一、乳蛋白基因在转基因动物乳腺细胞中特异性表达的研究进展（论文文献综述）
张婷[1]（2021）在《转基因兔乳汁中重组吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂的纯化、结构分析和药效研究》文中研究指明近年来,血栓性疾病越发受到关注,临床上有逐年渐增之势,严重威胁人类的生命健康。用溶栓药消除血栓是一种临床常用的方法。现有的溶栓药虽然有明确的治疗效果,但也存在治疗窗口期窄,用药量大,纤维蛋白特异性低,再灌注率低,系统出血率高,半衰期短,副作用大等问题。而纤维蛋白特异性高,溶栓效率高,出血风险低,半衰期长,毒副作用低的吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂（Desmodus rotundus salivary plasminogen activator alpha 1,DSPAα1）又称去氨普酶（desmoteplase）,有望成为新型、高效的溶栓药物。本研究应用哺乳动物转基因技术,在获得了乳腺特异性表达重组DSPA（recombinant DSPA,rDSPA）转基因兔的基础上,收集兔乳中的表达产物,应用自制的单克隆抗体,用于兔乳的ELISA和Western-blot检测;建立从转基因兔乳汁中分离和纯化rDSPA的方法;对rDSPA进行一级结构和生物活性分析,包括N端和C端氨基酸序列、相对分子量以及体外溶纤活性;应用角叉菜胶制备大鼠尾部血栓模型,并通过此血栓模型研究纯化产物rDSPA的体内溶栓效果及血浆半衰期。1.乳腺特异性表达rDSPA转基因兔的传代繁殖两只原代兔经扩群繁殖、近交和回交,获得乳腺特异性表达rDSPA转基因兔134只,其中经测交确定纯合子兔2只（F2代）。收集兔乳,离心分离乳清,经ELISA检测,兔乳中rDSPA表达水平为1.19±0.26 mg/mL,纤维平板溶圈法（Fibrin Agarose Plate Assay,FAPA）检测F0代、F1代、F2代转基因兔乳清中DSPA的溶纤活性,溶圈直径大小基本一致（18.6-20.4 mm）,结果表明外源基因rDSPA能稳定遗传给后代,此外培育出的纯合子兔能免除繁琐的基因型检测工作量,为rDSPA的转基因兔的保种提供了保障。2.原核表达去氨普酶（DSPA）基因载体的构建采用分子生物学技术,用PCR法扩增pCL25/DSPA表达载体上的编码DSPAαl成熟肽的DNA序列,用于与原核表达载体连接,构建pET-28a/DSPA原核表达载体。pET-28a/DSPA原核表达载体转入Rosetta感受态细胞,进行诱导表达目的蛋白。SDS-PAGE电泳估测大小约为50 kDa。目的蛋白纯化后纯度为92%,远远满足其作为制备rDSPA单克隆抗体的免疫原的纯度要求。3.rDSPA单克隆抗体制备及筛选纯化的原核表达产物加弗氏佐剂免疫BALB/c小鼠,分离B淋巴细胞与SP2/0细胞融合,筛选获得阳性杂交瘤细胞株,分泌PR-mAb杂交瘤细胞注入同系小鼠腹腔制备抗体。本研究共得到36株阳性杂交瘤细胞,从中筛选出12株稳定分泌抗体的细胞株（命名M1-M12）。经ELISA-elution筛选,其中M3、M4两株为多羟基反应单克隆抗体（PR-mAb）,筛选率为16.67%（2/12）。注射M3和M4细胞株的小鼠腹水的抗体效价为1:125000,腹水抗体可用于ELISA和western blot检测。4.转基因兔乳中rDSPA的分离、纯化小鼠腹水抗体经rProtein A亲和层析柱纯化后与CNBr-activated Bestarose 4 FF介质偶联制成免疫亲和层析柱。rDSPA转基因兔乳经超速离心和硫酸铵沉淀预处理后。分别选用自制免疫亲和层析、苯甲醚亲和层析、阳离子交换层析、赖氨酸亲和层析和活性蓝亲和层析纯化rDSPA。结果表明rDSPA转基因兔乳通过超速离心、55%硫酸铵沉淀、苯甲醚亲和层析、阳离子交换层析、赖氨酸亲和层析和活性蓝亲和层析分离纯化,获得纯度为98%的rDSPA。运用阴离子交换层析去除纯化产物中的内毒素,使用内毒素检测试剂盒检测结果表明纯化rDSPA内毒素含量低于0.015 EU/mL,符合注射剂标准。5.乳腺特异性表达rDSPA纯化产物的结构和功能检测运用Edman降解法测定rDSPA的N端氨基酸序列,结果显示rDSPA的N端氨基酸序列为 Val Ala Cys Lys Asp Glu IIe Thr Gln Met Thr Tyr Arg Arg Gln,与设计的 DSPA编码序列的理论N端的第4-18位氨基酸序列完全一致,表明rDSPA编码序列N-端的山羊β-乳球蛋白（β-lactoglobulin）的信号肽已完全切除;运用液相色谱-质谱/质谱联用技术（LC-MS/MS）测定rDSPA的C端氨基酸序列及其它部分的氨基酸序列,结果显示 rDSPA 的 C 端氨基酸序列为 Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr Lys Tyr Leu Gly Trp IIe Arg Asp Asn Met His Leu,与设计的rDSPA编码序列的C末端完全一致,共有47%（208个氨基酸）的序列与DSPA编码序列完全同源。经高分辨率质谱仪检测后确定rDSPA的相对分子量为53126.75 Da,大于理论的49535.94 Da,推测是翻译后的糖基化修饰导致;运用纤维平板溶圈法（FAPA）检测纯化产物rDSPA的体外纤溶活性（773333 IU/mg）略高于阿替普酶（580000 IU/mg）。6.rDSPA体内外溶栓效果的初步评价SD大鼠腹主动脉采血,血凝块切成约0.1 cm3方块并称重,分成7组（0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL DSPA;0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL 阿替普酶;生理盐水）,37℃孵育16 h,称重剩余血凝块并计算血凝块溶解率。结果显示rDSPA体外大鼠血凝块溶解率（48.34±2.25%）明显高于阿替普酶组（40.91±1.36%）的血凝块溶解率（p<0.05）,表明rDSPA体外溶栓活性强于阿替普酶。8周龄的雄性SD大鼠随机分成4组,每组6只,分成低、中、高剂量rDSPA组（2 mg/kg、8 mg/kg、32mg/kg）和阿替普酶组（8 mg/kg）,安慰剂组,空白对照组。各组大鼠心脏采血检测凝血活酶时间（APTT）、凝血酶原时间（PT）、凝血酶时间（TT）,纤维蛋白原（FIB）和D-二聚体,同时测量大鼠尾部血栓长度。结果显示rDSPA有显着的溶栓效果,rDSPA低（APTT:18.80±1.26 s;TT:35.75±0.41 s）、中（APTT:27.78±1.88 s;TT:39.18±0.82 s）、高（APTT:36.51±1.29 s;TT:37.56±1.07 s）剂量组和阿替普酶组（APTT:27.00±1.76 s;TT:34.05±0.99 s）的 APTT、TT 均较安慰剂组（APTT:12.53±0.54 s;TT:26.87±1.31 s）相比有所延长,且差异极显着（p<0.01）,rDSPA 中（PT:14.28±0.79 s;D-二聚体:2.49±0.07 mg/L）、高（PT:17.07±1.19 s;D-二聚体:3.12±0.55 mg/L）剂量组和阿替普酶组（PT:14.26±0.93 s;D-二聚体:2.53±0.12 mg/L）的PT、D-二聚体水平均比安慰剂组（PT:12.29±0.76 s;D-二聚体:2.30±0.07 mg/L）显着升高（p<0.05）,表明大鼠注射rDSPA和阿替普酶后都有效激活纤溶系统。阿替普酶组（200.22±6.09mg/dL）较rDSPA低（222.40±7.89 mg/dL）、中（228.30±1.72mg/dL）、高（228.19±1.89mg/dL）剂量组的 FIB 水平较有所下降（p<0.05）,rDSPA低、中、高剂量组之间的FIB水平差异不显着,表明rDSPA在溶栓过程中FIB消耗量小于阿替普酶,相比阿替普酶不易引起颅内出血副作用,更具有安全性。rDSPA低（48.96±9.42%）、中（24.71±6.26%）、高（0.00±0.00%）剂量组和阿替普酶组（49.19±6.21%）的大鼠尾栓相对长度百分比明显小于安慰剂组（67.76±6.06%）,即rDSPA低、中、高剂量组的尾栓消溶相对长度明显长于安慰剂组,并与剂量成正比例,且rDSPA高剂量组大鼠尾部不形成血栓。相同剂量的rDSPA中剂量组（24.71±6.26%）和阿替普酶组（49.19±6.21%）的大鼠尾栓相对长度百分比差异极显着（p<0.01）,表明纯化产物rDSPA的溶栓能力明显优于阿替普酶。8周龄的SD雄性大鼠随机分成2组,每组4只,分为rDSPA组和阿替普酶组。rDSPA组和阿替普酶组均以8 mg/kg的剂量尾静脉注射rDSPA或阿替普酶,采集血浆进行纤溶酶-抗纤溶酶复合物（PAP）的测定,计算rDSPA半衰期。结果显示rDSPA组和阿替普酶组大鼠血浆PAP浓度分别在6 min及3 min达到顶峰（133.06±63.90 ng/mL,219.44±1.18 ng/mL）,rDSPA和阿替普酶在SD大鼠体内的血浆半衰期分别为52.41 min和10.41 min。推算rDSPA的半衰期较阿替普酶延长5倍,表明rDSPA可用于单次注射针剂溶栓药的制备。综上所述,本研究成功培育出乳腺特异性表达rDSPA转基因兔,且rDSPA转基因兔具有较高的表达水平,建立了有效的分离纯化的实验室工艺,并保持原有的溶纤溶栓活性,表明该研究迈出临床应用的第一步。rDSPA的一级结构分析表明,重组DSPA编码序列可以在转基因兔乳腺上皮细胞中表达,并剪切去除异源性的信号肽序列,翻译后加工为有溶栓活性的成熟蛋白,这一结果在国内外尚未见报道。大鼠体内外溶栓试验中rDSPA表现出优于阿替普酶的溶栓性能,且rDSPA在大鼠体内的半衰期长于阿替普酶,体内溶栓试验呈现出更安全、更持续的溶栓效果,该结果在国内外也未见报道。本研究成果为开发和生产新的高效溶栓药奠定了实验基础。
华荣茂[2]（2021）在《体外重组装人促卵泡激素的制备及转基因小鼠模型的构建》文中研究指明促卵泡激素（FSH）是一种糖蛋白类激素,它是由FSHα亚基和FSHβ亚基通过非共价键组成的异源二聚体蛋白。解离分开的FSHα亚基和FSHβ亚基都不具备生物学功能,只有两个亚基正确的组装在一起才具备生物学功能。在女性体内,FSH的主要作用是刺激卵泡的发育、排卵和子宫内膜的生长。在男性体内,FSH的主要作用是刺激精子的产生和次级精母细胞的发育,并通过与促黄体生成素（LH）及雄激素的协同作用来刺激精子发育成熟。在临床上,FSH主要用于试管婴儿的制备以及不孕不育的治疗。目前上市的FSH产品主要有尿源FSH（uh FSH）和基因工程重组FSH（rh FSH）。尿源FSH来源不均一、纯化工艺较复杂,并且存在其他蛋白的残留,生物活性也不如rh FSH。rh FSH来源均一、生物活性好,且便于提取。目前上市的rh FSH产品主要由哺乳动物细胞生产,如商业化的rh FSH产品Puregon和Gonal-F,它们都是由中国仓鼠卵巢细胞（CHO）细胞分泌的,然而细胞制备的rh FSH蛋白产量相对较低且价格昂贵。随着转基因技术的发展,利用动物乳腺生物反应器来制备外源重组蛋白是一种富有前景的方法。动物乳腺生物反应器制备的外源蛋白有完整的翻译后修饰,且它们和天然的蛋白结构相似,最重要的是产量高。但是,国内外未见利用转基因大动物乳腺生物反应器来制备rh FSH蛋白药物的研究报导,主要原因是很多研究发现过量的具备生物活性的FSH积累在动物乳腺内会引发动物疾病乃至肿瘤,这预示着利用大动物乳腺制备FSH会对动物造成潜在的不良影响。因此如何实现利用大动物乳腺制备出rh FSH蛋白,同时又能避免因为有生物活性的FSH积累可能导致的转基因动物患肿瘤的风险,这仍需进一步研究和探索。本研究围绕上述问题进行了五个方面的研究工作,并获得了如下结果。（1）人FSHα、FSHβ亚基蛋白的表达通过构建p IRES-Hyg3-FSHα及p IRES-Neo-FSHβ/His真核表达载体,在CHO细胞中分别表达人FSHα、FSHβ亚基基因,获得了能够稳定表达人FSHα、FSHβ亚基蛋白的细胞株CHO-FSHα以及CHO-FSHβ。利用p Ad-FSHα及p Ad-FSHβ/His腺病毒表达载体在HEK 293A细胞中包装获得包含FSHα、FSHβ基因的重组腺病毒Ad-FSHα、Ad-FSHβ。通过腺病毒介导FSHα、FSHβ基因在牛乳腺上皮细胞、羊乳腺上皮细胞（GMECs）以及羊乳腺中暂态表达,结果显示,在牛乳腺上皮细胞、GMECs以及羊乳腺中均能成功制备FSHα、FSHβ亚基蛋白,FSHα、FSHβ亚基蛋白经过PNGase F酶切分析发现它们都具备N端的糖基化修饰。（2）人FSHα、FSHβ亚基蛋白体外重组装方法的建立CHO细胞表达的FSHα、FSHβ亚基蛋白经过纯化后分别以不同的浓度在4℃按照1:1的摩尔比进行体外重组装,His tag pull-down试验表明CHO细胞表达的FSHα、FSHβ亚基蛋白能够在体外组装成一定的蛋白结构。ELISA结果显示,随着FSHα、FSHβ亚基蛋白浓度的升高,两个亚基蛋白的体外重组装效率也越高。利用建立的亚基蛋白体外重组装方法对牛乳腺上皮细胞、GMECs以及羊乳腺表达的FSHα、FSHβ亚基蛋白进行体外重组装,结果发现牛乳腺上皮细胞、GMECs以及羊乳腺表达的FSHα、FSHβ亚基蛋白都能够在体外进行重新组装,进一步证明了本研究建立的FSHα、FSHβ亚基蛋白体外重组装方法的有效性。（3）体外重组装rh FSH生物活性恢复技术及生物活性研究通过对FSHα、FSHβ亚基蛋白体外重组装后体外稳定性环境条件（温度、浓度、p H值）进一步的优化,发现体外重组rh FSH在4℃、p H 7.4以及高浓度下具备更好的稳定性。对CHO细胞、牛乳腺上皮细胞、GMECs以及羊乳腺表达的体外重组装rh FSH生物活性进行分析,结果表明,在4℃、p H 7.4条件下体外重组装rh FSH能够促使表达在HEK 293/SNAP-FSHR细胞膜上的FSHR受体内吞,同时显着刺激细胞产生环磷酸腺苷（c AMP）（P<0.01）。另外,一定剂量（6 pmol,8×）的体外重组装rh FSH能够显着促进大鼠卵巢增重（P<0.01）,并刺激大鼠卵泡成熟以及子宫内膜的生长。同时,10 pmol的体外重组装能够显着增加小鼠的排卵数（P<0.01）,其效果和Gonal-F相当。以上结果表明,本研究成功建立了体外重组装rh FSH生物活性恢复技术,CHO细胞、牛乳腺上皮细胞、GMECs以及羊乳腺制备的重组装rh FSH在体外重新恢复了生物活性。（4）基于CRISPR/Cas9技术在山羊β-乳球蛋白基因座定点整合人FSHα、FSHβ基因打靶体系的建立基于CRISPR/Cas9技术构建了针对山羊β-乳球蛋白（BLG）基因座第二外显子区域定点整合FSHα和FSHβ基因的2个基因打靶载体p Cas9-sg1、p Cas9-sg2和含目的基因的Donor载体p GHA-FSHα、p GHA-FSHβ/His,并利用GMECs细胞筛选出了具备打靶活性的p Cas9-sg2载体。将Donor载体p GHA-FSHα、p GHA-FSHβ/His分别与p Cas9-sg2共转染GMECs细胞后,筛选出2株稳定表达FSHα-G、FSHβ-G蛋白的GMECs阳性克隆细胞株,经过糖基化和唾液酸化分析发现GMECs细胞表达的FSHα-G、FSHβ-G具备N端糖基化修饰以及唾液酸化。将GMECs细胞表达的FSHα-G、FSHβ-G亚基蛋白体外重组装成rh FSH-G,利用体内、体外生物活性试验进一步检测重组装rh FSH-G蛋白的生物学活性,结果表明rh FSH-G蛋白同样能够促使其受体FSHR内吞,并且刺激细胞产生c AMP。注射一定剂量的重组装rh FSH-G能够明显的促进小鼠排卵、大鼠卵巢增重、卵泡成熟以及子宫内膜的生长,并且呈现剂量依赖性。另外,基于建立的CRISPR/Cas9体系,构建了转FSHα和FSHβ基因的羊胎儿成纤维细胞,筛选出的两株阳性克隆细胞株中分别含有FSHα和FSHβ基因的整合。综上所述,本研究基于CRISPR/Cas9技术建立了有效的基因打靶体系,并利用该体系获得了转人FSHα和FSHβ基因羊胎儿成纤维细胞,为将来转基因羊的制备奠定了研究基础。（5）转人FSHα、FSHβ基因小鼠的制备及其功能研究将构建的pBC1-FSHα和p BC1-FSHβ/His乳腺特异性表达载体显微注射到小鼠受精卵中制备转基因小鼠,经过PCR鉴定,分别制备得到1只转FSHα基因的阳性母鼠和2只转FSHβ基因的阳性母鼠,通过Western blotting和ELISA分析转基因小鼠乳汁中目的蛋白的表达,结果显示获得的转基因小鼠乳汁中含有FSHα和FSHβ目的蛋白的表达,免疫组化分析结果进一步证实了FSHα、FSHβ目的蛋白表达在转基因母鼠乳腺腺泡内壁。利用建立的亚基蛋白体外组装技术和体外重组装rh FSH恢复技术将转基因小鼠乳腺表达的FSHα、FSHβ亚基蛋白进行体外组装和组装后生物活性鉴定,结果表明,转基因小鼠乳腺表达的FSHα、FSHβ亚基蛋白在体外组装成了具备生物活性的重组装rh FSH。对转基因小鼠乳腺和卵巢进行组织形态学分析发现,转FSHα及FSHβ基因小鼠的乳腺和卵巢组织形态与野生型小鼠卵巢形态无明显差异。总之,本研究成功制备了乳腺表达FSHα、FSHβ蛋白的转基因小鼠,更重要的是从转基因动物层面初步证明了转基因小鼠乳腺和卵巢组织未受到转基因带来的影响。综上所述,本研究创新性的建立了FSHα、FSHβ亚基蛋白的体外重组装方法。另外,通过建立重组装rh FSH体外生物活性恢复技术,将CHO细胞、牛乳腺上皮细胞、GMECs以及羊乳腺中制备的体外重组装rh FSH生物活性进行了恢复。利用CRISPR/Cas9技术针对山羊BLG基因座构建了定点整合FSHα、FSHβ目的基因的转基因体系,并获取了转FSHα、FSHβ目的基因的羊胎儿成纤维细胞。最后,通过制备的转FSHα、FSHβ基因小鼠模型进一步验证了FSHα、FSHβ亚基蛋白体外重组装技术的有效性,初步证实了转FSHα、FSHβ基因小鼠乳腺及卵巢组织未明显受到转基因过程带来的影响。总之,本研究为将来通过转基因大动物乳腺生物反应器生产体外重组装rh FSH蛋白奠定了基础。
王锦[3]（2013）在《水牛乳腺基因表达谱与生长激素转基因水牛的初步研究》文中进行了进一步梳理水牛是中国南方极具开发潜力的主要家畜,具有耐粗饲、乳品品质好等优点。但由于我国本地水牛产奶性能低下,致使奶水牛产业的发展缓慢。因此,如何应用现代生物技术培育出高产奶量的水牛新品种是目前要解决的主要问题。本研究首先分析了水牛泌乳期和非泌乳期乳腺组织基因表达谱,寻找差异表达基因,研究水牛的泌乳机制,并为培育高产奶量的转基因水牛提供丰富的候选基因素材；然后,探索转座子系统在水牛转基因中的应用,以期提高水牛转基因的效率；构建了乳腺特异性生长激素基因（GH）转基因表达载体,在乳腺细胞和乳腺组织中进行检测,分析外源GH基因的表达对乳蛋白等基因表达的影响；最后,采用随机整合、转座子主动整合等转基因技术将重组GH基因导入水牛基因组,生产GH转基因的水牛胚胎,以期培育出高产奶量转基因水牛新品种。本研究取得的主要结果总结如下：1.水牛泌乳期与非泌乳期基因表达谱及差异表达分析。构建水牛泌乳期和非泌乳期乳腺组织基因表达谱,分析差异表达和泌乳期高丰度表达的基因,探讨水牛泌乳的分子机制,也为转基因水牛提供外源基因乳腺泌乳期特异性表达启动子。基因表达谱序列拼接后获得114,014个单一的Unigenes,与牛的基因组信息比对注释了30290个基因,可以定位到270条相应的通路上（pathway）,其中与乳脂肪、乳蛋白和乳糖合成代谢通路相关基因表达丰度较高。在泌乳期乳腺组织中特异性表达的基因有3053个,占到所有基因序列的2.68%。比较水牛乳腺两个时期基因表达量,泌乳期表达量上调的基因有1390个,下调的基因有5851个。在270条KEGG通路中有228个通路涉及到差异表达基因,如介导生长激素作用的JAK-STAT和MAPK信号通路。实时定量PCR （QRT-PCR）检测到水牛的非泌乳期乳腺组织中有少量的乳蛋白基因表达。K酪蛋白（CN3）基因表达量在非泌乳期与泌乳期乳腺中都是显着高于其它基因。与非泌乳期相比,泌乳期乳腺CN1S1基因表达量增加了6958倍,CN1S2增加了4800倍,kCN和αLA增加了1000倍左右,而β酪蛋白增加了244倍,与测序结果基本一致。泌乳期和非泌乳期的乳腺组织中检测至（?）GHR, PRLR（?）（?）GF1R的表达,说明GH、PRL（?）（?）IGF1可能参与了泌乳的分子调控过程。2.水牛乳腺上皮细胞（BME）基因表达分析。通过PB转座子携带的LT抗原永生化诱导水牛乳腺上皮细胞（BME）,建立检测乳腺转基因表达载体的细胞模型。PB转座子为骨架的永生化载体pXL-BACII-bCN2/LT转染后的BME细胞的腺泡消失速度和成纤维样转变降低。在添加催乳素诱导培养后,第30代的永生化处理的BME细胞能检测到乳蛋白基因的表达。其中CN1S1基因表达量为非泌乳期乳腺的88.32倍,CN3为32.09倍,CN1S2和αLA基因表达量分别为2.8倍和3.3倍。结果表明,初步建立了细胞水平检测乳腺特异性表达载体的体外模型。3.水牛转座子转基因技术方法的建立。本研究通过构建piggyBac （PB）, passport （PP）和sleeping beauty （SB）转座子转基因载体,转染水牛胎儿成纤维细胞（BFF）,同时对转座子转基因系统进行优化,以期建立水牛转座子转基因技术体系。转座子转基因载体转染水牛的胎儿成纤维细胞（BFF）后,均能观察到标记基因EGFP的表达。应用p18T载体、PB、PP和SB转座子表达NEO基因,转染细胞后筛选获得的G418抗性细胞克隆形成数（CFN）差异不显着。与随机整合相比,加入相应的转座酶后,PB转座子系统抗性细胞克隆数量提高了22倍,PP转座子系统提高了8倍,SB转座子提高了14倍,PB转座子系统获得了最高的转基因效率。PB转座子在转座子和转座酶比例（Tn:Ts）为1：l的时候转基因效率最高,而PP和SB转座子为1：0.5。当添加的转座酶质粒过量时,PB转座子的转基因效率下降幅度没有PP和SB转座子大。通过QRT-PCR检测了不同转座子外源基因的整合拷贝数,结果显示：随机整合组每个单倍体基因组整合拷贝数从5个拷贝至51.9个拷贝不等。PB转座子为16.62拷贝,PP转座子为2.5拷贝。SB转座子整合到基因组中的转基因拷贝数最多,单倍体基因组中为98个拷贝。以上结果显示：三种转座子均能应用于水牛的转基因研究,转基因效率优于随机整合转基因。4.生长激素转基因载体构建与细胞水平检测。克隆分析了人、奶牛和水牛的生长激素基因（GH）,PB转座子携带的GH转基因载体转染乳腺细胞和乳腺组织块,研究GH转基因的表达对其乳蛋白等基因表达的影响。结果显示牛、水牛和牦牛之间GH基因的同源性最高,与其它偶蹄目也有较高的同源性,生长激素氨基酸序列也较为保守。将分别携带有人和奶牛GH的piggyBac转座子转基因载体（pXL-BacⅡ-bCN2.8/hGH2.1-EGFP-Neo, PXL-BacⅡ-bCN2.8/hGH2.2-EGFP-Neo）转染人的乳腺癌细胞系（Bcap37）,能观察至（?）EGFP的表达,RT-PCR和western blot均能检测到人和奶牛GH基因的特异性表达。分别用P18T-bGH和PB-bGH转基因载体转染永生化BME细胞后,检测到bGH转基因的表达。p酪蛋白、CN1S1酪蛋白和α乳清白蛋白基因表达量均有显着提高,GHR和IGF1R基因的表达量也有上调。pB-bGH载体转染的水牛乳腺组织块,CN1S1, CN1S2,p酪蛋白和K酪蛋白基因的表达量提高了50倍以上,初步证明GH转基因载体的转染可以显着提高乳蛋白基因的表达水平。5.转GH基因水牛克隆胚胎的生产与早产转基因克隆水牛的检测。使用受精卵胞质注射、卵胞质内单精子注射（ICSI）和转基因体细胞核移植的方法生产转GH基因的水牛胚胎,并对经胚胎移植后的获得的早产转基因克隆水牛进行了鉴定。水牛受精卵胞质注射和水牛卵母细胞内单精子注射（ICSI） PB转座子GH转基因载体和转座酶载体后,均获得EGFP表达的转基因阳性胚胎。以转GH基因BFF为核供体,制备了EGFP表达的转基因克隆水牛囊胚。经胚胎移植后获得了转GH基因克隆水牛的妊娠,于9月龄早产。特定蓝光照射下在早产水牛头侧部能观察到绿色荧光表达,解剖结果显示心、肺、肝、胃和脾发育正常,但大肠,肾脏,生殖系统等发育不良,而且有严重的组织粘连。激光共聚焦显微镜下观察到心、肝、脾、肺、膈肌和肌肉等组织冰冻切片均有较强的EGFP表达。通过PCR检测和染色体步移法检测到早产克隆水牛的各组织中均有外源基因的整合。这些工作为获得乳腺特异性表达GH基因转基因水牛奠定了较好的工作基础。
林建[4]（2013）在《体细胞核移植制备转IGF-1基因奶山羊的研究》文中研究指明目前我国的奶山羊品种与发达国家相比差距明显,缺乏国际竞争力,突出表现为产量奶低,多数羊的年产奶量不足300kg,经济效益不高。为解决这一问题,本研究通过转基因技术培育高产奶量的奶山羊。本试验选取在乳腺发育和泌乳中起着重要作用的类胰岛素生长因子（IGF-1）基因作为转入的目的基因。通过分子生物学的方法,构建了乳腺特异性表达类胰岛素生长因子的载体pIN；然后分别转染人乳腺癌细胞系（Bcap-37）和山羊乳腺上皮细胞（GMEC）以验证乳腺特异性表达载体pIN表达IGF-1的能力,进一步的研究将载体pIN灌注泌乳期山羊乳腺以验证其生物学功能。在确认了载体pIN可以表达IGF-1后,我们使用脂质体法将载体pIN转染山羊胎儿成纤维细胞和小羊耳皮成纤维细胞,通过抗性筛选和单克隆挑选获得转IGF-1基因阳性克隆细胞。将获得的转IGF-1基因阳性克隆细胞通过体细胞核移植技术移植到去核的卵母细胞中,融合激活后待其发育到囊胚期,移植至代孕母羊,最后获得4只克隆奶山羊。提取克隆奶山羊的血液基因组,通过荧光定量PCR、Southern-blot以及TAIL-PCR等方法一方面鉴定本研究获得的克隆羊为转IGF-1基因奶山羊,另一方面检测转IGF-1基因奶山羊中外源IGF-1基因插入的拷贝数以及部分插入位点的侧翼序列。总的来说,转IGF-1基因奶山羊的培育,为通过转基因技术提高山羊奶产量奠定了基础。本研究中主要试验内容分为以下五部分：1.山羊乳腺特异性表达载体的构建及其验证本研究的目的是构建山羊乳腺特异性表达载体pIN,并在体内体外检验载体pIN的生物学活性,为下一步生产高产奶量转基因奶山羊奠定基础。第一步,以萨能奶山羊为材料,采用RT-PCR的方法从奶山羊的肝脏组织中扩增465bp的类胰岛素生长因子1（insulin-like growth factors-1,igf-1）基因；同时以真核表达载体pCDNA3.1为模板,扩增1505bp的真核筛选标记neo基因。第二步,以乳腺特异性表达载体pBC1为骨架载体,先将扩增的igf-1基因插入p-酪蛋白5’端启动子的下游,再将克隆的neo基因克隆到β-酪蛋白3’端终止子的下游,构建乳腺特异性表达载体pIN。第三步,采用脂质体法将构建好的乳腺特异性表达载体pIN转染人乳腺癌细胞系（Bcap-37）和山羊乳腺上皮细胞,同时使用乳腺灌注法将载体pIN导入泌乳期山羊乳腺组织中去检测乳腺特异性表达载体pIN的生物学功能。体外试验结果显示：在Bcap-37细胞中,载体pIN转染组的IGF-1蛋白和mRNA表达量均显着高于对照组（p<0.05）；在山羊乳腺上皮细胞中,转染载体pIN的细胞可以成功诱导表达IGF-1。体内试验结果进一步证实本研究所构建的乳腺特异性表达载体pN可以在山羊乳腺组织中成功表达IGF-1,为增加羊奶产量奠定基础。2.双亲性小分子DMSO和薄荷醇增加转染效率的研究简单、快速和高效地将目的基因转入细胞核将会有利于加速转基因阳性细胞的筛选过程。转染增强剂的使用可以有效的促进外源基因的转运。在众多增强剂中,双亲性小分子化合物二甲基亚枫（DMSO）和薄荷醇可以有效的提高基因的转染效率。本研究首先使用MTT法检测DMSO和薄荷醇的细胞毒性,摸索出对细胞没有伤害或者伤害很小的最适使用浓度；接着在人乳腺癌细胞系（Bcap-37）上,使用荧光定量PCR和流式细胞检测法去评价DMSO和薄荷醇对转染效率的影响。研究结果表明2%（V/V）的DMSO和12.5μM薄荷醇可以显着提高外源基因的转染效率。荧光定量PCR结果显示,在薄荷醇后处理和DMSO前处理的Bcap-37细胞上,生长激素（GH）的mRNA表达量提高了10倍以上；而在DMSO后处理和薄荷醇前处理的Bcap-37细胞上,GH的mRNA表达量则提高了30倍以上。荧光显微镜观察结果和流式细胞检测结果进一步证明DMSO和薄荷醇处理细胞可以增加表达绿色荧光的细胞数量。与单独脂质体转染组相比较,DMSO后处理组和薄荷醇前处理组表达绿色荧光的细胞比例增加了15%。进一步细胞周期分析发现,DMSO和薄荷醇处理均可以显着影响细胞周期,大大的改变了细胞周期停滞的比例。这一结果表明DMSO和薄荷醇可能是通过影响细胞周期来增加转染效率的。总的来说,DMSO和薄荷醇处理细胞均可以显着增加转染效率,其中DMSO后处理细胞的方式可以更有效的增加转染效率3.核定位信号肽增加转染效率的研究转基因阳性细胞筛选效率低下的问题严重限制转基因动物的发展；其中外源DNA片段（尤其是大分子DNA片段）转运进入细胞核是转基因阳性细胞筛选中最重要的限速步骤。研究发现核定位信号（NLS）可以协助大分子亲核蛋白的入核转运；补骨脂素（SPB）可以非共价结合DNA片段以保护其在转运过程中不被核酸酶降解。因此,本研究人工合成经典的核定为信号肽"CGGPKKKRKVP （NLS）"以及核定为信号肽-补骨脂素复合物"SPB-PKKKRKV（SPB-NLS）"去协助大分子DNA片段的转运,希望能够增加转染效率,继而可以应用到转基因阳性细胞的筛选中去。本研究通过荧光定量PCR,激光共聚焦观察以及流式细胞检测等技术对NLS及SPB-NLS的生物学功能进行检测。荧光定量PCR结果显示：在NLS和SPB-NLS介导的转染中,生长激素（GH）的mRNA表达量分别增加了69%和330%。流式细胞检测发现绿色荧光阳性细胞的数量在SPB-NLS组中增加了32.4%；然而在NLS组中,其阳性细胞的数量却减少了75%。进一步试验（western-blot）证实SPB-NLS介导的转染可以显着的增加转染基因的表达效率（在人乳腺癌细胞的研究中,SPB-NLS介导的转染增加了GFP的表达量；在山羊乳腺上皮细胞的研究中,SPB-NLS介导的转染增加了IGF-1的表达量）。最后,本研究通过激光共聚焦显微镜观察发现SPB-NLS介导的转染可以增加外源基因如何的效率。总的来说,本研究证实SPB-NLS是一种优良的转染增强剂,很有希望被广泛用于外源基因的转染以及转基因阳性细胞的筛选。4.转IGF-1基因阳性克隆细胞的筛选及转IGF-1基因奶山羊的制备转基因动物的制备一直以来就是人们关注的焦点和难点,尤其是转基因大型家畜的制备。本研究首先分离培养奶山羊胎儿成纤维细胞和小羊耳皮成纤维细胞,摸索不同浓度的G418对两种细胞的毒性,选取2周内能将细胞全部杀死的临界浓度作为抗性筛选浓度（800ng/mL G418:胎儿成纤维细胞,600ng/mL G418:小羊耳皮成纤维细胞）。然后通过电转染法将乳腺特异性表达载体pIN转染到小羊耳皮成纤维细胞和胎儿成纤维细胞中去。转染48小时后,更换培养基并添加G418进行抗性筛选,筛选10天左右出现明显的单克隆细胞团。此时将G418的浓度降至维持浓度（300ng/mL）,维持3-5天后,挑取单克隆细胞至48孔细胞培养板。待单克隆细胞扩大培养至6孔板后,将一部分单克隆细胞提取基因组DNA进行PCR验证,另一部分单克隆细胞冻存后用于核移植试验。本试验共筛选到46个单克隆细胞株,挑选其中生长状态良好的12个单克隆细胞进行PCR鉴定；PCR鉴定结果显示igf-1和neo基因整合进入细胞基因组的阳性克隆有2个。挑选验证阳性的单克隆细胞进行体细胞核移植制备转IGF-1基因奶山羊。本试验共获得4只转IGF-1基因奶山羊。5.转IGF-1基因奶山羊的鉴定转基因动物基因组中不但含有特定的外源基因序列,还包括特定的启动子、调控元件和标记基因等,这些是进行转基因鉴定的基础。在鉴定转基因动物时,除了检测外源基因的存在、表达与否外,还需要对转入基因的完整性、整合位点以及拷贝数等情况进行分析。本研究首先通过普通PCR和Southern-blot鉴定所获得的克隆羊为转IGF-1基因奶山羊；然后通过绝对荧光定量PCR和热不均一交错PCR（TAIL-PCR）进一步检测体细胞核移植技术生产的转IGF-1基因奶山羊中插入的外源基因拷贝数和整合位点。普通PCR检测结果表明转IGF-1基因奶山羊基因组中整合有igf-1基因和neo基因；Southern-blot结果进一步证实所获得的克隆羊为转IGF-1基因奶山羊。绝对荧光定量可以精确的分析外源基因在基因组中的拷贝数,本研究首先制备标准曲线（log2N（拷贝数）=-1.0244△Ct+5.3576（R2=0.9963））,接着检测转IGF-1基因奶山羊中外源IGF-1基因的拷贝数,结果显示4只转IGF-1基因奶山羊中外源基因拷贝数均为8个拷贝；进一步TAIL-PCR成功鉴定了转IGF-1基因奶山羊中外源基因的部分整合位点。3轮特异性的TAIL-PCR得到的多条特异性条带,经测序和BLAST比对得到4个特异性位点,这四个位点分别位于牛基因组的2,11,16和18四条染色体中。本研究初步建立了绝对荧光定量PCR和TAIL-PCR检测外源基因拷贝数和整合位点侧翼序列分析的体系,为今后研究外源基因在转基因奶山羊的中遗传和表达奠定了基础。
汪薇[5]（2013）在《转人α-乳白蛋白基因的奶山羊胎儿成纤维细胞株的建立及转基因奶山羊的鉴定》文中认为α-乳白蛋白（alpha-lactalbumin,α-LA）是乳清蛋白中主要的钙结合蛋白,同时还是乳糖合成酶的一个亚基,控制着乳糖的合成。α-LA能提高机体免疫力,有较高的营养价值,在人乳中含量约为2.9mg/mL,但在羊乳中含量较低,因此通过转基因的方法提高羊乳中α-LA的水平,可提高羊乳的价值。本研究应用基因克隆、细胞培养、脂质体转染、PCR和Western-blot等技术建立了转α-LA基因的奶山羊胎儿成纤维细胞株（Goat fetal fibroblast cells,gFFCs）,为制备转基因克隆奶山羊提供了供核细胞；同时应用TAIL-PCR、RT-PCR和Western-blot技术对本实验室制备的转人α-LA基因奶山羊进行了鉴定。（1）含调控序列的人α-LA全基因克隆及其表达载体构建。以人基因组为模板,扩增含5调控区和部分3调控区的人α-LA全基因序列,将其克隆到pMD19-T载体上,构建克隆载体PLAT;酶切质粒B9获得载体片段N13A（含Neo-IRES-EGFP共表达序列作为筛选标记基因,1.7kb3’ βLG作为3’调控序列）,酶切PLAT获得PLA,将二者连接得到乳腺特异性表达载体PLAN,经酶切及测序鉴定均正确。采用脂质体转染法将PLAN瞬时转染至奶山羊胎儿成纤维细胞,转染细胞有绿色荧光蛋白表达。（2）真核表达载体PLAN在山羊乳腺上皮细胞中的诱导表达及人α-LA检测。采用脂质体LipofectaminTM LTX Reagent+PLUSTM Reagent介导转染法,以本实验室保存的转基因载体5A和N13A为对照,将表达载体PLAN转染进山羊乳腺上皮细胞。经含胰岛素（10μg/mL）、催乳素（5μg/mL）及氢化可的松（10μg/mL）的DMED/F12培养液诱导培养,分别在转染24h、48h和72h收集上清液,Western blot检测其α-LA的表达情况。结果显示诱导培养液中有目的蛋白表达,分子量约为14kD,表明本实验所构建的转基因载体能够在山羊乳腺细胞诱导表达α-LA,为后续乳腺生物反应器的研究奠定了基础。（3）整合含调控序列人α-LA基因奶山羊胎儿成纤维细胞株的筛选。采用脂质体LipofectaminTMLTX Reagent+PLUSTM Reagent介导转染法,将线性化的PLAN转进奶山羊胎儿成纤维细胞中。用1000μg/mL G418抗性筛选1周,500μg/mL G418筛选2周,结合EGFP挑选出绿色荧光克隆扩大培养；经巢式PCR扩增鉴定,筛选得到的细胞株均已成功整合目的基因。结果表明,本实验得到的转基因细胞株可以为制作转基因克隆奶山羊提供供核细胞。（4）转人α-LA基因奶山羊的鉴定。用TAIL-PCR的方法获得转基因插入序列5’端和3’端已知序列邻近的未知序列；用RT-PCR和Western-blot检测乳腺上皮细胞中mRNA和羊乳中α-LA的表达情况。切胶回收TAIL-PCR产物,将测序结果与已知序列和奶山羊基因组序列比对,结果显示外源基因同源重组整合进了目的位置；转人α-LA基因克隆羊羊乳中检测到了α-LA,且表达量接近人乳,表明其基因组成功整合了人α-LA基因,且乳腺能够合成并分泌人α-LA。
桂涛[6]（2012）在《乳腺特异表达人BPI蛋白山羊克隆胚胎生产》文中进行了进一步梳理人杀菌/通透性增强蛋白（Human Bactericidal permeability increasing protein，hBPI）主要存在于人多形核中性粒细胞嗜苯胺蓝颗粒内的阳离子蛋白，既能够对革兰氏阴性菌发挥杀菌作用又可以中和内毒素作用的抗菌肽类物质，可用于治疗由革兰氏阴性细菌引起的人体感染、脓毒症和脓毒性休克等疾病。此外，BPI还具有增强调理作用、抗真菌、抗原虫和抑制血管生成等生物学功能。在临床医学中有巨大的应用价值，素有超级抗生素之美誉。天然抗菌肽来源有限，提取或制备成本高。随着分子生物学和细胞工程技术的发展，哺乳动物的乳腺已成为表达重组药物蛋白的生物药厂，即乳腺生物反应器。乳腺生物反应器成功的关键是外源基因能在乳腺组织中高效特异性表达。因此，在乳腺组织特异性表达载体构建成功后，需要对表达元件的有效性和合理性进行验证，从而减少研制乳腺生物反应器的盲目性，节约人力物力，提高效率，因而意义重大。本研究的目的是构建乳腺特异表达hBPI表达载体，用来制作山羊乳腺生物反应器，从而在转基因羊奶中大量生产hBPI蛋白以满足临床需要。具体研究内容如下：（1）取妊娠第60天的黄淮白山羊乳腺组织，采用组织块法进行原代培养，所用培养皿未铺鼠尾胶原等细胞外基质，培养体系为DMEM/F-12+10%（v/v） FBS+1%（v/v）ITS+10ng/mL EGF。通过胰酶差速消化法、高密度连续传代培养法等相结合纯化山羊乳腺上皮细胞系。通过原代培养观察、免疫荧光染色、生长曲线、核型分析、油红染色结等方法鉴定，所分离得到的细胞系为具有一定泌乳功能的乳腺上皮细胞系。（2）设计如下序列：XhoⅠ酶切位点+Kozak序列+牛β-酪蛋白信号肽+hBPI的CDS序列+XhoⅠ酶切位点。人工合成并克隆至pUC57载体的EcoR V酶切位点处，命为pUC57-hBPI。然后再将其亚克隆至pBC1-Loxp-Neo-Loxp-pBD载体，通过菌液PCR法快速鉴定，并将PCR阳性菌落进行酶切、测序等鉴定。成功构建了乳腺特异表达载体pBC1-Loxp-Neo-Loxp-hBPI。（3）采用脂质体介导法将载体导入C127细胞，经G-418筛选后获得大量单克隆，用胰酶消化收集所有克隆点细胞，添加催乳激素诱导培养。RT-PCR检测表明人BPI可以在mRNA水平表达；western blot检测表明BPI可以在蛋白水平表达；淋巴细胞转化实验表明重组的BPI具有刺激淋巴细胞增殖和中和内毒素（LPS）的生物学活性。结果表明该载体可以用制备乳腺生物反应器表达hBPI蛋白。（4）通过DNA显微注射法制备转基因小鼠，检测转基因小鼠乳汁中外源蛋白的表达和蛋白活性来评估载体的有效性和合理性。实验最终获得了7只Founder鼠（5♀、2♂）。（5）采用脂质体介导法将pBC1-Loxp-Neo-Loxp-hBPI载体导入雌、雄关中奶山羊成纤维细胞，经G-418筛选1416天获得大量克隆点，挑取形态好、活力高的单克隆细胞并扩大培养，PCR鉴定外源基因整合到细胞基因组，最终建立了4株转基因细胞系：GZ-GFC-1（♀）、GZ-GFC-2（♀）、GZ-GFC-3（♂）、GZ-GFC-4（♂）。（6）以GZ-GFC-1（♀）、GZ-GFC-2（♀）、GZ-GFC-3（♂）、GZ-GFC-4（♂）转基因细胞作为核供体，通过SCNT法和HMC生产克隆胚胎。结果表明：4个转基因细胞株均可以支持胚胎发育到囊胚。（7）采用HMC法获得了125枚克隆胚胎，移植到15头受体黄淮白山羊。结果显示大部分返情，未返情山羊B超也未检测到妊娠发生。总之，本研究首次构建了乳腺特异表达人BPI蛋白载体，并利用C127细胞模型验证了载体的生物学功能，首次获得了转人BPI基因山羊克隆胚胎，同时建立了山羊乳腺上皮细胞分离、培养平台。最终为获得乳腺特异表达人BPI蛋白克隆山羊奠定基础。
宋洋[7]（2012）在《SB转座系统介导的hLF基因乳腺表达载体的构建及其表达研究》文中研究表明“睡美人”"（Sleeping Beauty, SB）转座系统,作为Tcl超家族中的一员,是对斑马鱼基因组进行了分子水平的重建,逐步恢复其ORF、核定位活性、DNA结合活性以及整合活性,并对其进行改造,使之恢复跳跃能力,其采用“剪切一粘贴”的转座机制,属非自主转座系统。它包括两部分：一部分是能从基因组的从一个位置转移到另一个位置的转座子,另一部分是是转座的催化因子,称为转座酶。“睡美人“转座系统是脊椎动物中转座活性最高的转座子,被用作为种系突变和基因传递的工具。人乳铁蛋白（human Lactoferrin, hLF）是转铁家族中约80kDa的铁合蛋白,存在于黏液及大部分体液中,具有广谱抗菌作用。然而由于人乳铁蛋白在初乳中含量最高,产量较少,远远不能满足人类日益增长的生活需求。因此,转基因技术对于生产高质量的人乳铁蛋白具有非常重要的意义。本研究以SB转座系统以p-乳球蛋白为启动子构建乳腺表达载体,在其基础上引入了新霉素基因（Neo）和增强绿色荧光蛋白（EGFP）基因作为筛选标记,并利用条件培养液培养转基因细胞,试验发现这样可有效缩短G418药物作用时间,为利用体细胞核移植技术（Somatic Cell Nuclear Transfer, SCTN）生产转基因动物提供供体细胞。具体试验内容如下：（1）p-乳球蛋白基因的克隆及其鉴定设计并合成5’BLG、3’BLG及EGFP勺引物,以奶山羊基因组DNA为模板PCR扩增4.2kb的5’BLG和1.2kb的3’BLG,并以pEGFP-Cl为模板扩增了0.8kb的EGFP,并将测序正确的片段先后克隆至pcDNA3.1（-）中完成pcDNA3.1（-）-BLG-EGFP的构建,将纯化的质粒通过脂质体介导法转染至激素诱导培养的奶山羊乳腺上皮细胞（Caprine Mammary Epithelial Cells, CMECs）中,结果发现该调控序列可以有效指导报告基因的表达。（2）SB转座子介导的hLF乳腺表达载体的构建及鉴定采用PCR方法从hLF cDNA中扩增出2.1kb的hLF,替换pBLG-EGFP中的EGFP,然后与连接到pT2基础载体对应酶切位点上,构建pT2-BLG-hLF,采用PCR、酶切的方法鉴定载体构建的正确性。脂质体法将PT2-BLG-hLF与SB转座酶共转染至CMECs中,经催乳素、ITS、表皮生长因子及氢化可的松四种激素物质的诱导培养,RT-PCR及Western blo检测表明,本研究构建的表达载体均可在乳腺细胞中表达hLF。此部分试验为下一步制备核移植的转基因供体细胞奠定基础。（3）稳定整合hLF的成纤维细胞株的建立本研究以SB转座系统为基因传递系统,BLG为启动子调控元件,hLF为目的基因,带有双标记基因Neo和EGFP的hLF乳腺特异性表达载体pT2-BLG-hLF-EGFP-Neo,采用脂质体介导法将线性化处理的的无内毒素质粒与SB转座酶共转染至F3代CEFCs中,并用700μg/mL G418筛选10～14d后,得到转基因克隆,挑取单克隆至24孔板中培养,并进行一系列鉴定工作,对阳性克隆扩大培养,从而建立了转hLF基因奶山羊耳成纤维细胞株,为利用核移植技术生产转基因克隆动物所需的供体细胞的制备提供试验依据。
丰秀静[8]（2010）在《人α-乳白蛋白转基因载体的构建及其奶山羊胎儿成纤维细胞株的建立》文中指出α-乳白蛋白（alpha lactalbumin,α-LA）是乳清蛋白中结合钙离子的主要蛋白,能提高免疫力,具有抗癌、抗微生物的功效。其所含丰富的必需氨基酸和支链氨基酸有助于促进婴儿的神经发育,已在婴儿配方食品中得到广泛应用,同时还是产乳的一个重要调节因子。人乳中α-乳白蛋白含量较高,约为4.8g/L。奶山羊是小型反刍家畜,妊娠周期短,山羊奶乳蛋白、乳脂含量高,但α-乳白蛋白含量很少。通过转基因技术在山羊乳腺中表达人α-乳白蛋白,实现羊奶人乳化,可以提高羊奶的品质,并可能提高羊奶产量。而转基因载体的构建是外源基因在乳腺中高效表达的关键技术之一。已有研究表明,以β-乳球蛋白为启动子实现了外源目的基因高效表达,复合启动子也可提高表达效率。同时,基因打靶因为可以克服随机整合的“位置效应”引起的转基因沉默,实现高效表达而成为研究的热点。因此,本研究克隆了人α-乳白蛋白第1至4外元（含内元）及部分3’调控基因组序列,将其作为目的基因,构建了不同启动子的双标记转基因载体,经过乳腺上皮细胞的表达验证其有效性后,转染奶山羊胎儿成纤维细胞（Goat fetal fibroblast cells,gFFCs）,筛选得到了随机整合的转基因细胞株。在此基础上,又构建了含TK基因负筛选标记的打靶载体,转染gFFCs,筛选得到了定点整合的转基因细胞株,为制备定点修饰的转基因克隆羊提供了供核细胞。主要实验内容包括如下四部分:第一部分:人α-乳白蛋白基因乳腺特异性表达载体的构建及在乳腺上皮细胞中的表达以5.5kb的山羊βLG调控序列为启动子,hα-LA第1至4外元（含内元）及部分3’调控基因组序列为目的基因,Neo-IRES-EGFP共表达序列作为筛选标记基因,且在筛选标记两端含有两个同向的Loxp位点,1.7kb 3’βLG作为3’调控序列,依次进行表达元件、表达盒的拼接,构建成全长15.9kb的表达载体5A。在载体5A的基础上,βLG启动子后插入CMV增强子,构建成16.6kb的βLG/CMV复合启动子表达载体B9。通过酶切、PCR、测序验证了表达载体的正确性。脂质体转染法将线性化的5A、B9转染山羊乳腺上皮细胞,经G418抗性筛选9d左右,结合EGFP绿色荧光蛋白挑选出绿色荧光抗性克隆,经催乳素、胰岛素及氢化可的松诱导培养,通过RT-PCR、Western-blot检测表明,本研究构建的表达载体可在乳腺细胞中表达人α-乳白蛋白,且发现βLG/CMV复合启动子的转录活性较βLG启动子高。这为下一步制备核移植的转基因供核细胞奠定了基础。第二部分:gFFCs的分离培养与脂质体转染条件优化研究 为获得转基因克隆羊的供核细胞,采用原代组织块培养法结合胰蛋白酶消化法分离纯化gFFCs。绘制的细胞生长曲线表明该分离培养体系可以支持gFFCs良好生长,细胞生长特性符合单层贴壁细胞的增殖特征;采用SRY PCR法鉴定获得了雌性gFFCs。为获得外源基因高效转染gFFCs的方法,以GFP为报告基因,采用脂质体LipofectaminTM LTX+PLUSTMReagent介导,对转染条件进行了优化;在24孔培养板中,细胞接种6×1 04个/孔,24h后进行转染,质粒DNA0.6μg/孔,脂质体与质粒DNA比例为4.5:1,脂质体-DNA复合物与细胞作用时间为6h时,转染效率（转染后24h荧光显微镜下统计）最高,达到81.2%。第三部分:稳定整合人α-乳白蛋白基因gFFCs的建立 利用第二部分建立的脂质体介导基因转染gFFCs方法,将线性化的5A和B9载体转染gFFCs。借助于Neo和EGFP基因,经过800μg/mLG418药物筛选13-15d,分别获得G418抗性绿色荧光细胞克隆121、102个,通过96孔板-6孔板分离扩大培养,经过巢式PCR扩增鉴定,建立的细胞株皆已经稳定整合目的基因。通过EGFP报告基因的表达检测,建立的转基因细胞系荧光强度5A较B9强,生长情况与对照组比较,转基因过程没有导致细胞生长异常;冻存五个月后解冻细胞,荧光强度依然很强,且生长旺盛。这些结果表明这些阳性转基因细胞可以作为奶山羊克隆研究的供核细胞。第四部分:TK负筛选标记基因打靶载体的构建及定点整合gFFCs的筛选 以第三章构建的载体5A和B9作为骨架,5’βLG为5’同源臂,3’βLG为3’同源臂,同源臂两侧各有一个同向的HSV-TK作为负筛选标记基因,构建成以βLG为基因座的含负筛选标记的置换型打靶载体TK-5A,TK-B9,通过质粒大小、酶切、测序验证了载体构建的完整性。并对GANC的最佳筛选浓度进行确定,发现6μM GANC筛选6d效果最佳。XhoI酶切,去除原核序列,载体线性化。通过脂质体介导转染gFFCs,经1000μg/mLG418和6μM GANC筛选,得到绿色荧光抗性克隆17个TK-B9,28个TK-5A,有待进一步验证。
张艳丽[9]（2010）在《转基因克隆法制作人溶酶体β-葡萄糖苷酶奶山羊乳腺生物反应器的研究》文中研究说明人溶酶体β-葡萄糖苷酶（human lysosomal acidβ-glucosidase, GlcCerase）是糖蛋白降解途径的主要外糖苷酶,参与糖蛋白的回收利用。该酶减少或缺失会导致葡萄糖脑苷脂不能有效降解,在各器官中大量沉积,从而使机体发生广泛的病理变化,临床上称为“戈谢病”,酶替代法是目前该病的主要疗法。人体来源的GlcCerase获得极为困难,应用哺乳动物细胞和转基因植物表达系统生产重组人GlcCerase虽然已经有一些成功的报道,但也面临许多难以克服的问题,如在CHO细胞表达重组人GlcCerase,生产成本过于昂贵；在转基因植物中表达,存在重组蛋白质中糖链结构的改变以及下游加工处理困难等限制。如果应用转基因动物乳腺生物反应器生产重组人GlcCerase,在得到天然活性较高产品的同时,将极大地降低生产成本,具有其它表达系统所不能代替的优势。然而,显微注射法的高成本、低效率长期以来制约着转基因动物研究的发展,体细胞转基因与核移植相结合制备动物乳腺生物反应器是当今转基因整合表达的一种有效途径。因此,本研究选取人溶酶体β-葡萄糖苷酶作为研究对象,首先克隆人GlcCerase cDNA序列并对其在COS7细胞中的表达进行初步研究,然后构建含有人GlcCerase cDNA的乳腺表达载体,经体外培养的乳腺上皮细胞验证载体的有效性后,进一步将该载体转染奶山羊胎儿成纤维细胞,筛选稳定转基因细胞克隆株,通过体细胞核移植法生产转基因奶山羊克隆胚胎,以期获得乳腺特异性表达GlcCerase的转基因奶山羊乳腺生物反应器。本研究共分为六个部分,第一、二部分进行了人GlcCerase基因的克隆、表达载体的构建及体外细胞表达研究；第三、四部分主要是分离培养了奶山羊胎儿成纤维细胞,并优化了脂质体法转染该细胞的体系,获得了稳定整合人GlcCerase基因的供体细胞；第五部分利用转人GlcCerase基因的奶山羊胎儿成纤维细胞进行了核移植,研究转基因供体细胞对克隆胚胎体外发育的支持作用,并对克隆胚胎进行了胚胎移植；第六部分探讨了外源基因导入对奶山羊体细胞周期分布、细胞凋亡和基因表达水平的影响。主要的研究结果如下：第一部分人GlcCerase cDNA序列的克隆及真核细胞表达试验中,首先从人胎盘组织中分离提取得到总RNA,利用RT-PCR方法,直接获得人GlcCerase基因的编码序列,经测序分析,所得GlcCerase cDNA与GeneBank中同源性为99%,发现1个碱基差异,导致天冬氨酸到甘氨酸的改变。为了尽快检测所获得的目标基因是否能正常编码获得重组蛋白质,本试验以pEGFP-Cl为基础质粒,构建了含有人GlcCerase基因的真核表达载体pEGFP-GlcCerase。用脂质体介导法将该载体转染入COS7细胞中进行暂态表达研究,可见报告基因GFP顺利表达,经RT-PCR和荧光酶学法进行验证,在细胞中检测到了GlcCerase的mRNA表达,并在细胞裂解产物中检测到了GlcCerase的生物活性。这些结果表明所克隆的人GlcCerase cDNA能够正确编码蛋白,发挥生物学功能,可以用于下一步的乳腺表达载体构建。第二部分人GlcCerase基因乳腺特异性表达载体的构建及乳腺细胞表达试验中,将在体外经真核细胞表达验证正确的GlcCerase基因以及细胞筛选标记基因（Neor）插入含有山羊p-酪蛋白基因调控序列的pBC1载体中,经PCR和酶切鉴定,得到正确的重组质粒pBCl-GlcCerase-Neo。为了检测乳腺表达载体的有效性,将该载体转染入小鼠乳腺上皮细胞系——HC-11细胞中,经G418抗性筛选,获得阳性克隆细胞,将克隆细胞扩大培养后,经PCR检测结果表明,人GlcCerase基因己成功转入到HC-11细胞中。进一步用催乳素、胰岛素及氢化可的松诱导培养转基因细胞,经RT-PCR和Western-blot检测表明,山羊p-酪蛋白基因启动子驱动的人GlcCerase基因能够在乳腺上皮细胞中转录翻译并分泌到胞外。这些结果表明,所构建的人GlcCerase基因乳腺表达载体具有生物学功能,为下一步利用该载体进行转基因供体细胞的建立奠定了基础。第三部分奶山羊胎儿成纤维细胞的分离培养及脂质体法转染研究,采用组织块培养法结合胰蛋白酶消化法分离纯化得到奶山羊胎儿成纤维细胞,绘制了生长曲线,鉴定了胎儿细胞性别及核型特征,结果表明：该培养体系可以支持奶山羊胎儿成纤维细胞的体外生长,其细胞形态为梭形,高度汇合后呈火焰状,增殖特性以及核型特征均为正常,性别鉴定显示该奶山羊胎儿细胞为雌性,符合体细胞转基因克隆的基本要求。进一步利用脂质体法将pEGFP-Cl质粒转染入该细胞,研究了脂质体量、质粒量和转染时间对转染效率的影响,获得了脂质体转染该细胞的最佳条件：24孔细胞培养板中采用4.0μL脂质体转染试剂,1.2μg质粒DNA,细胞在复合物中孵育6 h。这为下一步目的基因转染奶山羊胎儿成纤维细胞的研究提供了参考依据。第四部分建立转人GlcCerase基因奶山羊胎儿成纤维细胞的试验,利用上述优化的转染体系,将线性化的乳腺特异性表达载体pBC 1-GlcCerase-Neo转染胎儿成纤维细胞,经G418筛选8-10天后,获得抗性细胞克隆,进一步通过96孔细胞培养板分离得到来源于单个转基因成纤维细胞的细胞克隆,经PCR扩增检测,得到稳定整人GlcCerase基因的转基因供体细胞8株,和对照组细胞比较,转基因过程中没有导致细胞的生长和核型异常。转基因细胞的核型（2n=58+XX）正常比例为66.8%,而第10-12代的非转染细胞核型正常率为70.9%,二者差异不显着（P>0.05）。这些结果表明可以利用这些阳性转基因细胞作供体细胞进行核移植研究。第五部分人GlcCerase转基因克隆胚胎的制备研究,采集屠宰山羊卵巢,获取卵母细胞并体外成熟培养,成熟率为63.3%。以100%汇合2天的转基因体细胞作核供体,以去核的MⅡ期卵母细胞作核受体进行核移植操作。完成核移植的卵母细胞采用122 kV/cm、20μs/次、间隔1s的直流电脉冲进行融合,融合率为83.3%,融合后的重构胚胎进一步用Ionomycin和6-DMAP进行激活处理,然后转移到SOFaa培养液中与单层卵丘细胞共培养,重构胚的卵裂率为89.1%,发育至桑葚胚/囊胚期的比例为36.4%。以正常体细胞来源的核移植胚胎作为对照,其融合率、卵裂率以及桑葚胚/囊胚率分别为77.8%、90.9%和38.9%,两种供体细胞来源的融合率和胚胎发育率差异不显着。手术法将发生卵裂且形态正常的转基因克隆胚（2-细胞期或以上）移植到同期发情的山羊输卵管中,16只受体山羊中有6只一直没有返情,在第40天经B超检测到2只妊娠的结果,但是最终妊娠没有发育到期,胎儿发生流产。第六部分探讨了外源基因转染对供体细胞生物学特性的影响。将构建的乳腺表达载体pBC1-GlcCerase-Neo分别转染体外培养的奶山羊乳腺上皮细胞、胎儿成纤维细胞以及成年皮肤成纤维细胞,获得整合有外源基因GlcCerase的转基因体细胞。以非转染的正常细胞为对照,利用流式细胞仪分析了转基因奶山羊体细胞的细胞周期分布和细胞凋亡的情况,研究结果显示：三种转基因细胞100%汇合2d后,G0/G1细胞的百分比都显着低于对照组细胞（P<0.05）,其中转基因胎儿成纤维细胞的G0/G1期比例高于其它两种转基因细胞；转基因胎儿成纤维细胞凋亡率达22.56%,较对照组细胞有显着提高（P<0.05）；然后进一步利用荧光定量PCR法探讨了外源基因转染对胎儿成纤维细胞基因表达模式的影响,检测的基因分别为基因印记基因（IGF2, IGF2R）、凋亡相关基因（Bax）、应激相关基因（热休克蛋白,Hsp70.1）、细胞连接相关基因（Cx43）和DNA甲基化转移酶1基因（DNMT1）。其中IGF2, IGF2R和Cx43mRNA的转录水平显着高于对照组非转染的对照组细胞（P<0.05）。本研究首次从细胞周期分布、细胞凋亡以及基因表达变化模式等方面探讨外源基因转染对奶山羊体细胞的影响,探索转基因克隆效率低的内在机制,为更好地促进供体细胞的重编程,进一步提高转基因克隆的效率奠定了基础。
孟立[10]（2010）在《人乳铁蛋白表达载体的构建及转基因阳性细胞株的建立》文中提出人乳铁蛋白（Human Lactoferrin, hLF）是一种具有高级空间结构的糖蛋白,具有广泛的生物学作用。大量体内体外试验表明：hLF不仅在肠道铁离子的吸收以及抵抗细菌、病毒、真菌、单细胞生物等方面具有重要作用,而且在调节炎症反应、调控基因表达及促进骨骼生长方面也具有重要作用。因此,hLF在疾病防治、营养补充、食物或药品的贮藏等方面具有广阔的应用前景,已成为近几年来研究的热点之一,利用原核和真核表达系统已在生产重组hLF方面做了很多尝试。然而,还有很多问题尚待解决,如蛋白的表达水平较低、翻译后的蛋白缺乏准确的修饰及纯化步骤复杂等,均致使这些方法不适合大规模的生产重组hLF。通过乳腺生产外源蛋白,具有成本低、分离纯化简单、可持续生产、不易污染及所表达的外源蛋白可进行翻译后加工、具有d然蛋白的结构与活性等优点,是生产基因工程药物的理想场所。鉴于此,本研究构建了hLF cDNA基因乳腺表达载体pGBC-hLF,此载体为随机插入载体。为进行载体的体外表达验证,在此载体中引入了Neo筛选基因,并在山羊乳腺上皮细胞和小鼠乳腺上皮细胞中进行表达验证,为下一步制备稳定整合有人乳铁蛋白cDNA基因的山羊胎儿成纤维细胞提供试验支撑；为了制备转hLF cDNA基因的山羊胎儿成纤维细胞并提高转基因细胞的筛选效率,本研究在pGBC-hLF基础上引入了新霉素基因（Neo）和增强绿色荧光蛋白（EGFP）基因作为筛选标记,并利用条件培养液培养转基因细胞,试验发现这样可有效缩短G418药物作用时间,并可得到较纯的转基因细胞；为了下一步获得在基因组中定点整合有hLF cDNA基因的转基因奶山羊,消除位置效应对目的基因的表达影响,本试验又构建了人乳铁蛋白的打靶载体pGBC5-hLF,并在山羊乳腺上皮细胞中进行了载体的生物活性分析,为下一步实验室制备hLF cDNA基因在山羊β-casein基因座定位整合的胎儿成纤维细胞奠定基础。本试验的具体内容如下：（1）构建了人乳铁蛋白（hLF）基因的乳腺表达载体pGBC-hLF-Neo并验证其在乳腺细胞中的表达情况。本载体以山羊β-casein基因上游包括启动子、外显子1、内含子1、部分外显子2作为5’端调控序列,下游包括部分外显子7、内含子7、外显子8、内含子8、外显子9及3’部分基因组片段作为3’端调控序列,长度分别为6.2 kb和7.1 kb,将hLF基因（目的基因）和Neo基因（筛选标记）分别插入到5’端调控序列和3’端调控序列的下游,构建成pGBC-hLF-Neo载体,其全长为25.348 kb。为了检测该载体的生物学功能,本试验进一步用脂质体介导法将其分别导入到山羊乳腺上皮细胞GMC和小鼠乳腺上皮细胞株C127中进行表达验证,经G418抗性筛选8-10 d,得到的抗性细胞克隆经催乳素、胰岛素及氢化可的松诱导培养,通过RT-PCR和Western Blot检测表明,本研究所构建的hLF基因乳腺表达载体具有生物学活性,山羊β-casein基因启动子驱动的hLF基因能够在C127和GMC等乳腺上皮细胞中转录翻译,这为下一步建立稳定整合hLF基因奶山羊胎儿成纤维细胞奠定了基础。（2）构建了带有双标记基因Neo和EGFP的乳腺表达载体pGBC-hLF-Neo-IRES2-EGFP,并通过酶切、PCR、测序鉴定了所构建载体的完整性。通过脂质体转染山羊胎儿成纤维细胞,经G418抗性筛选7-10 d后得到绿色荧光细胞克隆;利用单个或多个表达绿色荧光蛋白的转基因细胞分离培养了转基因细胞,并通过试验对比条件培养液和非条件培养液对转基因细胞克隆形成效率的影响,结果证明条件培养液更有利于阳性细胞克隆的形成。借助EGFP和Neo基因作为双筛选标记,可有效的缩短转基因细胞在G418药物中的培养时间,提高了阳性克隆细胞的筛选效率。尝试了利用多重PCR鉴定了表达载体在转基因细胞基因组中的整合情况,避免了单基因PCR导致的假阳性问题；建立了转hLF基因山羊胎儿成纤维细胞,为以后核移植技术生产转基因克隆动物所需的供体细胞的制备提供了一种参考体系。（3）构建了人乳铁蛋白基因的β-casein基因座的定点打靶载体,此载体以β-casein上游包括启动子,外显子1、内含子1及部分外显子2的6.3kb的调控序列作为5’同源长臂,以下游2.4 kb的序列包括外显子8和9作为3’同源短臂,Neo基因和tk基因分别作为正负筛选基因,并在Neo基因两端分别加上正向重复序列loxp序列；将人乳铁蛋白基因（hLF）克隆到5’同源长臂下游, Neo克隆到β-casein基因7、8外显子之间,tk基因克隆到3’同源短臂外侧并用原核序列进行保护；经克隆重组后构建了本地山羊乳腺定点打靶载体,对打靶载体进行酶切鉴定和部分DNA测序,结果证明最终构建的打靶载体符合预先设计的载体图谱；采用脂质体法转入GMC细胞中,以进行打靶载体的表达功能检测,利用RT-PCR和western-blot等检测到了hLF特异性的表达,结果说明本载体能够指导外源基因在动物乳腺细胞内正确表达。
二、乳蛋白基因在转基因动物乳腺细胞中特异性表达的研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、乳蛋白基因在转基因动物乳腺细胞中特异性表达的研究进展（论文提纲范文）
（1）转基因兔乳汁中重组吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂的纯化、结构分析和药效研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 1 血栓性疾病与溶栓药物的研究进展 |
| 1.1 血栓的概述及溶栓机理 |
| 1.2 去氨普酶(DSPA)研究进展 |
| 1.3 其它生物溶栓药物的研究进展 |
| 1.4 问题及展望 |
| 2 乳腺生物反应器研究进展 |
| 2.1 乳腺生物反应器简介 |
| 2.2 乳腺生物反应器优势 |
| 2.3 作为乳腺生物反应器的常用动物 |
| 2.4 乳腺生物反应器应用 |
| 2.5 问题与展望 |
| 3 蛋白质分离纯化研究进展 |
| 3.1 蛋白质分离纯化概述及其常用技术 |
| 3.2 乳腺生物反应器生产的重组蛋白的分离纯化 |
| 3.3 DSPA的分离纯化 |
| 3.4 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第一章 乳腺特异性表达rDSPA转基因兔的传代繁殖 |
| 1 材料 |
| 1.1 动物 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 常用试剂的配制 |
| 1.5 DSPA编码区设计 |
| 2 方法 |
| 2.1 rDSPA转基因兔传代扩群 |
| 2.2 rDSPA转基因兔乳中rDSPA体外活性检测 |
| 2.3 rDSPA转基因兔乳中rDSPA表达水平检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 rDSPA转基因兔传代扩群 |
| 3.2 rDSPA转基因兔后代测交 |
| 3.3 rDSPA转基因兔乳中rDSPA体外活性检测 |
| 3.4 rDSPA转基因兔乳中rDSPA表达水平检测 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第二章 原核表达去氨普酶(DSPA)基因载体的构建 |
| 1 材料 |
| 1.1 载体 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及耗材 |
| 1.4 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 DSPA功能基因的引物设计 |
| 2.2 PCR扩增pCL25/DSPA表达载体 |
| 2.3 PCR产物和表达载体双酶切 |
| 2.4 PCR产物和表达载体酶切产物纯化 |
| 2.5 DSPA与pET-28a表达载体连接 |
| 2.6 DSPA与pET-28a表达载体连接产物转化TOP10 |
| 2.7 菌落PCR鉴定 |
| 2.8 pET-28a/DSPA重组质粒提取 |
| 2.9 pET-28a/DSPA重组质粒转化Rosetta |
| 2.10 pET-28a/DSPA原核表达载体诱导DSPA蛋白表达 |
| 2.11 亲和层析柱纯化DSPA |
| 2.12 蛋白透析 |
| 2.13 浓缩及定量 |
| 3 结果 |
| 3.1 pCL25/DSPA表达载体的构建 |
| 3.2 pET-28a/DSPA原核表达载体诱导DSPA蛋白表达及可溶性鉴定 |
| 3.3 Ni-NTA Resin亲和层析柱纯化DSPA |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第三章 rDSPA单克隆抗体制备及筛选 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物及免疫原 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及材料 |
| 1.4 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 小鼠免疫 |
| 2.2 小鼠血清检测 |
| 2.3 细胞融合 |
| 2.4 阳性杂交瘤细胞株的筛选 |
| 2.5 阳性杂交瘤细胞株的单克隆化 |
| 2.6 多羟基反应单克隆抗体(PR-mAb)的筛选 |
| 2.7 阳性杂交瘤细胞的扩大培养和冻存 |
| 2.8 rDSPA单克隆抗体(PR-mAb)的大量制备 |
| 3 结果 |
| 3.1 免疫小鼠血清检测 |
| 3.2 阳性杂交瘤细胞株的筛选 |
| 3.3 阳性杂交瘤细胞株的单克隆化鉴定结果 |
| 3.4 多羟基反应单克隆抗体(PR-mAb)的筛选 |
| 3.5 小鼠腹水抗体制备及腹水抗体ELISA检测 |
| 3.6 小鼠腹水抗体纯化及SDS-PAGE蛋白电泳检测 |
| 3.7 纯化抗体的ELISA检测 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第四章 转基因兔乳中rDSPA的纯化 |
| 1 材料 |
| 1.1 纯化原料 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及耗材 |
| 1.4 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 兔乳前处理 |
| 2.2 硫酸铵沉淀兔乳清蛋白 |
| 2.3 DSPA及兔乳清蛋白等电点预测 |
| 2.4 小鼠单抗与亲和介质的偶联 |
| 2.5 免疫亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.6 强阳离子交换层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.7 苯甲醚亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.8 赖氨酸亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.9 活性蓝亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.10 纯化产物脱盐 |
| 2.11 FAPA 法检测rDSPA |
| 2.12 SDS-PAGE检测rDSPA |
| 2.13 Western Blot检测rDSPA |
| 2.14 纯化产物纯度测试 |
| 2.15 纯化产物去除内毒素 |
| 2.16 纯化产物内毒素检测 |
| 2.17 rDSPA注射剂配制 |
| 3 结果 |
| 3.1 兔乳前处理 |
| 3.2 硫酸铵沉淀兔乳清蛋白 |
| 3.3 DSPA及兔乳清蛋白等电点预测 |
| 3.4 纯化小鼠单抗与亲和介质的偶联 |
| 3.5 免疫亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.6 强阳离子交换层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.7 苯甲醚亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.8 赖氨酸亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.9 活性蓝亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.10 转基因兔乳中rDSPA的最终纯化方案 |
| 3.11 纯化产物脱盐 |
| 3.12 纯化产物SDS-PAGE及Western Blot检测 |
| 3.13 纯化产物纯度测试 |
| 3.14 纯化产物去除内毒 |
| 3.15 纯化产物内毒素检测 |
| 3.16 DSPA注射剂配制 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第五章 乳腺特异性表达rDSPA纯化产物的结构和功能检测 |
| 1 材料 |
| 1.1 检测样品 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及耗材 |
| 2 方法 |
| 2.1 rDSPA转基因兔乳汁中rDSPA信号肽序列切割位点预测 |
| 2.2 蛋白质N端测序 |
| 2.3 蛋白质C端测序 |
| 2.4 相对分子量测序 |
| 2.5 纯化产物体蛋白三维结构模拟 |
| 2.6 纯化产物体外活性测试 |
| 3 结果 |
| 3.1 rDSPA转基因兔乳汁中rDSPA信号肽序列切割位点预测 |
| 3.2 蛋白质N端测序 |
| 3.3 蛋白质C端测序 |
| 3.4 相对分子量测序 |
| 3.5 纯化产物蛋白三维结构模拟 |
| 3.6 纯化产物体外活性测试 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文 |
| 第六章 rDSPA体内外溶栓效果的初步评价 |
| 1 材料 |
| 1.1 检测样品 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 实验试剂及耗材 |
| 1.5 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 体外血凝块溶解试验 |
| 2.2 角叉菜胶制备大鼠尾部血栓模型 |
| 2.3 体内溶栓试验 |
| 2.4 大鼠血浆rDSPA半衰期试验 |
| 2.5 数据统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 rDSPA体外血凝块溶解效果评价 |
| 3.2 大鼠尾部血栓模型制备结果 |
| 3.3 rDSPA对大鼠尾部血栓模型溶栓效果评价 |
| 3.4 大鼠血浆rDSPA半衰期评价 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 全文结论 |
| 附录一 |
| 附录二 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（2）体外重组装人促卵泡激素的制备及转基因小鼠模型的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 FSH的概述 |
| 1.2 FSH的作用机理及应用 |
| 1.3 FSH产品的发展与应用 |
| 1.4 基因工程重组FSH的研究进展 |
| 1.5 蛋白的自组装 |
| 1.5.1 蛋白自组装现象 |
| 1.5.2 蛋白自组装的机制及影响因素 |
| 1.6 乳腺生物反应器研究进展 |
| 1.6.1 乳腺生物反应器简介 |
| 1.6.2 乳腺生物反应器的制备 |
| 1.6.3 乳腺生物反应器的应用 |
| 1.7 基因编辑技术在乳腺生物反应器应用 |
| 1.7.1 基因编辑技术简介 |
| 1.7.2 基因编辑技术在动物乳腺生物反应器中的应用 |
| 1.8 研究目的和意义 |
| 第二章 人FSHα、FSHβ亚基蛋白的表达 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 试验材料 |
| 2.2.1 主要试验材料 |
| 2.2.2 主要仪器设备 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 FSHα、FSHβ基因在CHO工程细胞中表达及鉴定 |
| 2.3.2 FSHα、FSHβ基因在牛乳腺上皮细胞中表达及鉴定 |
| 2.3.3 腺病毒介导FSHα、FSHβ基因在羊乳腺及GMECs中表达及鉴定 |
| 2.3.4 数据统计和分析 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 FSHα、FSHβ基因在CHO工程细胞中表达及鉴定 |
| 2.4.2 腺病毒介导FSHα、FSHβ基因在牛乳腺上皮细胞中表达及鉴定 |
| 2.4.3 腺病毒介导FSHα、FSHβ基因在羊乳腺及GMECs中表达及鉴定 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 人FSHα、FSHβ亚基蛋白体外重组装方法的建立 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 试验材料 |
| 3.2.1 主要试验材料 |
| 3.2.2 主要仪器设备 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.3.1 FSHα、FSHβ亚基蛋白体外重组装方法的建立 |
| 3.3.2 牛乳腺上皮细胞表达的人FSHα、FSHβ亚基蛋白体外重组装 |
| 3.3.3 羊乳腺及GMECs表达的人FSHα、FSHβ亚基蛋白体外重组装分析 |
| 3.3.4 数据统计和分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 FSHα、FSHβ亚基蛋白体外重组装方法的建立 |
| 3.4.2 牛乳腺上皮细胞表达的人FSHα、FSHβ亚基蛋白体外重组装分析 |
| 3.4.3 羊乳腺及GMECs表达的人FSHα、FSHβ亚基蛋白体外重组装分析 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 体外重组装rhFSH生物活性恢复技术及生物活性研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 试验材料 |
| 4.2.1 主要试验材料 |
| 4.2.2 主要仪器设备 |
| 4.3 试验方法 |
| 4.3.1 体外重组装rhFSH体外稳定性恢复技术研究 |
| 4.3.2 CHO细胞表达的体外重组装人rhFSH-C生物活性分析 |
| 4.3.3 牛乳腺上皮细胞表达的体外重组装人rhFSH-B生物活性分析 |
| 4.3.4 羊乳腺及GMECs表达的体外重组装rhFSH生物活性分析 |
| 4.3.5 数据统计和分析 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 体外重组装rhFSH生物活性恢复技术研究 |
| 4.4.2 CHO细胞表达的重组装rhFSH-C生物活性分析结果 |
| 4.4.3 牛乳腺上皮细胞表达的体外重组装rhFSH-B生物活性分析结果 |
| 4.4.4 羊乳腺及GMECs表达的体外重组装rhFSH生物活性分析结果 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 基于CRISPR/Cas9 技术在山羊BLG基因座定点整合人FSHα、FSHβ基因打靶体系的建立 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 试验材料 |
| 5.2.1 主要试验材料 |
| 5.2.2 主要仪器设备 |
| 5.3 试验方法 |
| 5.3.1 GMECs的培养 |
| 5.3.2 pCas9-sgRNA敲除载体的构建及基因编辑活性分析 |
| 5.3.3 pGHA-FSHα基因打靶Donor载体的构建及鉴定 |
| 5.3.4 pGHA-FSHβ/His基因打靶Donor载体的构建及鉴定 |
| 5.3.5 CRISPR/Cas9介导人FSHα、FSHβ基因在山羊BLG基因座定点整合及蛋白表达 |
| 5.3.6 GMECs细胞表达的FSHα、FSHβ亚基蛋白糖基化及唾液酸化分析 |
| 5.3.7 GMECs特异性表达的体外重组装rhFSH生物功能分析 |
| 5.3.8 基于CRSIPR/Cas9构建转FSHα、FSHβ基因的羊胎儿成纤维细胞 |
| 5.3.9 数据统计和分析 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 pCas9-sgRNA敲除载体的构建及基因编辑活性分析 |
| 5.4.2 pGHA-FSHα基因打靶Donor载体的构建及鉴定 |
| 5.4.3 pGHA-FSHβ/His基因打靶Donor载体的构建及鉴定 |
| 5.4.4 基因打靶载体定点整合目的基因效率及表达功能分析 |
| 5.4.5 GMECs特异性表达的体外重组装rhFSH生物功能分析 |
| 5.4.6 基于CRISPR/Cas9技术构建转FSHα及FSHβ基因羊胎儿成纤维细胞 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 第六章 转人FSHα、FSHβ基因小鼠的制备及其功能研究 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 试验材料 |
| 6.2.1 主要试验材料 |
| 6.2.2 主要仪器设备 |
| 6.3 试验方法 |
| 6.3.1 乳腺特异性表达人FSHα、FSHβ基因载体的构建及鉴定 |
| 6.3.2 试验鼠的准备及显微注射 |
| 6.3.3 转人FSHα、FSHβ基因小鼠的制备及鉴定 |
| 6.3.4 转人FSHα、FSHβ基因小鼠乳腺表达目的蛋白鉴定 |
| 6.3.5 转人FSHα、FSHβ基因小鼠乳腺和卵巢组织形态学分析 |
| 6.3.6 转人FSHα、FSHβ基因小鼠表达的亚基蛋白体外重组装分析 |
| 6.3.7 转基因小鼠乳腺表达的体外重组装rhFSH生物活性分析 |
| 6.3.8 数据统计和分析 |
| 6.4 结果与分析 |
| 6.4.1 乳腺特异性表达人FSHα、FSHβ基因载体的构建及鉴定 |
| 6.4.2 转人FSHα、FSHβ基因小鼠的制备及鉴定 |
| 6.4.3 转人FSHα、FSHβ基因小鼠乳腺表达目的蛋白检测 |
| 6.4.4 RT-PCR检测转人FSHα、FSHβ基因小鼠乳腺及其他组织中目的基因的表达 |
| 6.4.5 转人FSHα、FSHβ基因小鼠乳腺免疫组化分析 |
| 6.4.6 转人FSHα、FSHβ基因小鼠乳腺和卵巢组织形态学分析 |
| 6.4.7 转人FSHα、FSHβ基因小鼠表达的亚基蛋白体外重组装分析 |
| 6.4.8 转基因小鼠乳腺表达的体外重组装rhFSH生物活性分析 |
| 6.5 讨论 |
| 6.6 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 研究展望 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）水牛乳腺基因表达谱与生长激素转基因水牛的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 目录 |
| 缩略词(Abbreviations) |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 乳腺发育与生长激素转基因动物 |
| 1 乳腺发育机理 |
| 2 血液中的乳蛋白成份 |
| 3 生长激素 |
| 3.1 概况 |
| 3.2 牛生长激素 |
| 4 外源注射BST促进产奶量 |
| 4.1 BST处理安全性 |
| 4.2 BST处理效果 |
| 4.3 BST注射促进泌乳的机制 |
| 5 生长激素转基因动物研究进展 |
| 6 乳腺特异性表达生长激素 |
| 7 生长激素转基因的影响 |
| 7.1 对内源性生长激素的影响 |
| 7.2 对生长性状的影响 |
| 8 生长激素转基因动物存在的问题与展望 |
| 第二章 转座子转基因动物研究进展 |
| 1 转座子概述 |
| 2 主动整合与转座子转基因 |
| 3 PB转座子(PIGGYBAC TRANSPOSON) |
| 4 SB转座子(SLEEPING BEAUTYTRANSPOSON) |
| 5 PP转座子(PASSPORT TRANSPOSON) |
| 研究的目的与意义 |
| 第二部分 实验内容 |
| 第三章 水牛乳腺基因表达谱分析与乳腺细胞永生化 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 主要试剂与仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 水牛乳腺组织基因表达谱构建 |
| 2.2 基因表达谱中差异表达基因 |
| 2.3 水牛泌乳期与非泌乳期期基因表达 |
| 2.4 水牛乳腺上皮细胞(BME)及永生化 |
| 2.5 永生化BME细胞,泌乳期与非泌乳期乳腺组织基因表达对比 |
| 3 讨论 |
| 3.1 乳腺基因表达谱分析 |
| 3.2 乳蛋白基因表达 |
| 3.3 泌乳相关基因表达 |
| 3.4 水牛乳腺上皮细胞的永生化 |
| 4 小结 |
| 第四章 水牛转座子转基因的初步研究 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 药品与试剂 |
| 1.2 转基因载体 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 转基因BFF细胞荧光观察与neo整合检测 |
| 2.2 外源基因整合位点检测 |
| 2.3 随机整合与转座子转基因效率比较 |
| 2.4 转座子转基因系统的优化 |
| 2.5 转座子转基因拷贝数检测 |
| 3 讨论 |
| 3.1 随机整合与主动整合转基因效率 |
| 3.2 转座子转基因体系优化 |
| 3.3 转基因整合拷贝数 |
| 4 小结 |
| 第五章 生长激素转基因水牛的初步研究 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与试剂 |
| 1.2 仪器与设备 |
| 1.3 实验方法 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1 人、奶牛、水牛GH基因 |
| 2.2 GH转基因在Bcap37乳腺细胞中的表达 |
| 2.3 GH转基因对BME乳腺细胞基因表达的影响 |
| 2.4 转GH基因水牛胚胎发育观察及早产转基因克隆水牛的鉴定 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 生长激素基因及转基因表达 |
| 3.2 生长激素转基因对乳腺细胞和乳腺组织的影响 |
| 3.3 GH转基因牛 |
| 4 小结 |
| 研究结论 |
| 参考文献 |
| 附录 (APPENDIX) |
| 附录1：水牛生长激素基因编码区序列GENBANK提交(JF894306) |
| 附表1：水牛乳腺泌乳期与非泌乳期乳腺差异表达基因-KEGG归类 |
| 附表2：泌乳期表达量上调的基因列表(部分) |
| 附表3：泌乳期表达量下调的基因列表(部分) |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
（4）体细胞核移植制备转IGF-1基因奶山羊的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 转基因动物研发现状的研究进展 |
| 1 传统转基因技术 |
| 1.1 显微注射法 |
| 1.2 精子载体法 |
| 1.3 逆转录病毒感染法 |
| 1.4 胚胎干细胞介导法 |
| 2 现代的转基因技术 |
| 2.1 体细胞核移植技术 |
| 2.2 基因打靶技术 |
| 2.3 RNA干扰介导的基因沉默技术 |
| 2.4 慢病毒载体技术 |
| 2.5 诱导多能干细胞转基因技术 |
| 2.6 多基因转基因表达策略和分时段的调控表达策略 |
| 3 乳腺的进化、发育及泌乳调节 |
| 3.1 乳腺发育及泌乳 |
| 3.2 激素和细胞因子对乳腺发育的影响 |
| 3.3 影响乳腺的进化和泌乳的基因 |
| 3.4 影响乳腺表达的其它因素 |
| 4 IGF-1的功能及其与泌乳的关系 |
| 4.1 IGF-I基因的结构及定位 |
| 4.2 IGF-1的生物活性 |
| 4.3 IGF-1与乳腺发育以及泌乳之间的关系 |
| 第二章 提高转基因阳性细胞筛选效率的几种策略 |
| 1 转基因研究的瓶颈 |
| 1.1 转基因供体阳性细胞筛选效率过低,转基因总体效率低下 |
| 1.2 外源基因表达不稳定,表达水平低下 |
| 1.3 插入的基因的位置难以控制 |
| 2 外源DNA克服屏障进入细胞的机制 |
| 2.1 细胞内吞机制 |
| 2.2 溶酶体逃避的机制 |
| 2.3 胞质内的运输 |
| 2.4 外源DNA进入细胞核的途径 |
| 3 核定位信号肽促进DNA入核,增加转染效率 |
| 3.1 核定位信号的分类 |
| 3.2 核定位信号介导的入核机制 |
| 3.3 核输入的结构基础及调控 |
| 3.4 核定位信号肽及其复合物的应用 |
| 4 双亲性小分子作用细胞增加转染效率 |
| 4.1 双亲性小分子与核孔复合体之间的相互作用 |
| 4.2 双亲性小分子增加转染效率的研究 |
| 参考文献 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第三章 山羊乳腺特异性表达载体PIN的构建及其功能验证 |
| 摘要 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料和仪器 |
| 1.2 类胰岛素生长因子(IGF-1)基因的克隆 |
| 1.3 标记基因新霉素(neo)的克隆 |
| 1.4 乳腺特异性表达载体pIN的构建与验证 |
| 1.5 乳腺特异性表达载体pIN的生物学功功能验证 |
| 1.6 数据分析 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 igf-1基因和neo基因的克隆与分析 |
| 2.2 乳腺特异性表达载体pIN的鉴定 |
| 2.3 乳腺特异性表达载体pIN的生物学功功能验证 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 双亲性小分子DMSO和薄荷醇增加转染效率的研究 |
| 摘要 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料和仪器 |
| 1.2 MTT细胞毒性试验确定DMSO和薄荷醇使用浓度 |
| 1.3 荧光定量PCR检测DMSO和薄荷醇处理对细胞转染效率的影响 |
| 1.4 荧光显微镜观察DMSO和薄荷醇处理对细胞转染效率的影响 |
| 1.5 流式细胞检测DMSO和薄荷醇处理对细胞转染效率的影响 |
| 1.6 流式细胞检测DMSO和薄荷醇作用对细胞周期的影响 |
| 1.7 数据分析 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 MTT法检测不同浓度DMSO和薄荷醇对细胞的细胞毒性作用 |
| 2.2 荧光定量PCR检测转染效率 |
| 2.3 荧光显微镜观察转染情况 |
| 2.4 流式细胞检测转染效率 |
| 2.5 流式细胞检测DMSO和薄荷醇作用对细胞周期的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 核定位信号肽增加转染效率的研究 |
| 摘要 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料和仪器 |
| 1.2 NLS/DNA和SPB-NLS/DNA复合物的制备 |
| 1.3 琼脂糖凝胶阻滞试验 |
| 1.4 NLS和SPB-NLS对转染效率的影响 |
| 1.5 流式细胞分析NLS和SPB-NLS对细胞周期的影响 |
| 1.6 激光共聚焦观察NLS和SPB-NLS协助质粒DNA入核情况 |
| 1.7 Western-blot检测SPB-NLS介导的质粒在山羊乳腺上皮细胞上的表达情况 |
| 1.8 数据分析 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 琼脂糖凝胶阻滞试验确定最佳DNA与NLS/SPB-NLS的复合浓度 |
| 2.2 NLS和SPB-NLS对转染效率的影响 |
| 2.3 流式检测NLS和SPB-NLS介导的转染对细胞周期的影响 |
| 2.4 激光共聚焦观察质粒DNA的入核情况 |
| 2.5 Western-blot检测SPB-NLS介导的质粒在山羊乳腺上皮细胞上的表达情况 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 转IGF-1基因阳性克隆细胞的筛选及转IGF-1基因奶山羊的制备 |
| 摘要 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料和仪器 |
| 1.2 小羊耳皮成纤维细胞的分离和G418梯度抗性试验 |
| 1.3 乳腺特异性表达载体pIN转染成纤维细胞与细胞筛选 |
| 1.4 单克隆阳性细胞的PCR验证 |
| 1.5 核移植转IGF-1基因奶山羊的制备 |
| 1.6 数据分析 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 奶山羊胎儿成纤维细胞和小羊耳皮成纤维细胞G418梯度抗性试验 |
| 2.2 乳腺特异性表达载体pIn转染成纤细胞及细胞筛选 |
| 2.3 单克隆阳性细胞的PCR验证 |
| 2.4 转pIN基因奶山羊的制备情况 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第七章 转IGF-1基因奶山羊的鉴定 |
| 摘要 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料和仪器 |
| 1.2 PCR鉴定转IGF-1基因奶山羊 |
| 1.3 Southern-blot鉴定转IGF-1基因奶山羊 |
| 1.4 荧光定量PCR鉴定转IGF-1基因奶山羊插入基因拷贝数 |
| 1.5 TAIL-PCR鉴定转IGF-1基因奶山羊插入位点序列 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 PCR鉴定克隆奶山羊为转IGF-1基因奶山羊 |
| 2.2 Southern-blot进一步确定克隆奶山羊为转IGF-1基因奶山羊 |
| 2.3 荧光定量PCR鉴定转IGF-1基因奶山羊质粒插入拷贝数 |
| 2.4 TAIL-PCR鉴定转转IGF-1基因奶山羊外源基因插入位点序列 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 本文创新点 |
| 论文发表情况 |
| 致谢 |
（5）转人α-乳白蛋白基因的奶山羊胎儿成纤维细胞株的建立及转基因奶山羊的鉴定（论文提纲范文）
| 目录 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 第一部分 综述 |
| 第一章 动物转基因技术 |
| 1. 转基因动物研究方法 |
| 1.1 体细胞核移植介导法 |
| 1.2 精原干细胞法介导法 |
| 1.3 转座子介导法 |
| 1.4 RNA干扰介导法 |
| 1.5 诱导多能干细胞(iPS细胞)介导法 |
| 2. 转基因克隆动物研究发展现状 |
| 3. 转基因动物的应用 |
| 3.1 转基因技术在哺乳动物遗传育种中的应用 |
| 3.2 转基因技术在生物制药中的应用 |
| 3.3 转基因技术在建立动物模型和器官移植等医疗中的应用 |
| 4. 转基因技术存在的问题 |
| 参考文献 |
| 第二章 转基因动物乳腺生物反应器研究进展 |
| 1. 动物乳腺生物反应器原理 |
| 2. 乳腺特异性表达载体 |
| 2.1 乳腺特异性表达载体调控元件 |
| 2.2 常用表达载体 |
| 3. 动物乳腺生物反应器的应用 |
| 3.1 生物医药生产 |
| 3.2 改变乳汁成分,提高营养价值 |
| 4. 动物乳腺生物反应器存在问题 |
| 4.1 外源基因在乳腺中特异性表达问题 |
| 4.2 外源基因在动物基因中的整合问题 |
| 4.3 目的蛋白的翻译后修饰问题 |
| 4.4 对生态平衡的影响问题 |
| 5. α-LA研究进展 |
| 5.1 α-LA结构特性 |
| 5.2 α-LA生理功能 |
| 5.3 重组α-LA研究进展 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验部分 |
| 第三章 人α-LA调控序列克隆、转基因载体构建 |
| 摘要 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 真核载体PLAN的构建 |
| 1.4 质粒PLAN转染gFFCs后报告基因EGFP的表达 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1 含调控序列人α-LA基因克隆及鉴定 |
| 2.2 PLAN真核表达载体的构建与鉴定 |
| 2.3 质粒PLAN转染gFFCs后报告基因EGFP的表达 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 真核表达载体PLAN在山羊乳腺上皮细胞中的表达 |
| 摘要 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1 GMEC纯化与扩大培养 |
| 2.2 GMEC脂质体转染 |
| 2.3 Western-blot检测 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 整合含调控序列人α-LA基因奶山羊胎儿成纤维细胞株的筛选 |
| 摘要 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1 真核载体PLAN转染gFFCs后报告基因EGFP的表达 |
| 2.2 转基因阳性gFFCs克隆的PCR鉴定 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 转人α-LA基因奶山羊的鉴定 |
| 摘要 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1 RT-PCR检测 |
| 2.2 TAIL-PCR检测 |
| 2.3 测序结果分析 |
| 2.4 羊乳乳清蛋白总量测定 |
| 2.5 羊乳乳清中人α-LAWestern-blot检测 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（6）乳腺特异表达人BPI蛋白山羊克隆胚胎生产（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 插图与附表清单 |
| 缩略词表 |
| 文献综述 |
| 第一节 转基因动物研究进展 |
| 1.1 转基因动物的研究历史与现状 |
| 1.2 转基因动物的制作方法 |
| 1.2.1 原核注射法 |
| 1.2.2 精子介导法 |
| 1.2.3 体细胞核移植法 |
| 1.3 转基因动物的主要应用领域 |
| 1.3.1 抗病育种 |
| 1.3.2 生产性能改良 |
| 1.3.3 乳腺生物反应器 |
| 1.3.4 建立人类疾病模型和器官移植 |
| 1.3.5 基因功能与调控等基础研究 |
| 1.4 转基因动物存在问题及分析 |
| 1.5 转基因动物展望 |
| 第二节 动物乳腺生物反应器 |
| 2.1 动物乳腺生物反应器研究概况 |
| 2.2 启动子与调控元件 |
| 2.2.1 乳清酸蛋白基因 |
| 2.2.2 β-乳球蛋白基因 |
| 2.2.3 酪蛋白 |
| 2.2.4 人工染色体 |
| 2.2.5 基因打靶载体 |
| 2.3 乳腺表达载体的检测方法 |
| 2.4 动物乳腺生物的发展趋势 |
| 第三节 人杀菌性/通透性增强蛋白研究进展 |
| 3.1 抗菌肽简述 |
| 3.2 杀菌性/通透性增强蛋白研究概况 |
| 3.3 hBPI 结构与特性 |
| 3.4 生物学功能分析 |
| 3.5 人杀菌性/通透性增强蛋白基因克隆与表达 |
| 3.6 展望 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 结果 |
| 2.1 黄淮白山羊成纤维细胞系的建立 |
| 2.2 黄淮白山羊乳腺上皮细胞细胞系的建立 |
| 2.3 关中奶山羊成纤维细胞系扩大培养及性别鉴定 |
| 2.4 乳腺特异表达人杀菌通透性蛋白载体构建、鉴定、纯化 |
| 2.5 C127 细胞水平功能验证 |
| 2.6 稳定转染 hBPI 基因奶山羊成纤维细胞系的建立 |
| 2.7 体细胞核移植法生产转基因克隆胚胎及其早期发育效较 |
| 2.8 手工克隆胚胎生产与胚胎移植 |
| 2.9 乳腺特异性表达人杀菌性/通透性增强蛋白转基因小鼠型的建立 |
| 3 讨论 |
| 3.1 关于乳腺上皮细胞的分离、培养 |
| 3.2 SRY-PCR 法快速鉴定奶山羊成纤维细胞系性别 |
| 3.3 关于乳腺特异表达载体的设计 |
| 3.4 乳腺特异表达载体的检测方法 |
| 3.5 重组人杀菌性/通透性增强蛋白生物学活性分析 |
| 3.6 转基因阳性细胞株的筛选和早期胚胎发育 |
| 3.7 手工克隆胚胚胎移植生产转基因山羊 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）SB转座系统介导的hLF基因乳腺表达载体的构建及其表达研究（论文提纲范文）
| 目录 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词(Abbreviation) |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 SB转座系统的研究进展 |
| 摘要 |
| 1 SB转座子的结构、转座机制及特性 |
| 1.1 反向重复序列 |
| 1.2 SB转座酶 |
| 1.3 “睡美人”转座子的转座机制 |
| 1.4 SB转座子的遗传学特性 |
| 2 SB转座效率的研究 |
| 2.1 SB转座过程的检测方法 |
| 2.2 SB转座效率的影响因素 |
| 3 SB转座子的优缺点 |
| 4 SB转座子的应用 |
| 4.1 基因突变剂 |
| 4.2 SB转座子标签技术 |
| 4.3 转基因生物 |
| 4.4 基因修复和基因治疗 |
| 5 展望 |
| 参考文献 |
| 第二章 转基因动物乳腺生物反应器的研究进展 |
| 摘要 |
| 1 动物乳腺生物反应器的操作流程 |
| 1.1 乳腺生物反应器表达载体的构建 |
| 1.2 转基因技术的选择 |
| 1.3 胚胎移植 |
| 1.4 检测方法 |
| 2 动物乳腺反应器的应用 |
| 2.1 生产药用蛋白 |
| 2.2 生产基因工程疫苗 |
| 2.3 生产抗体 |
| 2.4 生产酶制剂 |
| 3 动物乳腺生物反应器的优缺点 |
| 4 展望 |
| 参考文献 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第三章 奶山羊B-乳球蛋白基因的克隆及其鉴定 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.3 pBLG-EGFP的构建 |
| 1.4 乳腺上皮细胞的纯化培养 |
| 1.5 乳腺上皮细胞的转染 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 PCR扩增3'BLG、5'BLG及EGFP片段 |
| 2.2 3’BLG、5'BLG、EGFP的TA克隆、酶切鉴定及测序 |
| 2.3 pcDNA3.1(-)-BLG-EGFP的构建与酶切鉴定 |
| 2.4 乳腺上皮细胞的一般形态学观察 |
| 2.5 流式细胞仪检测激素培养的CMECs细胞凋亡 |
| 2.6 乳腺上皮细胞的转染及荧光表达 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 SB转座系统介导的HLF基因乳腺表达载体 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 PCR扩增hLF片段 |
| 2.2 hLF的TA克隆、酶切鉴定及测序 |
| 2.3 pT_2-BLG-hLF的构建与酶切鉴定 |
| 2.4 RT-PCR检测hLF基因在激素诱导培养的转基因细胞中的表达 |
| 2.5 Western-Blotting检测 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 SB转座系统介导的转人乳铁蛋白基因奶山羊成纤维细胞株的建立 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 pT_2-BLG-hLF-EGFP-Neo载体的构建及其鉴定 |
| 2.2 CEFCs的分离培养及一般形态学观察 |
| 2.3 F3、F4代CEFCs生长曲线的绘制 |
| 2.4 G418对CEFCs最小致死量的测定结果 |
| 2.5 CEFCs的转染效率的优化 |
| 2.6 CEFCs的转染与筛选 |
| 2.7 PCR鉴定CEFCs阳性克隆细胞 |
| 2.8 转基因细胞的生长曲线 |
| 2.9 转基因细胞的核型分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 供体细胞的原代培养与生物学特性分析 |
| 3.2 脂质体转染体细胞效率的优化 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 附录 |
| 硕士期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（8）人α-乳白蛋白转基因载体的构建及其奶山羊胎儿成纤维细胞株的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语中英文对照 |
| 第一部分 综述 |
| 第一章 转基因动物乳腺生物反应器的研究进展 |
| 1 乳腺特异性表达载体 |
| 1.1 启动子调控元件 |
| 1.2 目的基因的选择 |
| 2 α-乳白蛋白的研究进展 |
| 2.1 α-乳白蛋白的结构与性质 |
| 2.2 α-乳白蛋白的功能 |
| 2.3 α-乳白蛋白转基因动物国内外研究概况 |
| 3 乳腺生物反应器的应用前景及所存在的问题 |
| 参考文献 |
| 第二章 基因打靶 |
| 1 基因打靶的策略 |
| 1.1 构建插入型载体(gene-insertion vector,O-type) |
| 1.2 构建置换型载体(gene-replacement vector,Ω-type) |
| 1.3 “打了就走”策略(“Hit and Run”) |
| 1.4 标记与交换法(tag and exchange) |
| 1.5 双置换法(double replacement) |
| 1.6 时空特异性基因打靶(spatiotemporal gene targeting,STGT)的策略 |
| 2 体细胞基因打靶 |
| 3 基因打靶效率的影响因素 |
| 3.1 同源臂长度与转基因效率 |
| 3.2 插入片段长度的影响 |
| 3.3 同源片段来源的影响 |
| 3.4 其他因素 |
| 4 基因打靶的筛选策略 |
| 4.1 PCR筛选方法 |
| 4.2 启动子缺失筛选 |
| 4.3 poly-A缺失筛选 |
| 4.4 正负筛选策略 |
| 5 基因打靶技术的应用 |
| 6 基因打靶的前景 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验部分 |
| 第三章 人α-乳白蛋白基因乳腺特异性表达载体的构建及在乳腺上皮细胞中的表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 载体5A的构建 |
| 1.4 载体B9的构建 |
| 1.5 山羊乳腺上皮细胞的培养 |
| 1.6 G418对GMEC最小致死量的确定 |
| 1.7 载体5A、B9的线性化 |
| 1.8 GMEC的转染与筛选 |
| 1.9 GMEC阳性细胞的PCR鉴定 |
| 1.10 转染细胞诱导表达 |
| 1.11 人α-乳白蛋白的mRNA检测 |
| 1.12 山羊乳腺上皮细胞的人α-乳白蛋白检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 乳腺特异性表达载体5A的鉴定 |
| 2.2 乳腺特异性表达载体B9的鉴定 |
| 2.3 GMEC的一般形态学观察 |
| 2.4 G418对GMEC最小致死量的确定 |
| 2.5 GMEC的转染与筛选 |
| 2.6 GMEC绿色荧光细胞的PCR鉴定 |
| 2.7 RT-PCR检测 |
| 2.8 Western-blot检测 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 奶山羊胎儿成纤维细胞的分离培养与脂质体转染条件优化研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 主要实验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 胎儿成纤维细胞的分离培养 |
| 2.2 胎儿细胞性别鉴定 |
| 2.3 gFFCs生长曲线 |
| 2.4 gFFCs转染条件的优化 |
| 3 讨论 |
| 3.1 供体细胞的体外原代培养模式的建立及生长特性 |
| 3.2 脂质体转染体细胞条件的优化 |
| 参考文献 |
| 第五章 整合人α-乳白蛋白基因奶山羊胎儿成纤维细胞株的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 细胞抗性实验 |
| 2.2 5A、B9转染奶山羊胎儿成纤维细胞后报告基因EGFP的表达 |
| 2.3 gFFCs克隆的PCR鉴定 |
| 2.4 转基因细胞的生长曲线 |
| 2.5 转基因细胞冻存与解冻 |
| 3 讨论 |
| 3.1 5A、B9转染奶山羊胎儿成纤维细胞后报告基因EGFP的表达 |
| 3.2 转基因阳性细胞的分离及扩大培养 |
| 3.3 阳性细胞的PCR鉴定 |
| 参考文献 |
| 第六章 TK负筛选标记基因打靶载体的构建及定点整合gFFCs的筛选 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 打靶载体的鉴定 |
| 2.2 GANC最佳筛选浓度的确定 |
| 2.3 打靶载体的转染、筛选与扩大培养 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 附录 |
| 发表文章 |
| 致谢 |
（9）转基因克隆法制作人溶酶体β-葡萄糖苷酶奶山羊乳腺生物反应器的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语中英文对照 |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 哺乳动物体细胞核移植研究进展 |
| 1 哺乳动物体细胞核移植技术的发展 |
| 2 哺乳动物体细胞核移植的基本技术环节 |
| 2.1 供体细胞的选择 |
| 2.2 核受体胞质的准备 |
| 2.3 供体细胞和受体细胞的重组 |
| 2.4 重构胚的激活 |
| 2.5 重构胚的培养 |
| 3 哺乳动物体细胞核移植有关机理研究进展 |
| 3.1 受体细胞和供体细胞的核质互作 |
| 3.2 体细胞供体核的表观重编程 |
| 4 体细胞核移植技术存在的问题与应用前景 |
| 4.1 体细胞细胞核移植技术存在的问题 |
| 4.2 应用前景 |
| 参考文献 |
| 第二章 转基因动物乳腺生物反应器生产重组药用蛋白的研究进展 |
| 1 转基因动物制药的诞生 |
| 1.1 细菌基因工程药物阶段 |
| 1.2 细胞基因工程药物阶段 |
| 1.3 转基因动物制药阶段 |
| 2 动物乳腺生物反应器的研究简史 |
| 3 乳腺生物反应器的分类 |
| 3.1 啮齿动物乳腺生物反应器 |
| 3.2 反刍动物乳腺生物反应器 |
| 4 乳腺生物反应器表达载体构建的研究 |
| 4.1 与乳腺组织特异性表达有关的调控元件 |
| 4.2 基于普通质粒的表达载体 |
| 4.3 基于人工染色体的表达载体 |
| 4.4 基于基因打靶的表达载体 |
| 5 乳腺生物反应器的制作技术及新方法进展 |
| 5.1 原核期胚胎的显微注射法 |
| 5.2 转座子介导法 |
| 5.3 逆转录病毒介导法 |
| 5.4 精子载体法 |
| 5.5 胚胎干细胞介导法 |
| 5.6 原始生殖细胞介导法 |
| 5.7 转基因克隆动物法 |
| 5.8 体细胞基因打靶制备乳腺生物反应器 |
| 5.9 诱导多能干细胞基因打靶制备乳腺生物反应器 |
| 6 乳腺生物反应器的鉴定 |
| 6.1 DNA水平的检测 |
| 6.2 RNA水平的检测 |
| 6.3 目的蛋白的检测 |
| 7 转基因乳腺生物反应器存在的问题 |
| 参考文献 |
| 第二部分 试验研究 |
| 第三章 人溶酶体β-葡萄糖苷酶基因的克隆及其在COS7细胞中的表达研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 人胎盘组织总RNA的完整性 |
| 2.2 GlcCerase cDNA的扩增 |
| 2.3 GlcCerase序列分析结果 |
| 2.4 pEGFP-GlcCerase重组质粒的构建与鉴定 |
| 2.5 荧光显微镜观察COS7细胞中GFP基因的表达 |
| 2.6 转染COS7细胞中GlcCerase基因的mRNA表达 |
| 2.7 转染COS7细胞中GlcCerase基因的蛋白表达 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 人GleCerase基因乳腺表达载体的构建及其在乳腺上皮细胞中的表达研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 乳腺特异性表达载体的鉴定 |
| 2.2 HC-11细胞的转染与鉴定 |
| 2.3 GlcCerase基因在转基因HC-11细胞中的诱导表达 |
| 3 讨论 |
| 3.1 乳腺特异表达载体的构建 |
| 3.2 乳腺特异表达载体的验证手段 |
| 3.3 乳腺上皮细胞合成乳蛋白的可能机制 |
| 参考文献 |
| 第五章 奶山羊胎儿成纤维细胞的分离培养及脂质体法转染研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 奶山羊胎儿成纤维细胞的一般形态观察 |
| 2.2 胎儿细胞性别鉴定 |
| 2.3 胎儿细胞生长曲线分析 |
| 2.4 胎儿细胞核型分析 |
| 2.5 胎儿细胞转染效率的优化 |
| 3 讨论 |
| 3.1 供体细胞的原代培养与生物学特性分析 |
| 3.2 脂质体转染体细胞效率的优化 |
| 参考文献 |
| 第六章 转人GlcCerase基因奶山羊胎儿成纤维细胞的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 细胞抗性试验 |
| 2.2 外源基因转染山羊胎儿成纤维细胞 |
| 2.3 稳定转染细胞的PCR鉴定 |
| 2.4 转基因细胞的生长曲线 |
| 2.5 转基因细胞的核型分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 转基因阳性细胞克隆的分离 |
| 3.2 转基因阳性细胞的筛选 |
| 3.3 转基因供体细胞的染色体倍性 |
| 参考文献 |
| 第七章 转人GlcCerase基因奶山羊克隆胚的构建及胚胎移植 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 山羊卵母细胞的体外成熟培养 |
| 2.2 山羊转基因体细胞的核移植 |
| 2.3 转基因体细胞克隆胚的体外培养与发育 |
| 2.4 转基因体细胞克隆胚的PCR检测 |
| 2.5 山羊转基因克隆胚的胚胎移植 |
| 3 讨论 |
| 3.1 转染和筛选对转基因克隆胚胎发育的影响 |
| 3.2 技术操作过程对核移植效率的影响 |
| 3.3 重构胚胎培养体系 |
| 参考文献 |
| 第八章 外源基因转染对奶山羊供体细胞生物学特性的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 培养细胞的形态与生长曲线 |
| 2.2 稳定转染细胞的PCR鉴定 |
| 2.3 外源基因转染对细胞周期分布的影响 |
| 2.4 外源基因转染对细胞凋亡的影响 |
| 2.5 外源基因转染对细胞基因表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 外源基因转染对奶羊体细胞周期分布和细胞凋亡的影响 |
| 3.2 外源基因转染对奶羊体细胞基因相对表达水平的影响 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 创新点 |
| 进一步研究的内容 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（10）人乳铁蛋白表达载体的构建及转基因阳性细胞株的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语中英文对照 |
| 第一章 人乳铁蛋白的研究进展 |
| 1 分布与含量 |
| 2 结构与特性 |
| 3 乳铁蛋白的代谢 |
| 4 乳铁蛋白基因的克隆及结构分析 |
| 5 生物学功能分析 |
| 5.1 参与铁代谢,促进铁吸收 |
| 5.2 抑菌作用 |
| 5.3 抗病毒生物学活性 |
| 5.4 免疫调节中的作用 |
| 5.5 促进细胞繁殖 |
| 5.6 调控基因表达 |
| 5.7 抗肿瘤作用 |
| 5.8 抗氧化活性 |
| 5.9 重组人乳铁蛋白在国外的研究现状 |
| 5.10 乳铁蛋白的应用前景展望 |
| 参考文献 |
| 第二章 乳腺表达载体的研究进展 |
| 1 乳腺表达载体构建的基础理论 |
| 1.1 启动子 |
| 1.2 5’和3’非翻译区 |
| 1.3 内含子对转基因动物表达效率的影响 |
| 1.4 增强子在分子生物学上的作用 |
| 1.5 位置效应对转基因动物表达效率的影响 |
| 1.6 翻译后修饰及功能基因选择 |
| 2 乳腺表达载体的启动子及其调控序列 |
| 2.1 乳清酸蛋白基因 |
| 2.2 β-乳球蛋白基因(β-lactoglobulin BLG) |
| 2.3 酪蛋白 |
| 2.4 人工染色体 |
| 2.5 体细胞打靶技术 |
| 2.6 乳腺生物反应器的应用前景及所存在的问题 |
| 参考文献 |
| 第三章 人乳铁蛋白cDNA基因乳腺表达载体的构建及其生物学功能分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 乳腺表达载体pGBC-hLF-Neo的鉴定 |
| 2.2 山羊乳腺上皮细胞GMC和C127细胞的培养 |
| 2.3 G418对山羊乳腺上皮细胞和最小致死量的测定结果 |
| 2.4 两种乳腺上皮细胞的转染及目的基因在基因组中的整合鉴定 |
| 2.5 RT-PCR检测hLF基因在激素诱导培养的转基因细胞中的表达 |
| 2.6 western-blot检测目的蛋白的分泌情况 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 稳定整合人乳铁蛋白cDNA山羊胎儿成纤维细胞的制备 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 乳腺表达载体的构建及其鉴定 |
| 2.2 外源基因转染山羊胎儿成纤维细胞 |
| 2.3 条件培养液对转基因细胞克隆生长结果的影响 |
| 2.4 多重PCR鉴定转基因阳性克隆细胞 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 人乳铁蛋白基因打靶载体的构建与山羊乳腺上皮细胞表达检测 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 hLF基因β-casein位点打靶载体的构建 |
| 2.2 转基因阳性细胞PCR检测结果 |
| 2.3 RT-PCR检测hLF基因在激素诱导培养的转基因细胞中的表达 |
| 3 讨论 |
| 3.1 基因打靶方式的选择与应用 |
| 3.2 基因打靶载体设计的原则与技巧 |
| 3.3 正负筛选标记基因Neo和tk的合理使用 |
| 3.4 打靶载体在山羊乳腺上皮细胞中的表达情况 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 发表文章 |
| 致谢 |
四、乳蛋白基因在转基因动物乳腺细胞中特异性表达的研究进展（论文参考文献）
- [1]转基因兔乳汁中重组吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂的纯化、结构分析和药效研究[D]. 张婷. 扬州大学, 2021
- [2]体外重组装人促卵泡激素的制备及转基因小鼠模型的构建[D]. 华荣茂. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [3]水牛乳腺基因表达谱与生长激素转基因水牛的初步研究[D]. 王锦. 广西大学, 2013(02)
- [4]体细胞核移植制备转IGF-1基因奶山羊的研究[D]. 林建. 南京农业大学, 2013(08)
- [5]转人α-乳白蛋白基因的奶山羊胎儿成纤维细胞株的建立及转基因奶山羊的鉴定[D]. 汪薇. 南京农业大学, 2013(08)
- [6]乳腺特异表达人BPI蛋白山羊克隆胚胎生产[D]. 桂涛. 安徽农业大学, 2012(07)
- [7]SB转座系统介导的hLF基因乳腺表达载体的构建及其表达研究[D]. 宋洋. 南京农业大学, 2012(01)
- [8]人α-乳白蛋白转基因载体的构建及其奶山羊胎儿成纤维细胞株的建立[D]. 丰秀静. 南京农业大学, 2010(05)
- [9]转基因克隆法制作人溶酶体β-葡萄糖苷酶奶山羊乳腺生物反应器的研究[D]. 张艳丽. 南京农业大学, 2010(06)
- [10]人乳铁蛋白表达载体的构建及转基因阳性细胞株的建立[D]. 孟立. 南京农业大学, 2010(06)