒基因1(Pdx1) |
| 1.3.2 神经元素3(Ngn3) |
| 1.3.3 SRY盒基因9(Sox9) |
| 1.3.4 配对盒同源基因4(Pax4) |
| 1.3.5 NK转录因子相关同源盒基因家族2基因座位2(Nkx2.2) |
| 1.3.6 ETS癌基因转录因子家族Fev基因(Fev) |
| 1.3.7 GATA结合蛋白4 基因(Gata4) |
| 1.3.8 其他胰岛β细胞发育相关基因 |
| 1.4 多基因共表达载体的研究进展 |
| 1.5 外源基因转染细胞技术的研究进展 |
| 1.6 研究的目的意义 |
| 第二章 Sox9、Fev和 Gata4 分别转染诱导犬ADSCs分化效果的比较 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要试剂、菌株及仪器 |
| 2.1.2 试剂配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 犬脂肪间充质干细胞的复苏 |
| 2.2.2 犬Sox9、Fev和 Gata4 基因的获取 |
| 2.2.3 Sox9、Fev和 Gata4 过表达真核载体的构建及转染 |
| 2.2.4 Sox9、Fev和 Gata4 过表达腺病毒载体的构建及转染 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 犬脂肪间充质干细胞的复苏结果 |
| 2.3.2 犬Sox9、Fev和 Gata4 基因的PCR扩增结果 |
| 2.3.3 Sox9、Fev和 Gata4 过表达真核载体的构建及转染结果 |
| 2.3.4 Sox9、Fev和 Gata4 过表达腺病毒载体的构建及转染结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 真核表达载体与腺病毒表达载体效果比较 |
| 2.4.2 Sox9、Fev和 Gata4 基因过表达诱导效果比较 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 多基因共表达腺病毒载体的构建 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 主要试剂、菌株及仪器 |
| 3.1.2 试剂配制 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 犬Pdx1、Ngn3、Sox9、Pax4和Nkx2.2 基因的获取 |
| 3.2.2 腺病毒表达载体p Ad Track-CMV的扩增及双酶切 |
| 3.2.3 腺病毒穿梭载体的构建及鉴定 |
| 3.2.4 腺病毒骨架载体的构建与鉴定 |
| 3.2.5 腺病毒载体在293A细胞中的包装及过表达效果检测 |
| 3.2.6 腺病毒感染犬ADSCs后外源基因的表达效果检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 目的基因PCR扩增结果 |
| 3.3.2 腺病毒穿梭载体重组克隆产物的鉴定结果 |
| 3.3.3 腺病毒骨架载体重组克隆产物的鉴定结果 |
| 3.3.4 腺病毒载体在293A细胞中的包装及过表达效果检测 |
| 3.3.5 腺病毒感染犬ADSCs后外源基因的表达效果检测 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 多基因共表达腺病毒感染犬ADSCs的诱导效果比较 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 主要试剂、菌株及仪器 |
| 4.1.3 试剂配制 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 犬胰岛的分离培养与鉴定 |
| 4.2.2 多基因共表达腺病毒感染犬ADSCs后的诱导效果检测 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 犬胰岛双硫腙染色鉴定结果 |
| 4.3.2 多基因共表达腺病毒感染犬ADSCs后的诱导效果检测 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）整合嗜神经病毒示踪和磁共振成像建立解析神经网络的新技术（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 大脑网络简介 |
| 1.2 大脑网络研究方法 |
| 1.2.1 嗜神经病毒在脑网络研究中的应用 |
| 1.2.2 MRI在脑网络研究中的应用 |
| 1.3 脑网络研究中嗜神经病毒与MRI的结合及应用现状 |
| 1.3.1 光遗传/化学遗传刺激结合fMRI记录 |
| 1.3.2 光纤记录结合fMRI记录 |
| 1.3.3 MRI分子探针结合嗜神经病毒用于神经网络研究的探讨 |
| 1.3.4 MRI报告基因与嗜神经病毒的结合用于结构神经环路示踪的探讨 |
| 1.4 本文的技术路线图 |
| 第2章 携带铁蛋白基因的嗜神经病毒在神经环路示踪中的应用 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 VSV相关质粒构建与病毒制备 |
| 2.2.2 实验动物 |
| 2.2.3 病毒注射 |
| 2.2.4 取材及样本制备 |
| 2.2.5 MRI实验 |
| 2.2.6 免疫组化、普鲁士蓝染色及荧光成像 |
| 2.2.7 数据处理及统计分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 rVSV-dG-Ferritin-EGFP在活体脑组织中显示MRI造影效果 |
| 2.3.2 rVSV-Ferritin-EGFP具有顺向跨多突触传播的特性 |
| 2.3.3 rVSV-Ferritin-EGFP标记的神经环路的离体MRI与荧光成像结果 |
| 2.3.4 免疫组织化学与普鲁士蓝染色验证组织内铁蛋白与铁沉积的定位 |
| 2.3.5 对于FerritinEGFP组中MRI信号与绿色荧光信号的关系的探讨 |
| 2.3.6 rAAV-retro-CAG-Ferritin-WPRE-pA引起活体大脑组织的T_2加权暗信号 |
| 2.3.7 注射rAAV-retro-CAG-Ferritin-WPRE-pA后不同时间点的大脑活体MRI结果 |
| 2.4 实验结果小结与讨论 |
| 2.4.1 FerritinEGFP组中病毒携带的Ferritin表达量、铁富集变化与MRI信号改变程度三者之间的关系 |
| 2.4.2 工具病毒结合MRI报告基因用于结构神经环路示踪的方法的优势及局限 |
| 2.4.3 活体水平神经环路示踪的应用 |
| 第3章 化学遗传学BOLD-fMRI方法在神经环路示踪中的应用 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验动物与病毒信息 |
| 3.2.2 病毒注射 |
| 3.2.3 动物行为学实验 |
| 3.2.5 MRI实验 |
| 3.2.6 fMRI数据分析 |
| 3.2.7 取材、样本制备、免疫组化及荧光成像 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 rAAV-DIO-hsyn-hM3D (Gq) -mCherry在VTA多巴胺能神经元中的表达 |
| 3.3.2 激活VTA多巴胺能神经元后c-fos蛋白在VTA脑区的表达情况 |
| 3.3.3 激活VTA多巴胺能神经元导致大鼠自由运动增加 |
| 3.3.4 激活VTA多巴胺能神经元引起的全脑BOLD信号响应 |
| 3.3.5 VTA多巴胺能神经元的多级输出网络示踪结果 |
| 3.3.6 rAAV-DIO-hsyn-hM3D (Gq) -mCherry在VTA的CamKⅡ阳性神经元中的表达 |
| 3.3.7 激活VTA的CamKⅡ阳性神经元后c-fos蛋白在VTA脑区的表达情况 |
| 3.3.8 激活VTA的CamKⅡ阳性神经元导致大鼠自由运动增加 |
| 3.3.9 激活VTA的CamKⅡ阳性神经元引起的全脑BOLD信号响应 |
| 3.4 实验结果小结与讨论 |
| 3.4.1 VTA多巴胺能神经元的多巴胺释放与BOLD信号的关系 |
| 3.4.2 多级输出网络HSV示踪结果与fMRI结果的比较 |
| 3.4.3 使用FLASH序列与基于EPI采样方式的序列进行BOLD-fMRI实验的比较 |
| 第4章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 英文简写及中英文全称 |
| 附录 常用溶液配方 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（9）miR1976/CD105/整合素αvβ6通路在大肠杆菌与金黄色葡萄球菌感染致阴道炎中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1、阴道粘膜生态系统 |
| 2、阴道微生态系统 |
| 3、宿主与阴道微生物群在健康与疾病中的相互作用 |
| 4、阴道大肠杆菌在女性健康与疾病中的相互作用 |
| 4.1 大肠杆菌与流产 |
| 4.2 大肠杆菌与死产 |
| 4.3 大肠杆菌与自发性早产 |
| 4.4 大肠杆菌与产妇败血症 |
| 5、阴道金黄色葡萄球菌在女性健康与疾病中的相互作用 |
| 6、microRNA在女性阴道感染中的作用 |
| 1、材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 2、实验方法 |
| 2.1 阴道炎模型的构建及腺病毒注射小鼠阴道炎模型构建 |
| 2.2 蛋白质印迹 |
| 2.3 HE染色 |
| 2.4 冰冻切片制作及荧光观察 |
| 2.5 RNA提取、反转录与实时定量PCR |
| 2.6 统计学方法 |
| 3、结果 |
| 4、讨论 |
| 5、结论 |
| 6、参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 攻读学位期间申请专利情况 |
| 致谢 |
（10）重组腺病毒表达PD-1单抗（Nivolumab）的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 免疫检查点抑制剂概述 |
| 1.1.1 PD-1/PD-L1 抑制剂概述 |
| 1.1.2 Nivolumab概述 |
| 1.2 PD-1/PD-L1 通路概述 |
| 1.2.1 PD-1/PD-L1 的发现 |
| 1.2.2 PD-1/PD-L1 作用机制 |
| 1.2.3 PD-1 与急性感染 |
| 1.3 基因治疗载体 |
| 1.3.1 腺病毒 |
| 1.3.2 腺相关病毒 |
| 1.3.3 逆转录病毒 |
| 1.3.4 慢病毒 |
| 1.3.5 单纯疱疹病毒 |
| 1.3.6 质粒DNA |
| 1.4 腺病毒载体与基因治疗 |
| 1.5 腺病毒载体介导的抗体表达 |
| 1.6 本论文研究内容 |
| 第2章 实验材料 |
| 2.1 分子生物学试剂 |
| 2.2 腺病毒纯化试剂 |
| 2.3 免疫印迹实验相关试剂 |
| 2.4 免疫学检测相关试剂 |
| 2.5 细胞株 |
| 2.6 抗体 |
| 2.7 质粒与菌株 |
| 2.8 细胞培养 |
| 2.9 细菌培养 |
| 2.10 抗体纯化相关试剂 |
| 2.11 主要实验仪器 |
| 第3章 实验方法 |
| 3.1 重组腺病毒表达质粒的构建 |
| 3.1.1 目的基因Nivolumab的获得 |
| 3.1.2 穿梭质粒pUC57-Nivo的构建 |
| 3.1.3 重组腺病毒质粒的构建 |
| 3.2 重组腺病毒的包装 |
| 3.3 重组腺病毒的扩增 |
| 3.4 重组腺病毒的纯化 |
| 3.5 重组腺病毒基因组的鉴定 |
| 3.6 重组腺病毒Nivolumab体外表达 |
| 3.6.1 蛋白免疫印迹检测Nivolumab的表达 |
| 3.6.2 夹心ELISA检测Nivolumab表达量 |
| 3.7 夹心ELISA检测重组腺病毒目的基因在体内的表达 |
| 3.8 蛋白免疫印迹检测癌细胞系PD-1 的表达 |
| 3.9 间接免疫荧光检测Ad-anti-PD-1 单抗的结合特异性 |
| 3.10 间接ELISA检测Ad-anti-PD-1 单抗的亲和力 |
| 3.11 Hu5-Nivo抗体的纯化 |
| 3.12 PR8 流感感染小鼠结合Hu5-anti-PD-1 处理 |
| 3.13 分离外周血淋巴细胞 |
| 3.14 重组腺病毒表达单抗与淋巴细胞表面PD-1 结合实验 |
| 3.15 流式细胞术分析流感感染小鼠淋巴细胞 |
| 第4章 实验结果 |
| 4.1 重组腺病毒质粒的构建及鉴定 |
| 4.2 重组腺病毒的获得及鉴定 |
| 4.3 重组腺病毒体外表达Nivolumab单抗 |
| 4.4 重组腺病毒体内表达Nivolumab单抗及和PD-1 的相互结合 |
| 4.5 Ad-anti-PD-1 表达的单抗具有与商业化Nivolumab类似的生物活性 |
| 4.6 Ad-anti-PD-1 能阻断流感模型小鼠T细胞表面PD-1 通路 |
| 第5章 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
四、快速构建腺病毒载体的新方法（论文参考文献）
- [1]共表达Apoptin与MEL基因重组腺病毒的构建及其对肝癌抑制作用研究[D]. 武静桥. 天津农学院, 2021(08)
- [2]IL-28B通过下调调节性T细胞抗肝癌的机制研究[D]. 李志. 兰州大学, 2021
- [3]TRAIL修饰溶瘤腺病毒靶向治疗急性髓系白血病的研究[D]. 王子璇. 吉林大学, 2020(08)
- [4]重组慢病毒介导的BMP2和TGF-β3共转染修饰大鼠骨髓基质干细胞在脊柱融合中成骨分化的协同作用[D]. 何武兵. 南方医科大学, 2020
- [5]Pdx1、Ngn3、Mnx1、Mafa和Pax4组合转染诱导犬ADSCs向IPCs分化的研究[D]. 阮晨梅. 西北农林科技大学, 2020
- [6]牛PLIN1基因转录调控机制及其对前体脂肪细胞增殖、分化和脂类代谢的作用研究[D]. 李世军. 西北农林科技大学, 2020
- [7]Pdx1、Ngn3、Sox9、Pax4和Nkx2.2不同组合重编程犬ADSCs成为IPCs的研究[D]. 高登科. 西北农林科技大学, 2020
- [8]整合嗜神经病毒示踪和磁共振成像建立解析神经网络的新技术[D]. 郑宁. 中国科学院大学(中国科学院武汉物理与数学研究所), 2019(02)
- [9]miR1976/CD105/整合素αvβ6通路在大肠杆菌与金黄色葡萄球菌感染致阴道炎中的作用及机制研究[D]. 蒋莉莎. 南京医科大学, 2019(04)
- [10]重组腺病毒表达PD-1单抗（Nivolumab）的研究[D]. 王旭晨. 中国科学院大学(中国科学院上海巴斯德研究所), 2019(07)