一、猪型(H1N1)流感病毒血凝素和神经氨酸酶基因来源的研究（论文文献综述）
赵玉仲[1]（2021）在《2018-2020年猪流感病毒分离鉴定和猪流感血清学调查》文中提出猪流感（Swine influenza,SI）是由猪流感病毒（Swine influenza virus,SIV）引起猪的一种急性、传染性呼吸道疾病,单纯感染SI时死亡率低,继发或混合感染其它病原体时,死亡率显着升高,给养猪业造成巨大的经济损失。SIV在世界的猪群中广泛流行。这些病毒在猪体内同时存在时,可能发生重排,改变其遗传特性和致病性,继而具备引发人类流感大流行的潜力。因此,及时对SIV进行监测,解析其遗传进化规律和流行情况,对SI的防控具有重要意义。本研究从山东省、河南省和湖北省养猪场以及生猪屠宰场采集鼻拭子样品5808份,肺脏、支气管等病料198份,总计6006份,通过SPF鸡胚尿囊腔接种进行病毒分离,总共分离出21株SIV,分离率0.35%,经过PCR鉴定,均为H1N1亚型SIV。对分离的21株病毒进行遗传进化分析,结果发现分离毒株分为两种基因型:19株病毒的PB2、PB1、PA、NP和M基因来自于2009甲型H1N1流感病毒（2009 pandemic H1N1 influenza virus,pdm/09 H1N1）谱系,HA和NA基因来自于欧亚类禽（Eurasian avian-likes H1N1,EA H1N1）SIV谱系,NS基因来自于经典H1N1（Classical swine H1N1,CS H1N1）SIV谱系。剩余两株病毒的八个基因全部来自于CS H1N1谱系。为了进一步了解SI的流行情况,本研究还对山东省、河南省、吉林省、辽宁省和山西省等不同省份的养猪场采集猪血清样本17865份,通过HI试验,使用EA H1N1、pdm/09 H1N1和H3N2 SIV抗原对血清样品进行检测,总血清阳性率为52.14%,其中EA H1N1、pdm/09 H1N1、H3N2、EA H1N1+pdm/09 H1N1、EA H1N1+H3N2、pdm/09H1N1+H3N2和EA H1N1+pdm/09 H1N1+H3N2 SIV检测到的总血清阳性率分别为28.89%、9.05%、0.07%、14.01%、0.07%、0.02%和0.04%。从以上数据可以看出,猪群中的血清阳性普遍存在,在单一亚型SIV感染中,EA H1N1的血清阳性率最高,在两种或三种亚型SIV混合感染中,EA H1N1+pdm/09 H1N1的血清阳性率最高。本研究对分离SIV进行遗传进化及关键氨基酸位点分析,同时对猪群中血清进行了检测,研究结果大大丰富了我国SI分子流行病学的内容,加深我们对SI流行现状的了解,从而为SI的防控提供理论依据。
张醒海[2]（2021）在《候鸟禽流感病毒遗传变异规律分析及在哺乳动物间传播机制研究》文中研究说明流感病毒是目前最受关注的人畜共患病原体之一,广泛分布在自然环境、家禽及候鸟等自然宿主中,可感染包括人类在内的多种哺乳动物,对国家生物安全、产业经济有着重要影响。该病毒对人类健康的危害主要表现为引起季节性流感、流感大流行和人感染动物流感等。候鸟是H3N8、H9N2和H5N8等众多亚型禽流感病毒的储存库,且这些病毒持续在我国候鸟中流行传播。近年来它们又出现新的生物表型或基因特性,如水禽不仅呈现无症状携带流感病毒,也出现了感染甚至致死的现象;部分候鸟来源的病毒,可发生水禽-陆禽的传播;出现禽源H9N2、H5N8感染人的现象。这些亚型病毒在中国候鸟中的流行、进化及引发公共卫生风险等问题亟待解决。本研究以监测中国东部候鸟禽流感病毒流行动态为切入点,研究内容包括发现候鸟禽流感病毒的亚洲-北美地区跨洲际传播的证据,揭示候鸟禽流感病毒在自然宿主中的遗传变异规律,提供禽流感病毒家禽-野禽间跨物种感染的证据,评估候鸟源禽流感病毒在哺乳动物间的传播能力以及识别决定禽流感病毒跨物种感染人的分子特征。第一部分:中国东部地区候鸟禽流感流行病学调查。在全球候鸟迁徙背景下,选取途经我国东部的东亚-澳大利亚候鸟迁徙路线上重要候鸟停歇与聚集地（湖南东洞庭湖、环渤海湾湿地、内蒙古图牧吉、上海崇明东滩）开展了2016-2019年为期四年的主动预警监测,分离跨洲际传播或新型重配候鸟源禽流感病毒株,并测定其全基因序列。监测过程中本研究共采集了来自96种不同鸟类的35604份样本,分离得到88株病毒,候鸟禽流感病毒携带率约为0.247%。亚型多样性分析表明分离毒株涵盖12种HA和9种NA组成的23种不同亚型。其中低致病性禽流感病毒H3、H6、H9亚型为优势流行毒株。病原学及血清学数据证明H9N2禽流感病毒在候鸟内广泛流行,H9N2禽流感病毒可以感染包括纵纹腹小鸮、红隼、苍鹰和雉鸡多种野生鸟类,在小型多宿主生态系统中H9N2可以发生有效的种间传播。自2020年10月底以来,H5N8病毒中国中东部候鸟中引发疫情。本研究证实了H5N8对大天鹅、尤鼻天鹅等候鸟的感染,确定2020 HPAIV H5N8为2.3.4.4b谱系。抗原性分析发现,由于抗原漂移,当前家禽H5疫苗株对2020年HPAIV H5N8病毒保护力下降,病毒传入家禽并大面积流行的风险极大,需要及时更新家禽候选疫苗株,并进一步加强监测和实施预防措施。第二部分:候鸟禽流感病毒遗传进化分析。本研究进而对禽流感病毒各基因片段在天然宿主中的进化速率及基因片段溯源分析:基于不同时间点分离的病毒之间遗传差异和时间分布,采用贝叶斯MCMC方法,估算各个基因片段进化变异的总体速率并推断其最近共同祖先（t MRCA）的年代。重点关注亚洲和北美洲之间候鸟禽流感病毒的洲际联系:利用病原基因组序列信息构建系统发育树,结合候鸟迁徙数据,分析病毒基因片段转移的方向性,通过各基因片段的地理溯源来确定亚洲和北美洲之间候鸟禽流感病毒的洲际联系,确定可能的病毒引入途径,解析候鸟在大陆之间和大陆内部的禽流感病毒流通过程中发挥的作用。系统发育分析揭示部分亚型AIVs基因片段存在洲际间的沟通与传播。遗传变异分析发现中国东部候鸟AIVs基因片段遗传多样性丰富、不同亚型及不同鸟种间出现基因节段流通与传播。H3N8亚型禽流感病毒在候鸟中广泛流行,且基因型十分丰富,分离到的8株H3N8禽流感病毒可以分为7个基因型。H13、H3N8亚型内部基因节段存在洲际间的沟通与传播。系统发生及基因型分析研究发现H9N2禽流感病毒存在由家禽向野禽溢出的现象。对2020 HPAIV H5N8进行各基因节段溯源,结合系统发生地理学及候鸟迁徙路线证明了2020年中国候鸟中流行的H5N8禽流感病毒为新型重配毒株,随候鸟迁徙由哈萨克斯坦及俄罗斯引入我国,明确了新型重排H5N8流感病毒各基因片段的进化地位和起源,揭示了H5N8禽流感病毒株在欧亚大陆内的洲内传播及非洲-欧亚大陆的洲际间传播的现象。第三部分:候鸟禽流感病毒公共卫生风险评估。在遗传变异分析的基础上,我们开展候鸟禽流感病毒新型重配病毒受体结合特性及其在非天然宿主中的致病与传播能力评估。针对首次出现感染人的2020 HPAIV H5N8高致病性禽流感病毒,采用哺乳动物模型评估其在不同宿主上的致病性及传播能力,评估其公共卫生风险;针对由家禽溢出到野鸟的H9N2亚型禽流感病毒,我们结合病毒基因组变异分析,受体结合偏好性与哺乳动物致病性及传播能力分析,系统评估其公共卫生风险;针对在候鸟中广泛流行的多个基因型的H3N8亚型禽流感病毒,我们评估其受体结合能力,利用小鼠、豚鼠、雪貂等动物模型检测其在哺乳动物致病性及传播能力,分析研判H3N8亚型人群间传播的潜在风险。生物学特性评估发现H5N8禽流感病毒在人际间传播的风险仍然很低,此判断基于H5N8禽流感病毒偏好与禽类受体结合,而且在豚鼠中不具备传播能力的研究数据。尽管近来首次出现2020 HPAIV H5N8禽流感病毒感染人的状况,本研究证实H5N8禽流感病毒尚不具备在人际间流行的潜力,提示其产生的公共卫生威胁有限。由家禽溢出到候鸟的H9N2毒株结合人样受体后,可以在豚鼠及雪貂模型间通过直接接触及呼吸道飞沫途径进行高效传播,这些结果强调了H9N2亚型禽流感病毒存在能够引发人际间流行的潜在的公共卫生风险。受体结合检测证实H3N8毒株普遍具有结合人样受体的能力,在豚鼠模型中具备高效的接触传播及呼吸道飞沫传播能力。候鸟H3N8亚型禽流感病毒具有感染人类并在人群中传播的潜在风险。第四部分:候鸟源H3N8禽流感病毒在哺乳间传播的分子机制研究。在候鸟源H3N8禽流感病毒的哺乳间传播评估过程中,本研究发现T222毒株不能在雪貂模型中通过呼吸道飞沫传播,而T222豚鼠适应1代毒株可以经呼吸道飞沫传播。因此,我们选择传播能力差异明显但遗传背景相似的以上两株H3N8亚型禽流感病毒毒株,结合反向遗传学技术,构建了PB1-S524G突变质粒并拯救r T222-S524G突变体。采用体外聚合酶活性检测,我们证实PB1-S524G突变增强了病毒聚合酶活性。进一步利用小鼠、豚鼠和雪貂等动物模型,发掘决定H3N8亚型哺乳动物间传播的关键分子标记。本研究证实PB1-S524G突变可以赋予H3N8在雪貂间经呼吸道飞沫传播的能力。PB1-S524G突变增强了病毒体内外复制能力,提高病毒在小鼠及雪貂上呼吸道的病毒复制滴度,加剧了由病毒导致的雪貂肺脏的病理损伤。研究结果表明PB1-S524G是影响候鸟H3N8禽流感病毒在哺乳动物宿主上致病及传播能力的关键分子标记。以上研究结果提示我们应持续加强对候鸟禽流感病毒的监测及对公共卫生安全的威胁进行评估,进一步加强候鸟禽流感病毒跨物种传播的分子机制的研究,为禽流感防控提供理论依据。
赵凤鸣[3]（2021）在《一株人类分离H9N2禽流感病毒哺乳动物致病性研究》文中研究表明【研究背景】人感染禽流感事件在国内频发。且国内几乎所有的禽流感疫情均和H9N2亚型相关。H9N2禽流感病毒将内部基因捐献给H5N1和H7N9等亚型,帮助其完成从野禽病毒到家禽病毒的过渡,并进一步造成人类感染。同时,H9N2亚型禽流感病毒亦可感染人,但症状轻微。目前全球的确诊病例约70例,多半发生在中国。在本课题,我们报道了一例H9N2感染患者。该患者是一名9岁孩童,病情危重,危及生命,但由于及时救治和正确治疗,患儿转危为安。此病例的病情与过往报道的H9N2感染病例差异极大。我们从临床样本中成功分离了H9N2禽流感病毒。命名为A/Suzhou/GIRD01/2019（H9N2）（SZ/GIRD01）。随后,我们对该毒株进行了风险评估,分析了该毒株对人的致病潜力。对该毒株和以往的H9N2经典毒株以及同时代的禽源H9N2毒株进行了详细对比。【研究目的】本项目通过基因分析,体内、外实验分析等手段,探究人源病毒株SZ/GIRD01对哺乳动物以及人的致病潜力。【研究方法】1.临床分析:1、利用患者的病程记录,结合文献报道的其它H9N2感染者情况,综合分析和对比H9N2感染患者发病特点;2、利用Real Time PCR技术分析检测样本中的病毒核酸,评估患者排毒特点;3、分析患者流行病学史,结合对患者父母的检测结果,综合判断患者可能的感染途径;4、对患者呼吸道样本进行二代测序,分析流感病毒在患者体内的适应性进化。2.临床病毒分离和毒株培养:1、从临床样本分离病毒株;2、通过反向遗传学方法构建作为对照的病毒株;3、在鸡胚或者MDCK细胞中培养病毒;4、浓缩病毒。3.SZ/GIRD01毒株的基因分析:1、对SZ/GIRD01毒株进行测序分析;2、构建系统发育树,分析SZ/GIRD01毒株的基因型,并对毒株进行基因溯源;3、执行多序列比对,识别SZ/GIRD01毒株及其它国内分离的H9N2毒株的基因特点和关键的基因标记物。4.体外实验:1、在MDCK细胞系中检测病毒复制动力学;2、利用ELISA方法检测病毒对不同类型的唾液酸受体类似物的结合情况;3、利用ELLA和MUNANA实验分析检测病毒神经氨酸酶活性;4、利用血凝素和神经氨酸酶工作温度不同,进行病毒洗脱实验观察HA和NA之间的平衡;5、检测不同毒株对神经氨酸酶抑制剂的敏感性。5.小鼠模型:构建BALB/c小鼠感染模型,根据小鼠体重变化情况评估病毒对哺乳动物的致病性。并在小鼠感染后第28天收集血清,利用血凝抑制试验测定血清抗体产生情况。【实验结果】1.患者因发热、呕吐、喘息和呼吸困难入院。入院当天迅速转入ICU病区,采用机械通气供氧。患者被诊断为肺炎和I型呼吸衰竭。在患者的肺泡灌洗液中发现了呼吸道合胞病毒和甲型流感病毒。住院期间,采用抗病毒、抗菌、抗炎及支持治疗,患者成功康复,于入院第13天出院。2.在患者肛拭子、咽拭子和肺泡灌洗液中均检测到了H9N2禽流感病毒,表明下呼吸道和肺外组织受累。3.G57基因型是目前国内H9N2亚型病毒的优势基因型。SZ/GIRD01属于G57基因型。4.国内的H7N9、H9N2和部分H5亚型毒株共享内部基因。SZ/GIRD01毒株PA基因和H7N9的PA基因在基因树上聚集成独立分支。其它7个基因和长江三角洲地区分离的H9N2毒株相似度高;5.G57亚型毒株携带有哺乳动物适应性氨基酸突变,包括HA-Q226L、NA62-64氨基酸删失、PB2-E627V、HA-T190A、PA-K356R等。此外,SZ/GIRD01出具有上述突变外,还携带有HA-N158D、PB2-V598I突变;6.SZ/GIRD01在哺乳动物细胞中展示出比季节性流感毒株（H1N1、H3N2）和先代H9N2毒株（G1系、BJ94系H9N2毒株）更强的复制能力;7.SZ/GIRD01毒株可与ɑ2,3和ɑ2,6唾液酸受体结合,但更倾向于结合α2,6（人类受体）;8.SZ/GIRD01对神经氨酸酶抑制剂敏感;9.SZ/GIRD01可在无前期适应的情况下感染小鼠。被感染小鼠无明显症状,病情较轻。【结论】我们的研究结果发现人源SZ/GIRD01毒株的致病性要弱于禽源ZJ/198毒株。但这两株G57毒株均表现出相同的受体结合倾向性和体外复制能力。尽管SZ/GIRD01对小鼠致病能力不强,但其更倾向结合人类受体以及在体外的高复制能力均表现出该毒株对人的致病潜力。同时,我们的系统发育分析明确了G57基因型毒株在国内的优势地位,也证实了不同亚型病毒之间的广泛重组现象。基因分析结识了G57基因型毒株具有的多种哺乳动物适应性突变。上述结果反应了国内流行的H9N2毒株的潜在威胁性。我们应当加强对H9N2病毒的监控,防患于未然。
李培东[4]（2021）在《艾比湖野鸟源低致病性禽流感病毒的分离鉴定》文中研究说明目的:多项研究表明,野生鸟类携带多种病原微生物,对禽流感而言野鸟的迁徙以及市场活禽的交易促进了不同地域、不同禽类、不同亚型流感病毒的相互重组。对艾比湖湿地自然保护区野生鸟类禽流感病毒的检测对新疆地区的畜牧业、疫病防制起到预警作用。方法:本研究对采集自新疆艾比湖自然保护区野鸟的粪便棉拭子上清液使用禽流感特异性引物M229对样品做禽流感病毒的检测,对禽流感阳性样品使用HA通用引物进行PCR扩增、测序、分析。序列分析后使用9日龄的普通鸡胚进行禽流感病毒的分离,对分离得到的鸡胚尿囊液使用禽流感病毒通用引物对病毒的基因型进行鉴定;又对分离株的血凝素和神经氨酸酶的生物信息学信息进行了预测分析并对这两株毒株的全基因组序列进行分析。获得病毒后分别对分离毒株进行了全基因组序列扩增,连接T载体后转化至DH5α感受态细胞中,涂布平板后挑取单个菌落摇菌、测序;最后分别感染雌性balb/c小鼠以及四周龄无免疫鸡,观察、测定分离株致病力。结果:本研究共采集样品拭子80份,检测到禽流感阳性率为18.75%,分离出两株代表性低致病性禽流感病毒,分别命名为A/Wide Bird/Ebinur Lake/40/2017（H1N2）和A/Wide Bird/Ebinur Lake/47/2017（H3N8）。分离株的血凝素裂解位点都不包含有任何一种连续碱性氨基酸,并且都符合低致病禽流感氨基酸序列的特点。分离株的血凝素与神经氨酸酶均具有亲水性。A/Wide Bird/Ebinur Lake/40/2017（H1N2）血凝素蛋白信号肽剪切位点为SKA-DT,连续氨基酸数量超过10个的B细胞抗原表位共12个,具有25个抗原决定簇和59个肽段。A/Wide Bird/Ebinur Lake/40/2017（H1N2）神经氨酸酶连续氨基酸数量超过10个的B细胞抗原表位共9个,具有15个抗原决定簇和55个肽段。A/Wide Bird/Ebinur Lake/47/2017（H3N8）血凝素蛋白信号肽剪切位点为AFS-QD,连续氨基酸数量超过10个的B细胞抗原表位共12个,具有17个抗原决定簇和51个肽段。A/Wide Bird/Ebinur Lake/47/2017（H3N8）神经氨酸酶连续氨基酸数量超过10个的B细胞抗原表位共9个,具有16个抗原决定簇和46个肽段。两株分离株均可以在雌性balb/c小鼠以及四周龄无免疫鸡体内进行复制,且对雌性balb/c小鼠以及四周龄无免疫鸡均无致死作用,A/Wide Bird/Ebinur Lake/40/2017（H1N2）静脉接种指数为0.11,A/Wide Bird/Ebinur Lake/47/2017（H3N8）静脉接种指数为0.08,均小于1.2,进一步证实其为低致病性禽流感病毒。且在感染第14天对每只鸡分离血清进行血凝抑制试验,其血清阳性率分别为:H1N2（点眼、滴鼻感染）为70%、H1N2（同群感染）为40%、H3N8（点眼、滴鼻感染）为40%、H3N8（同群感染）为20%,但各组血凝抑制效价均很低。结论:本研究成功的从艾比湖野鸟粪便拭子中分离出两株禽流感病毒,且粪便拭子禽流感阳性率为18.75%,证实艾比湖野鸟中存在禽流感病毒。经全基因组序列分析、毒株对雌性balb/c小鼠以及四周龄无免疫鸡的致病性及对分离株进行生物信息学分析研究,证实分离出的两株病毒均为低致病性禽流感病毒;分离株存在多种亚型病毒重组现象,可以感染雌性balb/c小鼠以及可以在四周龄无免疫鸡中复制和传播。
冯兆民[5]（2020）在《欧亚类禽H1N1猪流感病毒分子进化与致病机制研究》文中提出猪被认为是流感病毒的基因混合器,人流感和禽流感病毒都可以感染猪,并可在猪中发生基因重配产生新病毒。欧亚类禽H1N1猪流感病毒（Eurasian avian-like H1N1 swine influenza viruses,EA H1N1 SIVs）于 1979 年 1 月首次在欧洲发现,随后逐渐在欧洲和亚洲地区猪群中流行,同时EA H1N1 SIVs不断与其它在猪群中共同流行的流感病毒发生重配,包括2009年甲型H1N1流感（2009 pandemic H1N1,A（H1N1）pdm09）、经典猪流感病毒（Classical swine H1N1,CS H1N1）和三源重配 H1N2 流感病毒（Triple reassortment H1N2,TR H1N2）,从而产生了多种基因型病毒。我国于2001年首次从香港的猪群中分离到EA H1N1 SIV,经过长期的进化,我国猪群中流行的EA H1N1 SIVs更加倾向于结合人α-2,6半乳糖苷唾液酸受体,部分病毒还可以在雪貂中经呼吸道飞沫有效传播,因此,欧亚类禽H1N1猪流感病毒被认为是引起下一次流感大流行可能性最大的动物流感病毒。本研究首先系统分析了我国EA H1N1 SIVs的流行、基因多样性和关键分子标记。研究发现,2001-2018年,我国从19个省市的猪或者感染病例中分离到的EA H1N1 SIVs可分为11个基因型（基因型1～基因型11）。其中基因型1占55.3%,该基因型病毒的8个基因节段均来自于早期的EA H1N1病毒;基因型2～11 分别由 EA H1N1、A（H1N1）pdm09 和 TRH1N2 病毒重配产生。2001-2013年,基因型1广泛流行;2009-2013年,基因型1、2和4共同流行;自2013年起,基因型3和5病毒逐渐成为主要的基因型。广东省检测到的基因型最多,共有7种基因型病毒。分子标记分析表明,含有HA-190D和HA-225E（H3编码）的EA H1N1 SIVs分别占85.9%和84.1%,表明我国猪群中流行的大多数EA H1N1病毒更倾向于结合人α-2,6半乳糖苷唾液酸受体。EA H1N1 SIVs在猪群的流行过程中偶尔会发生跨种传播感染人。201 1年,江苏省报告我国第一例人感染EAH1N1 SVs[A/Jiangsu/1/2011（JS1）],该病毒的8基因片段全部来自于EAH1N1 SIVs,属于基因型1病毒。2015年,在湖南省人感染欧亚类禽H1N1猪流感病毒病例中分离到新的三源重配EA H1N1 SIVs,A/Hunan/42443/2015（HuN）,其中 HA、NA 和 M 基因来自于 EA H1N1 SIVs,PB2、PB1、PA 和 NP 基因来自于 A（H1N1）pdm09,NS 基因来自于 TR H1N2 SIVs,该病毒属于基因型3病毒。我们前期的研究发现基因型3（HuN-like）病毒在小鼠中的致病力明显高于基因型1病毒（JS1-like）,但是具体致病机制尚不清楚。为了阐明两种基因型病毒在小鼠中致病力差异的分子机制,我们首先将HuN和JS1病毒的基因片段进行重配,得到不同的重配病毒。通过小鼠实验发现,NP基因是决定EA H1N1 SIVs在小鼠中致病力的重要因素。进一步对NP基因序列进行分析发现,HuN-like病毒和JS1-like病毒在NP基因上存在三个具有种属特异性的氨基酸差异,分别是R305K、F313V和Q357K。为了确定NP-R305K、F313V和Q357K对小鼠致病力的影响,我们以HuN病毒为骨架引入相应突变,感染小鼠后发现,当HuN病毒引入NP-K357Q突变后,EAH1N1 SIVs在小鼠中的感染力、复制力和毒力均显着下降,同时,NP-K357Q突变也降低了病毒在细胞上的聚合酶活性和复制滴度。因此,NP-Q357K是决定HuN-like和JS1-like病毒在小鼠中致病力不同的关键氨基酸。前期研究发现PB2-E627K、D701N和T271A突变是影响H5N1和H7N9流感病毒致病力的关键分子标记。在JS1-like和HuN-like病毒中,PB2基因的627位氨基酸均为E,701位氨基酸分别为N和D,271位点的氨基酸分别为T和A。之前的研究发现PB2-D701N突变增强了 EAH1N1流感病毒在小鼠中的致病力,但是PB2-T271A突变对EA H1N1 SIVs致病力的影响还未见报道。我们的研究发现PB2-T271A突变显着增加了病毒在A549、PK15和DF-1细胞上的复制能力,以及在小鼠中的致病力。说明PB2-T271A突变也是影响EAH1N1 SIV在小鼠中致病力的重要分子标记。综上所述,本研究系统分析了 2001年以来,我国EA H1N1 SIVs的进化和关键分子标记,发现基因型3和5目前是我国猪群中主要流行病毒;NP基因是决定EA H1N1 SIVs在小鼠中致病力的重要因素,NP-Q357K作为一种新影响EA H1N1 SIV在小鼠中致病力的重要分子标记;PB2-T271A突变也显着增加了 EA H1N1 SIVs在小鼠中的致病力。这些结果为EA H1N1 SIVs的风险评估和精准监测提供了科学依据。
汪炯炯[6]（2020）在《JAK酪氨酸激酶抑制剂（来氟米特和姜烯酮）的抗流感病毒药物活性研究》文中研究说明流行性感冒（简称流感）是由流感病毒（Influenza Virus,IV）引起的急性呼吸道疾病,具有高度传染性、传播快、可跨种间传播等特点。根据血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）的不同组合,A型流感病毒（Influenza A Virus,IAV）可进一步分为许多亚型。IAV可以导致人和动物高发病率和死亡率,如新型重配禽流感病毒包括H7N9、H5N6、H7N7和H10N8会导致人类的零星致命性感染,对全球公共卫生安全和农业健康发展造成了极大的威胁。当前,结合基础研究研制新的疫苗和抗病毒药物应用于流感病毒的预防和治疗迫在眉睫。当前有效防治流感病毒感染的主要方式是疫苗接种和使用抗病毒药物。目前流感疫苗存在对宿主保护有限以及对因抗原漂移或变异产生的新型流感病毒无效等问题。在临床上使用的抗流感药物主要以流感病毒神经氨酸酶抑制剂和M2离子通道阻断剂为主,同时多种RNA聚合酶抑制剂获得批准用于治疗流感,但是这些药物存在副作用、有限疗效和耐药性等不足。临床上迫切需要开发针对新靶点和降低耐药性的新型抗流感药物,同时寻找参与病毒复制的关键宿主因子并将其作为抗病毒药物治疗的靶点这成为研究热点。近年来通过高通量筛选以及基因敲除等遗传学手段发现Janus家族激酶（Janus kinases,JAK）JAK1和JAK2,在流感病毒复制过程中起重要作用。JAK1和JAK2基因沉默以及JAK激酶抑制剂可抑制流感病毒基因组的复制;此外,JAK2激活参与流感病毒颗粒的装配过程。这些研究结果提示JAK激酶可作为治疗流感病毒的药物靶点。本研究的目的是通过筛查临床上使用的药物以及筛选具有抗病毒活性的中草药成份寻找JAK激酶抑制剂并研究其抗病毒活性。来氟米特（leflunomide）是一种免疫抑制剂类药物,主要用于治疗人类风湿性关节炎。该药物的活性代谢产物A77 1726能够抑制p70 S6激酶（S6K1）、蛋白酪氨酸激酶活性以及通过抑制二氢乳清酸脱氢酶（DHO-DHase）活性来抑制嘧啶单核苷酸的合成。最近研究发现来氟米特除了抗炎和调节免疫功能外,还具有一定的抗病毒活性。但来氟米特是否具有抗流感病毒的活性仍未有报道,来氟米特抗病毒的分子机制存在很大争议。本实验室前期的工作发现A77 1726作为一种酪氨酸激酶抑制剂,能够抑制淋巴细胞中JAK1和JAK3的活性。本研究旨在确定A77 1726是否可通过抑制JAK激酶活性来抑制流感病毒感染。鉴于来氟米特是一类人工合成的小分子化合物,临床上可以长期使用,但对于少数病人仍具有一定的副作用。本研究的第二个切入点是从具有抗病毒活性的植物中寻找出JAK激酶抑制剂并将其开发为抗病毒药物;生姜在远古时代已用于治疗“热病”,具有抗病毒、细菌、真菌和线虫多种功效。研究发现生姜提取物可以抑制疱疹病毒、鼻病毒和呼吸道合胞病毒的复制。此外,生姜是治疗呼吸道感染的几种中药处方中的重要成分。迄今为止,有关生姜提取物中与其抗流感病毒活性有关的化合物的特性知之甚少。姜烯酮A（Gin A）是一种从生姜中提取的化合物,可作为JAK2和S6K1的双酶抑制剂。本研究的第二部分内容将探讨姜烯酮A能否通过抑制JAK2活性来抑制流感病毒感染。1.来氟米特抗流感病毒感染的药物活性研究为了研究来氟米特对流感病毒复制的影响及其分子机制,我们通过体外实验发现A77 1726 能显着抑制 A/mallard/Huadong/S/2005（H5N1）、A/PR/8/34（H1N1）和Ck/SH/F/98（H9N2）等IAV在鸡胚成纤维细胞（CEF）、人肺癌细胞系（A549）和犬肾细胞系（MDCK）中的复制。通过qPCR和Western blot实验发现A77 1726能降低病毒基质蛋白（M1）的mRNA水平和病毒核蛋白（NP）、M1及血凝素（HA）的表达水平。同时,通过检测荧光素酶报告基因分析发现A77 1726能降低病毒Ribonucleoproteins（RNP）（PB2、PB1、PA 和 NP）聚合酶活性;与此相一致,体内试验发现来氟米特能减缓IAV感染小鼠体重减轻症状、延长小鼠存活时间,并且显着降低肺组织中的病毒载量和减轻小鼠肺脏病理损伤。为了进一步研究A77 1726对流感病毒复制的机理,通过Western blot分析发现,S6K1抑制剂PF-4708671和单核苷酸合成抑制剂Brequinar Sodium（BQR）不能抑制流感病毒的复制。而使用JAK特异性抑制剂Ruxolitinib（Rux）,能有效抑制流感病毒的复制。我们的研究进一步证明A77 1726抑制JAK1、JAK2和STAT3磷酸化。JAK2基因过表达促进了 H5N1病毒的复制,并减弱了 A77 1726的抗病毒活性。这些结果表明A77 1726具有抑制JAK2活性的能力,并且抑制JAK活性与其抗流感病毒活性密切相关。2.姜烯酮A抗流感病毒感染的药物活性研究JAK2在A型流感病毒复制中起重要作用。姜烯酮A（Gin A）作为一种生姜根部提取物,是JAK2和S6K1激酶的双酶抑制剂。为了研究姜烯酮A对流感病毒复制的影响及分子机制,通过体外试验发现姜烯酮A能显着降低A/mallard/Huadong/S/2005（H5N1）、A/PR/8/34（H1N1）和 Ck/SH/F/98（H9N2）三种亚型的 IAV 在 293T、MDCK、A549和DF-1细胞培养上清中的病毒滴度;同样地,体内试验进一步证明姜烯酮A可降低H5N1病毒感染小鼠肺组织中的病毒载量、改善小鼠体重减轻症状及延长小鼠的存活时间。我们进一步研究了姜烯酮A抗流感病毒感染的作用机制,通过qPCR和Western blot分析发现姜烯酮A降低了病毒基质蛋白（M1）的mRNA水平,降低病毒碱性聚合酶2（PB2）、NP和M1的蛋白表达水平。此外,荧光素酶报告基因分析发现姜烯酮A能抑制病毒RNP聚合酶活性;以293T细胞为模型,发现JAK激酶特异性抑制剂（Rux）能有效抑制IAV复制,而S6K1特异性抑制剂PF-4708671对病毒复制没有影响。Rux和姜烯酮A均可以抑制JAK2自磷酸化和它的底物STAT3磷酸化。通过细胞转染试验,结果显示JAK2过表达促进H5N1病毒的复制,并减弱了姜烯酮A介导的抗病毒活性。综上所述,生姜提取物姜烯酮A通过抑制JAK2活性来抑制IAV复制,提示姜烯酮A可能成为一个具有新型抗流感病毒药物的潜力。综上所述,本论文通过研究两种JAK家族激酶抑制剂,验证了 JAK在流感病毒复制中具有重要作用,进一步证实JAK是一个重要的抗流感病毒的分子靶标。另外,本研究进一步阐明A77 1726抗病毒的药物机理,表明A77 1726通过抑制JAK酪氨酸激酶活性来发挥其抗病毒作用,其抗病毒活性与其抑制单核苷酸合成以及抑制S6K1激酶活性无关。最后,明确姜烯酮为生姜中的一个有效抗病毒活性的成份,并阐明姜烯酮通过抑制JAK激酶而不是S6K1激酶活性发挥其抗病毒活性。来氟米特是一种临床上已经使用的抗类风湿性关节炎药物,且已有临床数据显示来氟米特具有抗CMV和BK病毒的疗效。姜烯酮来源于食材,预期副作用较低。鉴于此,我们预期这两种候选药物有望通过“老药新用”的绿色通道,快速进入临床试验,并用于治疗流感以及其它病毒性疾病如冠状病毒感染引起的新冠肺炎。
夏炫梓[7]（2020）在《20172018年广州市乙型流感病毒HA、NA基因特征及中西药抗病毒药效初筛研究》文中研究指明【背景】根据WHO流感监测数据显示,2017年第45周至2018年第13周,在全球范围内,乙型流感病毒成为季节性流感的优势株,其中Yamagata谱系占据主导优势,对人群的健康带来一定程度的影响。针对流感的防治,西医主要通过注射流感疫苗进行免疫预防和使用化学药物阻断病毒的繁殖进程,中医药通过抑制病毒复制、调节机体炎症反应等多方面发挥作用。化学药物主要以神经氨酸酶抑制剂和M2离子通道阻滞剂为主,传统中药主要以单味中药和中药复方为主。反向遗传学对流感病毒的基因研究具有重要的意义。甲型流感病毒的反向遗传学技术平台已被广泛构建和应用,而乙型流感病毒的反向遗传学技术平台的成功构建却鲜有报道。【目的】本研究深入了解2017～2018年广州市流行的乙型流感病毒HA和NA的基因特征和流行原因,探索病毒序列新变异是否会引起病毒功能性改变,为流感监测防控和药物治疗流感提供科学依据。另外,构建乙型流感病毒反向遗传学平台,为乙型流感病毒基因研究和中药抗乙型流感病毒机制研究提供基础。【方法】一、采集2017年12月～2018年4月在广州市哨点医院的流感患者的咽拭子样本,应用免疫荧光法检测出乙型流感病毒样本后进行病毒分离培养和病毒RNA提取,通过一步法RT-PCR扩增病毒目的基因血凝素和神经氨酸酶,再进行基因序列测定和分析。二、根据序列比对分析的结果,选用神经氨酸酶基因上具有未报导过的氨基酸突变位点的9株病毒进行奥司他韦和帕拉米韦体外药物敏感性实验筛选,观察是否存在耐药性病毒株,以及使用连花清瘟胶囊进行体外抗病毒活性实验,观察奥司他韦、帕拉米韦与连花清瘟胶囊抑制病毒活性之间的差异。使用100TCID50的病毒量感染MDCK细胞后,分别加入连续半数稀释浓度的奥司他韦溶液、帕拉米韦溶液和连花清瘟胶囊溶解液,观察细胞病变和计算IC50值。三、根据序列比对分析的结果,选用血凝素基因上具有未报导过的氨基酸突变位点的9株病毒进行生长曲线实验观察病毒株之间增殖能力的差异。使用0.01MOI的病毒量感染MDCK细胞,分别在24h、48h和72h回收病毒上清液,再通过空斑实验来观察病毒株的增殖能力。四、使用pHW2000载体为骨架,构建包含各个病毒基因片段的8个重组质粒,将质粒混合后转染293T和MDCK混合细胞,培养后通过感染MDCK细胞进行病毒传代,进而完成乙型流感病毒的拯救。【结果】一、总共分离扩增2017～2018年乙型流感病例鼻咽拭子样本40份,成功分离出38株,初步鉴定出Yamagata系28株,Victoria系10株。对38株乙型流感病毒的HA、NA基因进行测序并构建进化树进行分析,（1）HA进化分析显示:28株Yamagata系乙型流感病毒的HA基因均属于Yamagata Clade 3分支,并且与疫苗株B/Phuket/3073/2013属于同一亚支,还有一个亚支为B/Wisconsin/1/2010类似株;10株Victoria系乙型流感病毒均属于Victoria Clade 1A分支,其中以B/Hong Kong/286/2017和B/Norway/2409/2017为代表的进化亚支Clade lA（▲1、▲2）中未出现广州市流行株。（2）NA进化分析显示:28株Yamagata系乙型流感病毒中有27株的NA基因属于Yamagata Clade 3分支,并且与疫苗株B/Phuket/3073/2013属于同一亚支;10株Victoria系乙型流感病毒均属于Victoria Clade 1A分支,以B/Norway/2409/2017为代表的进化亚支Clade lA（▲2）中未出现广州市流行株,以B/Hong Kong/286/2017为代表的进化亚支Clade lA（▲1）中出现广州市流行株。另外,发现了病毒株B/Guangdong/GZ20/2018毒株为BY-HA/BV-NA系间重配病毒。对38株乙型流感病毒进行HA、NA氨基酸序列分析,（1）HA氨基酸序列分析:28株Yamagata系病毒株（包括B/Guangdong/GZ20/2018）共有11个氨基酸位点发生突变,28株均携带L187Q和M266V突变;另外,发现突变位点S93P、R151K、N179K、P342S、V421A、N436S、T547I。B/Guangdong/GZ14/2018毒株缺失第540位氨基酸。B/Guangdong/GZ40/2018毒株发现T136I位点突变,位于120环抗原表位上。10株Victoria系病毒株共有7个氨基酸位点发生突变,10株均携带I132V、N144D和A214T突变,其中I132V位于抗原表位120环上,N144D位于抗原表位150环上;另外,发现突变位点A169T、K227R、N248D和P343S。（2）NA氨基酸序列分析:27株Yamagata系病毒株（不包括B/Guangdong/GZ20/2018）共有22个氨基酸位点发生突变,26株（96.3%）携带I49M突变,19株（70.4%）携带R65H突变,24株（88.9%）携带I171M突变,25株（92.6%）携带D342K突变,另外两株病毒B/Guangdong/GZ16/2018和B/Guangdong/GZ34/2018在342位点则携带D342N突变,27株（100%）均携带K373Q突变,17株（63%）携带S402P突变;另外,发现突变位点I6T、F12L、V45I、P48S、A67V、A67T、G70E、P76L、N144S、R186I、F266L、E308G、R315K、T372N、T389I、K419E、T437I。10株Victoria系病毒株和系间重配株B/Guangdong/GZ20/2018共有12个氨基酸位点发生突变,11株均携带I120V、K220N、S295R、N340D、E358K突变,8株（73%）携带D384G突变,3株（27%）携带V401I突变;另外,发现突变位点P48T、T106I、I262M、M369V、V422I。二、所选取的9株病毒株中有5株存在不同程度的耐药性,而且5株病毒均属于Yamagata谱系。连花清瘟胶囊对其中4株耐药性程度较大的病毒株和药物敏感性参考株的体外活性抑制作用相近。三、Yamagata谱系病毒株B/Guangdong/GZ19/2018、B/Guangdong/GZ23/2018、B/Guangdong/GZ24/2018、B/Guangdong/GZ28/2018和B/Guangdong/GZ29/2018具有比B/Guangdong/GZ40/2018更强的增殖能力;Victoria谱系病毒株B/Guangdong/GZ39/2018的增殖能力比B/Guangdong/GZ11/2018更突出;系间重配株B/Guangdong/GZ20/2018的增殖能力弱于其他8株病毒。总体而言,Yamagata谱系病毒株在增殖能力上比Victoria谱系病毒株更强。四、成功构建乙型流感病毒反向遗传学平台。【结论】2017～2018年度WHO推荐的三价流感疫苗株未能对广州市人群形成良好的保护作用。因此,须密切关注乙型流感病毒的变异情况以及和疫苗株的匹配度,以便及时制定合理的疫苗更新和接种方案,对流感进行科学有效的防控。流行株中存在的对神经氨酸酶抑制剂奥司他韦和帕拉米韦产生耐药性的现象,以及耐药株和药敏株之间存在未报导过的氨基酸突变位点,而连花清瘟胶囊发挥传统中药的优势,对耐药性病毒株具有稳定的抗病毒活性作用。另外,Yamagata系流行株具有比Victoria谱系流行株更强的增殖能力,而不同谱系的毒株之间的增殖能力也存在一定的差异,并且,不同谱系的病毒株之间存在未报导过的氨基酸突变位点。其中的机制需进一步验证。
杨晓宇[8]（2020）在《湖北地区结合哨兵动物的野鸟流感监测研究》文中研究表明禽流感（Avian Influenza,AI）是由正粘病毒科流感病毒属A型流感病毒引起的家禽和野禽的一种从呼吸系统到全身败血症等多种疾病综合征,其中高致病性禽流感被国际兽医局列为A类传染病,是我国的Ⅰ类传染病,每次暴发都带来了极其巨大的经济损失。野鸟被认为是禽流感病毒（Avian Influenza Virus,AIV）的天然宿主,因其本身具有的迁徙习性,为病毒的传播提供了天然的有利条件,一直被作为禽流感主动预警的监测对象。哨兵动物可以被用作各种健康风险的监测,比如与食物有关的危害、传染病和生物恐怖主义的哨兵,简单地说,哨兵动物可以被定义为“疾病存在的指示器”。本研究选择结合哨兵动物进行禽流感监测研究的原因有二:一、为实现野鸟携带禽流感病毒的主动预警工作,研究人员通常选择野外环境下的野鸟粪便作为样品采集对象,但由于野生水禽栖息地主要集中于沼泽、湿地、湖泊等水域面积广阔、周围环境复杂的地点,且野生水禽本身具有群体数量大、活动范围广的特点,研究人员难以实现对某一区域内的野鸟进行全面、系统的采样,往往会导致样品代表性降低、监测结果不理想,而在监测区域内引入哨兵动物并定期为哨兵动物进行检查和检测,就可以及时发现病原存在,弥补常规监测费时费力和病原查出率低的不足。二、通过监测野鸟和哨兵动物之间流感病毒及其基因相互流动情况,可模拟自然状态下野鸟和家禽之间禽流感病毒的相互传播情况。也就是说,结合哨兵动物对野鸟流感进行监测研究,可以实现成本最低化、效果最大化的实时监测。本研究于2017年1月至2019年4月在湖北地区进行野鸟携带禽流感病毒的主动监测,共采集野鸟及哨兵动物粪便和拭子样品共10732份,结果共分离到39株AIV,AIV的总体分离率为0.363%。亚型鉴定结果显示,分离到15株H1N1、1株H1N2、6株 H1N3、1 株 H1N9、1 株 H3N2、1 株 H3N8、6 株 H4N6、2 株 H4N9、1 株 H5N8、3株H6N2、1株H9N2和1株H11N9。其中,H1N1为湖北网湖地区优势毒株。哨兵动物样品中分离出1株H3N2和1株H3N8亚型禽流感病毒,其中H3基因仅从哨兵动物样品中分离到,未在野鸟样品中分离出,N2和N8基因也与野鸟样品中分离到的病毒具有不同的进化来源,验证了哨兵动物作为野生水禽流感监测补充模型的可行性。遗传进化结果显示:湖北地区野鸟携带的禽流感病毒具有丰富的基因来源,与亚洲、非洲、欧洲及北美洲多个国家和地区的AIVs均存在基因交流。说明湖北作为候鸟“中亚”和“东亚一澳大利亚”迁徙路线上的重要停歇地,禽流感病毒间存在着频繁的基因交流。
孙小方[9]（2020）在《流感病毒血凝素对内皮细胞组织因子表达的影响》文中研究表明目的:检测流感病毒（H1N1）血凝素对内皮细胞组织因子（Tissue factor,TF）表达的影响,通过探讨其对血管内皮细胞组织因子基因和蛋白水平的影响,进一步探索流感病毒血凝素对小鼠肺脏产生的病理改变。本研究探讨流感病毒血凝素对肺血管内皮细胞表达TF的影响,今后将进一步研究对TF的高表达有重要影响的因素及相关通路,并深入研究其与流感重症肺炎患者最后出现DIC的密切关系,为下一步开发抑制TF活性的有关物质提供依据,以期为阻断流感病毒感染发展为流感重症肺炎的致病机制提供新思路。方法:1体外实验:1.1外购Bend3细胞系,并传代培养,后随机分取三组,分别饥饿细胞12小时,第一组:生理盐水（0μg/ml）刺激Bend3细胞作为对照组;第二组和第三组:不同浓度（2.5μg/ml和5μg/ml）流感病毒血凝素刺激Bend3细胞作为实验组。均在作用12小时后,分别收取三组细胞总蛋白,通过Western Blot实验验证12小时后TF在蛋白水平上的变化,测量Western blot所得结果的灰度值进行统计学分析,以P<0.05为差异有统计学意义。1.2培养Bend3细胞,后随机分取三组,分别饥饿细胞12小时,第一组:生理盐水（0μg/ml）刺激Bend3细胞作为对照组;第二组和第三组:不同浓度（2.5μg/ml和5μg/ml）流感病毒血凝素刺激Bend3细胞作为实验组。均在作用12小时后,分别收取三组细胞总RNA,通过Real-time PCR实验验证12小时后TF在基因水平上的变化,以P<0.05为差异有统计学意义。2体内实验:将18只SPF级BABL/c小鼠（雌雄各半,雄性9周龄,雌性8周龄,体重一致）,随机分为三组,每组六只。第一组:生理盐水（0μg/ml）对照组,第二组和第三组:不同浓度（2.5μg/ml和5μg/ml）流感病毒血凝素组。按小鼠2ml体液量换算后沿尾静脉向小鼠体内注入生理盐水及不同浓度（2.5μg/ml和5μg/ml）流感病毒血凝素,注射完毕后,做好标记,将小鼠放于饲养笼中,自由进水、进食。观察12小时期间,小鼠的行为学改变和12小时后剖检观察小鼠肺组织并留取小鼠肺组织通过显微镜观察HE染色后小鼠肺组织的病理变化。结果:1体外实验:1.1 Western blot结果实验结果显示,TF在各组Bend3细胞中均表达,不同浓度（2.5μg/ml和5μg/ml）流感病毒血凝素刺激作用下Bend3细胞TF在蛋白水平上调,均显着高于生理盐水（0μg/ml）对照组,其中流感病毒血凝素（2.5μg/ml）实验组TF表达与生理盐水（0μg/ml）对照组比P=0.009（P<0.05）,流感病毒血凝素（5μg/ml）实验组TF表达与生理盐水（0μg/ml）对照组比较P=0.000（P<0.05）。1.2实时PCR结果实验结果显示:TF在各组Bend3细胞中均表达,流感病毒血凝素（2.5μg/ml）实验组TF表达与生理盐水（0μg/ml）对照组比P=0.586（P>0.05）,差异无统计学意义;流感病毒血凝素（5μg/ml）实验组TF表达与生理盐水（0μg/ml）对照组比较P=0.019（P<0.05）。流感病毒血凝素刺激作用下Bend3细胞TF在基因水平上调,显着高于生理盐水（0μg/ml）对照组。（表2,图3）2体内实验:动物实验结果:我们在流感病毒血凝素注入小鼠体内12小时期间进行行为学观察,12小时后立即同时麻醉处死三组小鼠对肺组织进行剖检观察并留取肺组织通过HE染色技术后进行显微镜观察。2.1行为学观察:三组小鼠在注射不同浓度病毒血凝素（0μg/ml,2.5μg/ml和5μg/ml）12小时期间,每隔一小时,每次10分钟,观察一次小鼠的状态,均未能观察到明显行为学变化;2.2剖检观察:生理盐水（0μg/ml）对照组的小鼠肺脏组织呈现出淡粉红色,质地较柔软,肺叶光滑润泽;不同流感病毒血凝素（2.5μg/ml和5μg/ml）实验组小鼠的肺脏均呈现出暗红色,肺叶出现表面粗糙,有的局部呈轻度实变,有斑点状充血和渗出现象。2.3显微镜观察:通过HE染色技术对小鼠肺脏组织病理损伤评估,生理盐水（0μg/ml）对照组的小鼠的肺泡上皮细胞形态基本正常,没有实变区,肺泡也均匀没有萎缩或扩张现象,没有充血、渗出以及炎细胞浸润;不同流感病毒血凝素（2.5μg/ml和5μg/ml）实验组小鼠肺组织呈现出明显的病理损伤变化,包括肺泡结构的破坏,肺泡间隔的增宽和肺组织弥漫性的损伤、充血、凝血以及水肿并伴有大量炎症因子浸润等病理性改变。（图4）结论:1.流感病毒血凝素能使内皮细胞组织因子基因和蛋白水平上调。2.体内动物实验进一步证实了流感病毒血凝素导致小鼠体内出现肺脏凝血系统及组织炎症性病理损伤等改变。
方斌,徐晖,余晓,李翔,叶国军,刘琳琳[10]（2019）在《2015-2019年湖北省甲型H1N1流感病毒流行和进化分析》文中研究说明目的了解2015—2019年湖北省甲型H1N1流感病毒流行和进化特征、抗原表位和耐药位点突变情况。方法在中国流感监测信息系统下载流感病毒核酸检测阳性率并划分流行高峰,选取2015—2019年湖北省39株经实时荧光PCR检测阳性后病毒分离培养的甲型H1N1流感病毒株并测序,另在全球流感共享数据库下载13株湖北省毒株序列,采用生物信息学软件分析其进化簇分布、抗原表位和耐药突变位点,通过三维建模,分析其突变位点结构。结果 2015—2019年湖北省甲型H1N1流感病毒每年流行高峰持续长达11～14周,流行强度逐年增加,在血凝素（HA）、神经氨酸酶（NA）进化树6B簇内进化出6B.1A到6B.1A7等多个分支,发现12处HA抗原表位突变位点和2处NA基因耐药位点,其中毒力标签D222G和耐药位点I223V三维模拟结构差异明显。结论 2015—2019年甲型H1N1流感病毒流行强度不断提高,进化出多个分支簇,零星检出毒力标签和耐药突变位点,该分析有助于提高湖北省流感病毒流行病学和基因进化监测水平。
二、猪型(H1N1)流感病毒血凝素和神经氨酸酶基因来源的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、猪型(H1N1)流感病毒血凝素和神经氨酸酶基因来源的研究（论文提纲范文）
（1）2018-2020年猪流感病毒分离鉴定和猪流感血清学调查（论文提纲范文）
| 符号及缩略词 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 SI的流行概况 |
| 1.1.1 经典H1N1 SIV |
| 1.1.2 类禽H1N1 SIV |
| 1.1.3 类人SIV |
| 1.1.4 2009 甲型H1N1 流感病毒 |
| 1.2 SI的公共卫生学 |
| 1.2.1 SIV对人的感染 |
| 1.3 流感病毒蛋白的结构与功能 |
| 1.3.1 血凝素(hemagglutinin,HA) |
| 1.3.2 神经氨酸酶(Neuraminidase,NA) |
| 1.3.3 聚合酶蛋白(Polymerase) |
| 1.3.4 核蛋白(Nucleoprotein,NP) |
| 1.3.5 基质蛋白(Matrix Protein,M) |
| 1.3.6 非结构蛋白(Nonstructural protein,NS) |
| 1.4 猪流感病毒的感染周期 |
| 1.5 SIV的抗原变异 |
| 1.6 H1N1 SIV基因型划分 |
| 1.7 猪流感的临床症状及病理变化 |
| 1.8 猪流感的诊断与防治 |
| 1.9 本研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 主要试剂及引物 |
| 2.3 溶液配制 |
| 2.4 方法 |
| 2.4.1 样品的采集及处理 |
| 2.4.2 病毒的分离与纯化 |
| 2.4.2.1 病毒的分离 |
| 2.4.2.2 病毒的有限稀释克隆纯化 |
| 2.4.2.3 病毒RNA的提取及反转录 |
| 2.4.2.4 病毒鉴定、基因片段的PCR扩增及测序 |
| 2.4.2.5 序列的拼接与分析 |
| 2.4.3 血凝(HA)试验 |
| 2.4.4 血凝抑制(HI)试验 |
| 3 结果 |
| 3.1 病毒的分离及亚型鉴定 |
| 3.2 病毒信息 |
| 3.3 病毒扩增结果 |
| 3.4 病毒遗传进化分析 |
| 3.4.1 表面蛋白基因 |
| 3.4.2 内部蛋白基因 |
| 3.5 病毒关键性氨基酸位点分析 |
| 3.6 病毒的基因型 |
| 3.7 血清检测结果 |
| 3.7.1 不同省份猪SIV抗体检测结果 |
| 3.7.2 不同生长阶段猪SIV抗体检测结果 |
| 3.7.3 不同年份猪SIV抗体检测结果 |
| 4.讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 硕士期间发表论文情况 |
（2）候鸟禽流感病毒遗传变异规律分析及在哺乳动物间传播机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 流感病毒病原学 |
| 1.1 流感病毒概述 |
| 1.2 流感病毒病原生态学特点 |
| 第二章 流感病毒受体 |
| 2.1 流感病毒受体概述 |
| 2.2 唾液酸的结构及种类 |
| 2.3 不同动物唾液酸受体的异质性 |
| 2.4 不同物种间流感病毒唾液酸受体的分布 |
| 2.5 病毒结合不同唾液酸受体的分子机制 |
| 2.6 流感病毒唾液酸受体研究方法 |
| 第三章 禽流感病毒跨种传播 |
| 3.1 禽流感病毒跨种传播的发生 |
| 3.2 影响禽流感病毒跨种传播的病原因素-基因突变 |
| 3.3 影响禽流感病毒跨种传播的病原因素-基因重组 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 中国东部地区候鸟禽流感流行病学调查研究 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 实验用鸡胚和细胞 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.1.4 样品采集 |
| 1.1.5 禽流感病毒分离 |
| 1.1.6 禽流感病毒RNA的提取 |
| 1.1.7 禽流感病毒高通量测序 |
| 1.1.8 候鸟禽流感病毒抗体检测 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 样品采集及毒株分离情况 |
| 1.2.2 候鸟AIVs亚型多样性和宿主特异性 |
| 1.2.3 H9N2 禽流感病毒在候鸟中流行的血清学调查 |
| 1.2.4 2020 年候鸟H5N8 禽流感病毒检测及抗原性分析 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 中国东部候鸟禽流感病毒遗传进化分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验用毒株 |
| 2.1.2 候鸟源禽流感病毒基因组收集及比对 |
| 2.1.3 系统发生分析 |
| 2.1.4 进化动力学的空间系统发育重建 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 候鸟源禽流感病毒遗传变异分析 |
| 2.2.2 候鸟源H9N2 禽流感病毒遗传进化分析 |
| 2.2.3 候鸟源H3N8 禽流感病毒遗传进化分析 |
| 2.2.4 候鸟源H13 亚型禽流感病毒遗传变异分析 |
| 2.2.5 候鸟源H5N8 禽流感病毒遗传变异分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 中国东部候鸟禽流感病毒分离株受体结合特性研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验用毒株 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 红细胞法检测禽流感病毒受体 |
| 3.1.5 糖芯片法检测禽流感病毒受体 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 候鸟禽流感病毒红细胞法受体测定 |
| 3.2.2 候鸟禽流感病毒糖芯片法受体测定 |
| 3.2.3 候鸟禽流感病毒结合聚糖结构分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 候鸟禽流感病毒在哺乳动物间跨种传播能力评估 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验用毒株 |
| 4.1.2 实验用动物 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 主要仪器 |
| 4.1.5 小鼠致病性实验 |
| 4.1.6 豚鼠间传播实验 |
| 4.1.7 雪貂间呼吸道飞沫传播实验 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 候鸟H9N2 亚型禽流感病毒小鼠致病性 |
| 4.2.2 候鸟H9N2 亚型禽流感病毒豚鼠间传播 |
| 4.2.3 候鸟H9N2 亚型禽流感病毒雪貂间传播 |
| 4.2.4 候鸟H5N8 禽流感病毒小鼠致病性 |
| 4.2.5 候鸟H5N8 禽流感病毒豚鼠间传播 |
| 4.2.6 候鸟H3 亚型禽流感病毒豚鼠间传播 |
| 4.2.7 候鸟T222 分离株及豚鼠适应一代毒株雪貂间呼吸道飞沫传播 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 候鸟源H3N8 禽流感病毒在哺乳间传播的分子机制研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验用毒株、细胞及载体 |
| 5.1.2 实验用动物 |
| 5.1.3 主要试剂 |
| 5.1.4 主要仪器 |
| 5.1.5 候鸟源H3N8 流感病毒野毒株RNA提取 |
| 5.1.6 候鸟源H3N8 流感病毒野毒株c DNA制备 |
| 5.1.7 候鸟源H3N8 流感病毒野毒株全基因组及载体扩增 |
| 5.1.8 候鸟源H3N8 流感病毒野毒株感染性克隆的构建 |
| 5.1.9 候鸟源H3N8 禽流感病毒及其突变株的体外拯救 |
| 5.1.10 流感病毒聚合酶活性检测 |
| 5.1.11 病毒滴定和复制动力学测定 |
| 5.1.12 动物实验 |
| 5.1.13 雪貂适应1 代毒株测序 |
| 5.1.14 雪貂适应1 代毒及受体结合能力检测 |
| 5.1.15 病理及组化 |
| 5.1.16 统计分析 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 T222 毒株及T222-G1 毒株氨基酸差异比对 |
| 5.2.2 rT222-wild及 rT222-S524G突变株拯救 |
| 5.2.3 rT222-wild及 rT222-S524G豚鼠间传播 |
| 5.2.4 rT222-wild及 rT222-S524G雪貂间呼吸道飞沫传播 |
| 5.2.5 rT222-wild及 rT222-S524G雪貂间传播变异分析 |
| 5.2.6 雪貂适应1 代毒株受体结合检测 |
| 5.2.7 PB1-S524G增强了病毒聚合酶活性 |
| 5.2.8 PB1-S524G增强了H3N8 禽流感病毒的体外复制能力 |
| 5.2.9 PB1-S524G增强了H3N8 禽流感病毒的体内复制能力 |
| 5.2.10 PB1-S524G增强了H3N8 禽流感病毒对小鼠的致病性 |
| 5.2.11 PB1-S524G增加了H3N8 禽流感病毒对雪貂的致病性 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 学位期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（3）一株人类分离H9N2禽流感病毒哺乳动物致病性研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 第一部分 病例报告 |
| 第一节 病例描述 |
| 第二节 病例特征和分析 |
| 第三节 总结和讨论 |
| 第二部分 A/SUZHOU/GIRD01/2019 病毒株的基因特点 |
| 第一节 前言 |
| 第二节 结果展示和分析 |
| 第三节 总结和讨论 |
| 第三部分 A/SUZHOU/GIRD01/2019(H9N2)毒株致病性评估 |
| 第一节 前言 |
| 第二节 结果展示和分析 |
| 第三节 总结和讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 国内禽流感的起源和发展 |
| 参考文献 |
| 硕士期间发表的论文 |
| 致谢 |
（4）艾比湖野鸟源低致病性禽流感病毒的分离鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文对照缩略词表(Abbreviations) |
| 第一章 引言 |
| 1.文献综述 |
| 1.1 禽流感病毒概述 |
| 1.2 禽流感病毒的病原学 |
| 1.3 禽流感的流行病学 |
| 2.选题目的意义 |
| 第二章 试验研究 |
| 试验一 艾比湖野鸟源低致病性禽流感病毒的分离鉴定及分离株血凝素与神经氨酸酶的生物信息学分析 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2.结果 |
| 2.1 样品初鉴定结果 |
| 2.2 样品HA分析结果 |
| 2.3 病毒增殖结果 |
| 2.4 病毒HA/NA鉴定结果 |
| 2.5 序列测序结果 |
| 2.6 血凝素与神经氨酸酶生物信息学分析结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 试验二 不同分离株全基因组测序分析 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2.结果 |
| 2.1 内部基因扩增结果 |
| 2.2 病毒全基因组序列比对结果 |
| 2.3 HA基因分子表征 |
| 2.4 NA基因分子表征 |
| 2.5 内部基因分子表征 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 试验三 分离株的致病性及生物特性研究 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2.结果 |
| 2.1 受体结合特异性研究 |
| 2.2 分离株对小鼠的致病性 |
| 2.3 分离株对四周龄雏鸡的致病性 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 1.总RNA急速抽提试剂盒并根据其说明书步骤 |
| 2.SMART MMLV Reverse Transcriptase说明书步骤 |
| 3.普通琼脂糖DNA回收试剂盒试验步骤 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
| 附件 |
（5）欧亚类禽H1N1猪流感病毒分子进化与致病机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 一. 前言 |
| 1. 猪是流感病毒的基因混合器 |
| 2. 欧亚类禽猪流感病毒的流行 |
| 3. 欧亚类禽猪流感病毒的重配 |
| 4. 欧亚类禽猪流感病毒的分子标记 |
| 4.1 欧亚类禽猪流感病毒的受体结合特性 |
| 4.2 欧亚类禽猪流感病毒的耐药性 |
| 4.3 欧亚类禽猪流感病毒的致病分子标记 |
| 5. 本论文主要研究内容 |
| 二. 材料和方法 |
| 1. EA H1N1 SIVs基因进化分析 |
| 1.1 EA SIVs基因序列收集 |
| 1.2 EA H1N1 SIVs进化分析 |
| 1.3 EA H1N1 SIVs的基因多样性分析 |
| 2. EA H1N1 SIVs质粒构建 |
| 3. 质粒提取 |
| 4. 定点突变 |
| 5. 病毒拯救 |
| 6. 流感病毒的扩增和浓缩 |
| 6.1 流感病毒的MDCK细胞扩增 |
| 6.2 流感病毒的鸡胚扩增 |
| 6.3 流感病毒的浓缩 |
| 7. 血凝实验和血凝抑制实验 |
| 7.1 血凝实验 |
| 7.2 血凝抑制实验 |
| 8. 流感病毒的TCID_(50)滴定 |
| 9. 流感病毒的生长曲线测定 |
| 9.1 流感病毒生长曲线样本收集 |
| 9.2 流感病毒生长曲线的测定 |
| 10. 流感病毒聚合酶活性测定 |
| 11. 蛋白印记实验 |
| 12. 小鼠致病力实验 |
| 12.1 小鼠感染EA H1N1病毒实验 |
| 12.2 小鼠组织病毒滴定 |
| 12.3 小鼠肺组织病理实验 |
| 12.4 小鼠组织细胞因子检测 |
| 三. 结果 |
| (一) EA H1N1 SIVs基因进化分析 |
| 1.1 EA H1N1 SIVs序列地区和时间分布分析 |
| 1.2 EA H1N1 SIVs基因多样性分析 |
| 1.3 EA H1N1 SIVs分子标记分析 |
| 1.4 第一部分 小结 |
| (二) 欧亚类禽H1N1猪流感病毒致病分子机制研究 |
| 2.1 JS1-like和HuN-like病毒在小鼠中的致病力不同 |
| 2.2 NP基因是决定JS1和HuN病毒致病力不同的关键因素 |
| 2.3 NP-R305K、F313V和Q357K是流感病毒哺乳动物适应性分子标记 |
| 2.4 NP-Q357K决定了JS1和HuN病毒在小鼠中的致病力 |
| 2.5 NP-K357Q降低了HuN病毒在小鼠中的复制和毒力 |
| 2.6 NP-K357Q对HuN病毒聚合酶活性的影响 |
| 2.7 rgHuN-WT和rgHuN-NP_(K357Q)病毒在小鼠肺组织中的病理变化 |
| 2.8 PB2-T271A突变对EA H1N1病毒致病力的影响 |
| 2.9 PB2-T271A突变增加了EA H1N1 SIVs在细胞中的复制能力 |
| 2.10 PB2-T271A突变增加了 EA H1N1 SIVs在小鼠中的致病力 |
| 2.11 PB2-T271A突变增加了EA H1N1 SIVs在小鼠中的复制 |
| 2.12 PB2-T271A突变增加了EA H1N1 SIVs在小鼠肺组织的病理损伤 |
| 2.13 PB2-T271A突变对EA H1N1 SIVs感染小鼠后细胞因子表达水平的影响 |
| 2.14 PB2-T271A突变增加了EA H1N1 SIVs的聚合酶活性 |
| 2.15 第二部分 小结 |
| 四. 讨论 |
| 五. 主要结论、创新点和局限性 |
| 六. 参考文献 |
| 七. 综述 欧亚类禽猪流感病毒病原学研究进展 |
| 参考文献 |
| 八. 致谢 |
| 九. 发表文章 |
（6）JAK酪氨酸激酶抑制剂（来氟米特和姜烯酮）的抗流感病毒药物活性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.流感病毒概述 |
| 1.1 流感病毒的结构与分类 |
| 1.2 流感病毒的复制及病毒蛋白主要功能 |
| 1.3 流感病毒的流行 |
| 1.4 流感病毒的变异 |
| 1.5 流感病毒的防治 |
| 2 抗流感病毒药物的研究进展 |
| 2.1 离子通道抑制剂 |
| 2.2 神经氨酸酶抑制剂 |
| 2.3 膜融合抑制剂 |
| 2.4 RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)抑制剂 |
| 2.5 临床试验中的抗流感药物 |
| 2.6 细胞信号通路抑制剂 |
| 3.酪氨酸激酶(TYROSINE KINASES,TKs) |
| 3.1 RTKs的简介 |
| 3.2 Janus激酶(JAK)的概述 |
| 4 来氟米特的研究概况 |
| 4.1 来氟米特的简介 |
| 4.2 来氟米特及其代谢产物的药理作用 |
| 5.姜烯酮A的研究概况 |
| 5.1 姜烯酮A的简介 |
| 5.2 姜烯酮A的药理作用及应用 |
| 参考文献 |
| 第二章 来氟米特抗流感病毒感染的药物活性研究 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 细胞系 |
| 1.2 病毒 |
| 1.3 实验动物 |
| 1.4 质粒 |
| 1.5 抗体 |
| 1.6 主要仪器 |
| 1.7 主要药品、试剂与试剂盒 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 CEF细胞的制备 |
| 2.2 病毒的复苏及细胞接毒 |
| 2.3 显微镜观察细胞上感染病毒后给药及细胞病变 |
| 2.4 TCID_(50)方法检测病毒的滴度 |
| 2.5 细胞转染实验,聚合酶荧光素酶报告基因 |
| 2.6 RNA提取和RT-PCR实验 |
| 2.7 WB检测相关蛋白表达水平 |
| 2.8 细胞增殖实验 |
| 2.9 小鼠体内实验 |
| 2.10 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 A77 1726抑制H5N1流感病毒的复制 |
| 3.2 A77 1726抑制H1N1和H9N2流感病毒的复制 |
| 3.3 BQR和PF-4708671不抑制H5N1病毒复制 |
| 3.4 A77 1726通过抑制酪氨酸激酶的活性抑制流感病毒复制 |
| 3.5 JAK2过表达增强流感病毒复制并消减A77 1726抗病毒活性 |
| 3.6 来氟米特抑制流感病毒在小鼠体内的复制 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 第三章 姜烯酮A抗流感病毒感染的药物活性研究 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 细胞系 |
| 1.2 主要药品 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 TCID_(50)方法检测病毒的滴度 |
| 2.2 细胞转染实验,聚合酶荧光素酶报告基因 |
| 2.3 RNA提取和RT-PCR实验 |
| 2.4 WB检测相关蛋白表达水平 |
| 2.5 细胞增殖实验 |
| 2.6 小鼠体内实验 |
| 2.7 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 姜烯酮A抑制流感病毒复制 |
| 3.2 姜烯酮A抑制病毒蛋白质的合成 |
| 3.3 姜烯酮A抑制JAK2和S6K1活性 |
| 3.4 JAK特异性抑制剂抑制流感病毒(IAV)的复制,而不是S6K1特异性抑制剂 |
| 3.5 JAK2过表达增强IAV复制并减弱Gin A介导的抗病毒活性 |
| 3.6 姜烯酮A抑制H5N1病毒在体内的复制 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 创新点和展望 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（7）20172018年广州市乙型流感病毒HA、NA基因特征及中西药抗病毒药效初筛研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 2017~2018年广州市乙型流感病毒HA、NA基因特征分析 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 中西药抗乙型流感病毒药效初筛及病毒增殖能力检测 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 乙型流感病毒反向遗传学平台构建 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读研究生学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（8）湖北地区结合哨兵动物的野鸟流感监测研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 禽流感的历史 |
| 1.2.1 二十世纪四次流感大流行 |
| 1.3 禽流感的病原学 |
| 1.3.1 禽流感病毒的分类地位 |
| 1.3.2 禽流感病毒的结构 |
| 1.4 禽流感病毒基因组及其编码的蛋白 |
| 1.4.1 血凝素(HA)基因及其编码蛋白 |
| 1.4.2 神经氨酸酶(NA)基因及其编码蛋白 |
| 1.4.3 聚合酶(PB2、PB1、PA)基因及其编码蛋白 |
| 1.4.4 衣壳蛋白(NP)基因及其编码蛋白 |
| 1.4.5 基质蛋白(M)基因及其编码蛋白 |
| 1.4.6 非结构蛋白(NS)基因及其编码蛋白 |
| 1.5 哨兵动物在禽流感监测中的作用 |
| 1.6 本研究的目的意义 |
| 2 湖北网湖地区野鸟和哨兵动物禽流感流行病学监测 |
| 2.1 实验材料和实验器材 |
| 2.1.1 实验样品 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.1.4 SPF鸡胚及SPF鸡红细胞 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 样品采集 |
| 2.2.2 样品处理 |
| 2.2.3 病毒分离 |
| 2.2.4 血凝试验 |
| 2.2.5 RT-PCR实验 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 病毒分离结果 |
| 2.3.2 AIV亚型鉴定结果 |
| 2.3.3 HA和NA亚型分布 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 禽流感病毒株的进化分析 |
| 3.1 实验材料和实验器材 |
| 3.1.1 实验样品 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 实验试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 RT PCR |
| 3.2.2 PCR产物回收和纯化 |
| 3.2.3 序列拼接 |
| 3.2.4 遗传进化分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 病毒基因测序结果 |
| 3.3.2 氨基酸位点分析结果 |
| 3.3.3 遗传进化分析结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 H1基因 |
| 3.4.2 H3基因 |
| 3.4.3 H4基因 |
| 3.4.4 H5基因 |
| 3.4.5 H6基因 |
| 3.4.6 H9基因 |
| 3.4.7 H11基因 |
| 3.4.8 N1基因 |
| 3.4.9 N2基因 |
| 3.4.10 N3基因 |
| 3.4.11 N6基因 |
| 3.4.12 N8基因 |
| 3.4.13 N9基因 |
| 3.4.14 PB2基因 |
| 3.4.15 PB1基因 |
| 3.4.16 PA基因 |
| 3.4.17 NP基因 |
| 3.4.18 M基因 |
| 3.4.19 NS基因 |
| 3.4.20 野鸟和哨兵动物样品病毒分离情况 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（9）流感病毒血凝素对内皮细胞组织因子表达的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 流感病毒血症的相关研究 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、猪型(H1N1)流感病毒血凝素和神经氨酸酶基因来源的研究（论文参考文献）
- [1]2018-2020年猪流感病毒分离鉴定和猪流感血清学调查[D]. 赵玉仲. 山东农业大学, 2021(01)
- [2]候鸟禽流感病毒遗传变异规律分析及在哺乳动物间传播机制研究[D]. 张醒海. 吉林大学, 2021
- [3]一株人类分离H9N2禽流感病毒哺乳动物致病性研究[D]. 赵凤鸣. 广州医科大学, 2021(02)
- [4]艾比湖野鸟源低致病性禽流感病毒的分离鉴定[D]. 李培东. 石河子大学, 2021(02)
- [5]欧亚类禽H1N1猪流感病毒分子进化与致病机制研究[D]. 冯兆民. 中国疾病预防控制中心, 2020(02)
- [6]JAK酪氨酸激酶抑制剂（来氟米特和姜烯酮）的抗流感病毒药物活性研究[D]. 汪炯炯. 扬州大学, 2020(04)
- [7]20172018年广州市乙型流感病毒HA、NA基因特征及中西药抗病毒药效初筛研究[D]. 夏炫梓. 广州医科大学, 2020(01)
- [8]湖北地区结合哨兵动物的野鸟流感监测研究[D]. 杨晓宇. 东北林业大学, 2020(02)
- [9]流感病毒血凝素对内皮细胞组织因子表达的影响[D]. 孙小方. 承德医学院, 2020(02)
- [10]2015-2019年湖北省甲型H1N1流感病毒流行和进化分析[J]. 方斌,徐晖,余晓,李翔,叶国军,刘琳琳. 疾病监测, 2019