一、利福霉素产生菌诱变育种研究（论文文献综述）
张昊月[1]（2021）在《天蓝色链霉菌产达托霉素的发酵培养基优化及高产菌株选育》文中指出达托霉素（Daptomycin）是从玫瑰孢链霉菌（Streptomyces roseosporus）NRRL 11379的发酵液中分离得到的一种新型环脂肽类抗生素,然后由Cubist制药公司研发,在2003年以Cubicin为商品名在美国上市。达托霉素可以用于治疗一些由革兰氏阳性病原菌引起的并发性皮肤及皮肤结构感染等症状。达托霉素具有一种独特的作用机制,使其在治疗由多种耐药菌,如:耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA）等引起的感染中发挥了重要作用。作为“病原菌的最后一道防线——万古霉素”的替代品,达托霉素在医学方面具有广阔的应用前景。但是在发酵生产中,达托霉素的发酵水平较低,限制了其市场前景。因此,提高达托霉素的发酵产量具有重要意义。本实验以一株异源表达菌株——天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor）K10作为达托霉素生产菌株,首先,通过响应面法（Response surface methodology,RSM）获得了稳定高产的达托霉素发酵培养基,然后,采用紫外（UV）诱变、亚硝基胍（NTG）诱变和多轮基因组重排技术（Genome shuffling）对原始菌株进行高产菌株选育。主要结果如下:1)获得较佳的产达托霉素培养基配方。首先利用单因素实验探明不同的碳源、氮源和微量元素对达托霉素产量的影响。根据单因子实验结果,初始发酵培养基中的碳源成分更换为糊精和麦芽糖,再添加L-Asn作为培养基成分之一。接着,利用Plackett-Burman（PB）实验设计筛选到影响达托霉素产量的显着因子,即为糊精、酵母提取物和酪蛋白,最后基于中心组合设计（Central composite design,CCD）的响应面方法来确认显着影响因子的最佳水平。Design Expert 8.0软件对实验数据进行处理和分析,计算出达托霉素发酵培养基配方（g/L）为糊精25.11、麦芽糖16.00、酵母提取物2.20、酪蛋白2.00、L-Asn 1.00、MOPS 10.00,初始p H值为7.0。通过验证实验证实优化后的培养基产达托霉素的产量可以达到15.30±1.23 mg/L,较原始培养基提高了2.17倍。2)达托霉素高产菌株选育。首先,对S.coelicolor K10分别进行UV诱变和NTG诱变处理,在确定最佳的诱变剂量后,成功筛选到6株达托霉素高产菌株,分别为UV-1、UV-19、UV-23、NTG-1、NTG-5和NTG-9;之后通过两轮Genome shuffling获得了一株达托霉素高产融合子GS-2-30,其产量可以达到39.66±0.99 mg/L,相比较原始菌株产量提高了1.59倍,经验证,菌株GS-2-30的遗传性能稳定。
栗波,王泽建,梁剑光,刘爱军,李海东[2]（2021）在《等离子体作用结合氧限制模型选育利福霉素SV高产菌株》文中研究指明利福霉素SV毒性低、疗效高、抗菌谱广,主要由地中海拟无枝酸菌发酵生产,其发酵过程属于耗氧发酵,供氧直接影响产物形成。为减少发酵过程氧限制影响,进一步提高利福霉素发酵产量,通过构建定向氧限制模型,将常温常压等离子体诱变和无水亚硫酸钠氧限制筛选模型相结合,建立了利福霉素生产菌株24孔板快速培养的高通量筛选方法,高效选育出能够耐受低氧环境的利福霉素SV高产菌株NSMXG-M126,发酵代谢状态参数变化显示,该高产菌株具有更好的氧亲和力。同样的供氧条件下,与对照相比表现出较快的菌体生长速率和利福霉素SV的快速合成能力。在低供氧情况下发酵单位达到7 839mg/L,较出发菌株提高48%,表明耐受低氧的突变菌株具有更高的利福霉素SV生产效率。
栾书慧[3]（2020）在《基于ARTP诱变的安丝菌素P-3高产菌株高通量筛选体系的构建》文中指出抗肿瘤药物安丝菌素（ansamitocins）属于大环内酰胺类抗生素,由美登素衍生。目前多种与安丝菌素相关的TDM抗体偶联分子已进入不同临床试验阶段,鉴于安丝菌素重要的药用价值和广阔的市场前景,提高安丝菌素的产量成为国内外学者的研究重点。但由微生物发酵生产安丝菌素的产量仍然很低,价格昂贵,难以满足临床需要。为充分挖掘基菌株的全基因组信息,从全基因组层面解析安丝菌素高产的原因,建立与高产相关的基因网络,高通量筛选安丝菌素高产因子库,本文考虑建立快速高效的常压室温等离子体（Atmospheric Room Temperature Plasma,ARTP）诱变体系、24深孔板微发酵和高通量生测筛选三大体系的综合研究方法。首先,以一株对安丝菌素高度敏感的线黑粉酵母（Filobasidiumuniguttulatum）为出发建立高通量生测筛选体系。对该体系进行一系列优化,最终确立高通量生测筛选体系的最佳参数:在液体摇瓶YPD培养15 h时使线黑粉酵母指示菌株处于对数生长期中期,且当摇瓶至孔板的接种量为10%时,指示菌与安丝菌素混合培养至30 h达到稳定期,可以明显观察到指示菌在0.2-0.7μg/m L安丝菌素浓度之间的生长变化,酶标仪OD600读数与安丝菌素浓度之间的标准曲线为y=0.0228x+1.8377,R2=0.9906。以安丝菌素产量提高15%作为筛选指标,可筛选出安丝菌素的高产突变株。除此之外,对于快速高效的ARTP诱变体系的建立方面,主要对菌丝体断裂情况及ARTP照射时间进行优化,当在液体YMG培养基中培养出发菌株珍贵束丝放线菌至24 h时,菌丝体断裂状态最为明显,并利用孢子过滤器将菌丝体过滤以保证ARTP诱变菌株尽可能保证单细胞形态。且当ARTP照射时间为120 s时,菌丝体的致死率达到85.6%,可将该条件下诱变的菌株用于后期发酵筛选。经高通量生测筛选平台筛选出的两株M13、M144进行二代全基因组重测序,测序结果显示,突变株M13中共有58个突变位点、突变率为6.35×10-6,M144突变株共有51个突变位点、突变率为6.12×10-6。为便于利用全基因组关联分析（Genome-Wide Association Studies,GWAS）高效地进行安丝菌素高产因子的关联挖掘,应适当降低每株突变株内突变位点数量,确保每株高产突变株的突变位点尽可能维持在10个左右,主要考察100 W和120 W电功率条件下突变株的正突变率和致死率情况。在100 W电功率条件下,当照射时间为60 s时致死率达到81.45%、正突变率为17.71%,为最佳照射时间。经摇瓶复证后可得到四株突变株30A1、30A6、120G8和120G10,安丝菌素产量分别增加21.2%、20.8%、23.3%和34%。而在120 W电功率条件下,当照射时间为30 s时致死率为60.40%、正突变率为11.46%,为最佳照射时间。摇瓶复证后,可得到四株突变株15H5、30G12、30H9和60D3,安丝菌素产量分别增加18.1%、23.3%、18.2%和15.3%,可作为安丝菌素高产稳定突变株。最终,共得到八株安丝菌素高产稳定遗传突变株。综上,在建立起高效灵敏的高通量生测筛选体系的基础上,以初期ARTP诱变条件诱变出的两株高产突变株的二代重测序突变位点信息为指示,具体摸索ARTP诱变100 W和120 W电功率条件下突变株的正突变率和致死率情况,最终筛选得到八株安丝菌素高产稳定遗传突变株。为后期进行大规模诱变建立安丝菌素突变体库,最终从全基因组层面解析AP-3的高产原因,建立珍贵束丝放线菌的代谢网络奠定基础。
周丽[4]（2020）在《米尔贝霉素单组分高产菌株选育及发酵放大研究》文中研究指明米尔贝霉素是一类十六元环大环内酯类的聚酮类化合物,根据化合物中是否具有氢化苯并呋喃结构,可将其简单分为α-型和β-型两类结构。由于α-型的活性远高于β-型,国内外研究以α-型为主。目前商业化市场的主流产品是C-5肟化的米尔贝霉素,是A3肟和A4肟的混合物,比例要求A3肟小于20%,A4肟大于80%,其活性高、毒性作用低、安全可靠、易降解以及对寄生虫有优良的防治效果,因而被广泛用于抗寄生虫药物。米尔贝霉素肟的混合物工业化生产是半发酵半合成获得的,发酵获得米尔贝霉素,发酵液经过提取精制合成获得肟化混合物。米尔贝霉素肟的比例有严格的要求,因两个组分结构和理化性质相似,提取过程也很难去控制,所以单组分高产菌株选育和发酵培养优化,对于提高米尔贝霉素肟生产水平有重大意义。本研究以链霉菌Streptomyces milbemycinicus CGMCC 7677为出发菌,经自然分离获得的菌株,效价1056 mg/L,A4含量74.7%,经过紫外、常压室温等离子体、亚硝基胍、甲基磺酸乙酯等物理化学单独或组合诱变,采用含有甘氨酸、乙酸钠及利福霉素的抗性平板进行筛选,米尔贝霉素发酵效价提高3倍多。继续使用含有3-溴丙酮酸的抗性平板筛选获得两个跟出发菌株菌落形态差别较大的菌落,两个菌株分别进行进一步的诱变和抗性筛选,获得两株米尔贝霉素单组分高产菌株75-22（A4高产）和95-23（A3高产）。突变株75-22摇瓶效价（A3+A4）3500 mg/L以上,A4含量80%以上。突变株95-23摇瓶效价（A3+A4）3000 mg/L,A3含量70%以上。对两株突变株遗传稳定性进行考察,遗传稳定性良好。对新选育的菌株移种条件、培养温度和培养基装量等参数进行考察。通过碳源和氮源单因素筛选、正交实验对发酵培养基进行优化,获得适合不同单组分高产菌株的发酵培养基。使用优化过的培养基及培养条件,75-22摇瓶培养12天,发酵效价（A3+A4）可以达到3700 mg/L,A4含量80%以上。95-23摇瓶培养12天,72hr补入0.2%的乙酸钠和0.2%丙酸钠,发酵效价（A3+A4）达到了 3100 mg/L,A3含量70%以上。两个菌株在50L发酵罐进行放大,通过分析模拟摇瓶试验代谢曲线,增加补料工艺。75-22在50L发酵罐培养12天,通过补加果糖,发酵效价（A3+A4）达到了 3600 mg/L以上,A4含量80%以上。95-23在50L发酵罐培养12天,通过补加葡萄糖和前体,发酵效价（A3+A4）达到了 3000 mg/L以上,A3含量70%以上。米尔贝霉素高产单组分菌株的选育和发酵放大研究,为米尔贝霉素工业化生产成本降低、质量提高提供了良好的基础。
刘璐[5]（2020）在《重离子束辐照恩拉霉素菌株的选育研究》文中指出恩拉霉素作为一种新型商业抗菌剂,由于其具有热稳定、不易产生交叉耐药性、低残留、对大多数革兰氏阳性菌的强大杀菌作用以及促进动物生长等独特的优点,广泛应用于国内外的畜禽养殖业中。目前恩拉霉素主要由杀真菌素链霉菌（Streptomyces fungicidicus）进行液体有氧发酵生产,然而仍存在恩拉霉素菌株生产水平低、发酵成本高、恩拉霉素生物合成途径和代谢调节机制了解不充分等问题。因此,本论文首次以重离子束辐照作为微生物诱变手段获得大量S.fungicidicus突变体,通过多重筛选得到恩拉霉素高产菌株,并进一步对发酵工艺优化和发酵过程调控方面进行了研究。此外,利用基因组学手段分析了突变菌株的变异位点及相关高产机制。具体研究结果如下:（1）选择能量为80MeV/u,LET为40keV/μm的重离子束对恩拉霉素产生菌SG-01进行不同剂量的辐照处理。通过平板计数法统计菌株的致死率,确定菌株致死率与辐照剂量两者之间呈现良好的线性关系。利用琼脂块筛选和摇瓶筛选得到了三株高产恩拉霉素菌株M13、M30和M34,并且三株突变菌株连续5代产恩拉霉素能力比较稳定。M13、M30和M34具有显着增强的恩拉霉素合成能力,其中M30发酵至第10天时恩拉霉素产量达到0.69g/L,恩拉霉素的最大比生产率为0.004g/L/d,比原始菌株高2.48倍。同时,通过平板培养和扫描电镜观察发现突变菌株的产孢能力增强,孢子量比较丰富,这有利于恩拉霉素合成。RAPD分析从分子水平表明重离子束辐照增加了恩拉霉素产生菌的基因组多态性,从而引起基因功能、结构及表达的变化。（2）以M30为研究对象,对发酵培养基中的葡萄糖、淀粉、玉米浆、KH2PO4和精氨酸的浓度,发酵条件中的初始pH、转速和接种量开展单因素优化实验研究。优化后的发酵培养配方为:葡萄糖4%,玉米浆2%,可溶性淀粉4%,玉米蛋白粉3%,NaCl 1.5%,NH4Cl 0.5%,CaCO3 1.5%,KH2PO4 0.02%,精氨酸0.1%。优化后的培养条件为:初始pH值为8.0,接种量为4%,转速为220r/min。根据单因素优化结果进行最优条件下的M30摇瓶发酵实验,M30在发酵至第10天时,恩拉霉素产量为0.94g/L,与初始发酵条件相比产量提高了36%。（3）采用除杂甜高粱汁代替葡萄糖发酵生产恩拉霉素。首先,比较了葡萄糖和未除杂甜高粱汁对M30生长和恩拉霉素合成的影响,发现以未除杂甜高粱汁为原料发酵至10天时恩拉霉素产量为0.77g/L。之后考察甜高粱汁中的杂质成分对M30发酵产恩拉霉素的影响,经过除杂处理后的甜高粱汁发酵生产恩拉霉素,其产量在第10天达到0.87g/L,这与葡萄糖结果相接近。以初始浓度为40g/L的除杂甜高粱汁为原料进行摇瓶分批补料发酵实验,M30在第11天时可以发酵产生1.01g/L的恩拉霉素,生产率为0.09g/L/d。最后,添加0.04g/L的尼泊金甲酯不仅可以延长甜高粱汁的贮藏期,而且对M30的生长和恩拉霉素的合成不会产生显着的抑制作用。（4）研究维生素C的添加对M30发酵过程的影响,确定维生素C的添加浓度和添加时间分别为90mmol/L和4天时可以显着提高恩拉霉素的产量。当发酵至第8天时,恩拉霉素产量达到0.82g/L并提高了17%。在整个发酵过程中,添加维生素C的实验组与对照组相比,在发酵6天后恩拉霉素合成速率提高。添加维生素C可以显着提高M30细胞内超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）的活力,改善了细胞的总抗氧化能力,减轻了活性氧（ROS）对细胞膜及生物大分子的损伤。最后,建立了含尼泊金甲酯的除杂甜高粱汁结合维生素C的摇瓶分批补料发酵策略,恩拉霉素的产量在第11天时达到1.14g/L。（5）利用三代与二代基因组测序相结合的方式,对原始菌株SG-01和突变菌株M13、M30和M34进行基因组信息分析和变异位点的挖掘。结果显示,SG-01、M13、M30和M34的基因组大小在7.62-7.74Mb之间,GC含量为72%左右。以原始菌株SG-01的基因组为参考基因组,在M13、M30和M34的基因组中共检测到24个SNP、34个小片段Indels和58个SV。恩拉霉素生物合成途径中非核糖体多肽合成酶（EndB）,糖原合成代谢通路中1,4-α-葡聚糖分支酶（GBE）和PucR家族转录调控因子的基因在M13、M30、M34中均发生了变异。这些信息可作为新颖的分子标记用于恩拉霉素产生菌或其他微生物的相关代谢机理和育种的辅助研究中。
刘永娟[6]（2020）在《基于核糖体工程技术的ε-聚赖氨酸高产菌株选育及高产机制解析》文中提出ε-聚赖氨酸（ε-poly-L-lysine,ε-PL）是由25-35个L-赖氨酸单体通过α-羧基和ε-氨基脱水缩合而成的同型L-赖氨酸链状聚合物。由于其具有pH使用范围宽、热稳定好、抑菌性广、水溶性强以及安全性能高等优点,目前主要作为防腐剂应用在食品防腐和保鲜领域,已经在日本、韩国、美国和中国等国家广泛使用。同时,作为一种新型阳离子生物聚合物,ε-PL还广泛应用于药物载体和生物材料研究。因此,选育ε-PL高产菌株及探究其高产机制,实现低成本、高效率ε-PL发酵生产,为ε-PL的产业化提供技术支撑至关重要。论文以S.albulus M-Z18为出发菌株,首先建立了针对S.albulus培养和ε-PL检测的高通量平台技术;然后,建立了多次抗生素抗性引入的核糖体工程育种技术,并结合基因组重排育种技术,大幅度提高了S.albulus的ε-PL合成能力;随后,借助生理生化分析手段,系统分析了突变株较出发菌株在生理水平上发生的变化;同时,借助比较蛋白质组学技术,系统分析了突变株较出发菌株在蛋白水平上发生的变化,在此基础上通过代谢工程手段进行了验证;最后,借助比较基因组学技术,深入分析了突变株较出发菌株在基因组水平上发生的变化,并初步构建了ε-PL高产代谢图谱。具体研究内容如下:（1）建立了针对S.albulus培养和ε-PL检测的高通量平台技术。以ε-PL产量为指标,考察了24/48深孔板最佳培养体系、深孔板微量培养替代摇瓶培养评估ε-PL产量、深孔板微量培养与摇瓶培养的比较。24孔板及摇瓶产量有比较好的相关性,相关系数R达到了0.812。24/48孔板都可以用酶标仪来测定,分光光度计和酶标仪对摇瓶发酵液产量、分光光度计与酶标仪对摇瓶和24孔板ε-PL发酵液产量测定均显示良好的一致性,相关系数R分别达到了0.924和0.868,以24/48孔板作为微量培养和ε-PL检测的高通量平台具有节约成本、操作简单、处理量大、快捷高效等优点。较传统的方法节约了大量的原材料、缩短了突变体选育周期,能明显提高ε-PL高产突变的选育效率。（2）建立了多次抗生素抗性引入的核糖体工程育种技术,并结合基因组重排育种技术,大幅度提高了S.albulus的ε-PL合成能力。以S.albulus M-Z18为出发菌株,从对链霉菌有高产突变作用的8种抗生素中确定4种有效抗生素,其中链霉素抗性菌ε-PL产量提高幅度最大,故选择链霉素作为多次筛选的抗性标记,经过2轮链霉素抗性筛选,获得了链霉素抗性高产突变菌株S.albulus SS-62,摇瓶产量由1.7 g·L-1提高到3.04 g·L-1,是出发菌株的1.79倍,单位菌体合成ε-PL的量是出发菌株的1.33倍。在此基础上,采用基因组重排育种技术获得ε-PL高产突变株S.albulus SG-86,ε-PL产量为4.16 g·L-1,相较于初始菌株提高了145%。（3）借助生理生化分析手段,系统分析了突变株S.albulus SS-62较出发菌株S.albulus M-Z18在生理水平上发生的变化。首先比较了高产突变菌株与出发菌M-Z18在菌体形态及分化、链霉素抗性、发酵性能与突变位点等方面的差异,发现高产突变株单菌落形态、孢子及基内菌丝形态、耐链霉素抗性的能力、发酵性能都发生很大变化;此外,高产突变菌株的rps L和rsmG基因都发生了突变;随后,比较了两株菌在ε-PL合成时的代谢流分布、ATP合成和关键酶活性,发现突变菌株SS-62代谢流重新进行了分布,流向前体L-赖氨酸和ε-PL的通量增加,ATP的合成和关键酶活性均提高。（4）借助比较蛋白质组学技术,系统分析了突变株S.albulus SS-62较出发菌株S.albulus M-Z18在蛋白水平上发生的变化。在S.albulus SS-62中共鉴定到401个蛋白在高产菌的表达量与出发菌株存在显着差异,这些差异表达蛋白主要与碳水化合物代谢、氨基酸代谢和能量代谢有关。这些差异表达蛋白不仅能增强ε-PL碳水化合物代谢、氨基酸代谢和能量代谢,而且能调节转录调控和翻译的相关途径,为合成ε-PL创造了一个更好的细胞代谢环境。在蛋白质组学分析的基础上过量表达ε-聚赖氨酸合成酶,ε-PL分批发酵产量提高了43.3%;过量表达核糖体循环因子,单位菌体合成ε-PL提高了9.7%。（5）借助比较基因组学技术,深入分析了突变株S.albulus SG-86较出发菌株S.albulus M-Z18在基因组水平上发生的变化。结果表明SG-86的基因组比M-Z18少了2.1M左右,SG-86缺失的基因组包括大量的基因缺失,甚至是代谢途径的缺失,基因组重排去除了SG-86中许多与?-PL合成无关的代谢途径,导致SG-86基因的基因组减小,代谢副产物合成减少,而更多的代谢流流向?-PL合成的前体物质L-赖氨酸,进而提高了?-PL的产量。此外,插入缺失突变有引起细胞的全局性响应。一些与膜蛋白、转运蛋白、转录调控、次级代谢产物合成等相关的基因发生突变。最终,基于比较基因组学的研究,初步构建了ε-PL高产代谢图谱。
沈政[7]（2019）在《去甲基金霉素高产菌株的筛选及其发酵工艺优化》文中进行了进一步梳理去甲基金霉素不仅是广泛使用的抗生素,还是治疗耐药菌感染的重要抗生素米诺环素、替加环素和潜在一线抗生素PTK0796的合成前体。本课题以去甲基金霉素产生菌——金色链霉菌HCCB 10088为研究对象,研究了在不同条件下影响去甲基金霉素生物合成的关键因素。首先,对金色链霉菌HCCB 10088分别进行EMS诱变、氯化锂结合紫外的复合诱变以及ARTP诱变,以终产物去甲基金霉素和主要前体物质丙二酸钠作为选择压力进行了定向筛选,丙二酸钠的筛选效果显着,最终经过氯化锂结合紫外的复合诱变和丙二酸钠的复筛后获得了高产菌株UM2-16,效价比出发菌株提高了约23.5%,且遗传稳定性较好。其次,考察了不同的种子条件对菌株UM2-16发酵的影响。发现保藏的斜面种子宜在15天内使用,100L种子罐用1支斜面接种为宜,发酵级数宜控制在4级以内,在正常的接种量和培养温度下,一级种子罐种龄在50h左右,种龄过短和过长都会导致发酵代谢异常,发酵移种比例以8～10%最为合适。再次,对菌株UM2-16的发酵培养基进行了优化。比较了氮源、碳源和无机盐等的种类和浓度对发酵的影响,得到了较优的培养基组成为:淀粉70g/L,黄豆饼粉25 g/L,赖氨酸盐8 g/L,氯化钠3 g/L,硫酸铵2 g/L,玉米浆3 g/L,碳酸钙10 g/L,豆油9.3 g/L,α-淀粉酶0.07 g/L,确定了黄豆饼粉为40～60目和100～120目各一半,确定了培养基中的初始还原糖浓度宜控制在1%以下,防止微生物代谢过快而生长异常。当菌株UM2-16采用优化后的配方培养,发酵效价为 6524 μμg/mL。然后,对菌株UM2-16的发酵补料工艺进行优化,确定较优的补料工艺为:当发酵液中的总糖浓度降至4.5%左右时开始流加淀粉水解液,通过调节流加速率将总糖浓度控制在2.5～3.5%,培养至放罐前1天停止补加;当pH低于5.9后通过补加氨水控制发酵液的pH值在最佳的产物合成pH范围（pH 5.9～6.1）内;在30 h左右根据泡沫情况开始补加消泡剂,消泡剂采用豆油:GPE为3:1的混合物。UM2-16用优化后的发酵配方和补料工艺后,发酵效价约为9000μg/mL。最后,对菌株UM2-16发酵过程中的搅拌器类型和搅拌转速控制方式进行了研究。结果表明,搅拌器采用底层为CD-6和中上层为lightninA315的组合形式时,具有较低的剪切作用和较强的混合、传质效果,菌丝形态主要为球形,发酵液粘度适中,有利于去甲基金霉素的合成。搅拌转速根据溶氧值动态调节,发酵开始时电机频率宜设置为30 hz,当溶氧低于40%则增加电机频率5 hz,直至搅拌转速全开,这样既能降低剪切作用,又能节省动力消耗。当诱变菌株UM2-16采用优化后的发酵生产工艺,去甲基金霉素的发酵效价可达9000 μμg/mL以上,相比优化前提高了 70%以上。
周秋玲[8]（2019）在《复合育种策略选育喷司他丁高产菌株》文中研究指明喷司他丁（Pentostatin,PNT）为拟嘌呤核苷类抗生素,是高效的腺苷脱氨酶抑制剂,可用于治疗多种肿瘤方面的临床疾病。PNT合成方法主要包括化学合成法和生物合成法,相较于生物合成法,化学合成法不但成本高、反应条件苛刻且路线复杂,实施难度较大。而生物合成法的反应条件温和、绿色环保,可行性较强,但生物合成法最大的瓶颈是PNT产率较低。基于此,本论文主要利用代谢调控、常压室温等离子体（atmospheric and room temperature plasma,ARTP）以及核糖体工程等策略诱变和选育高产PNT的突变株。构建了PNT合成关键基因AdaE和AdaJ的敲除株以及基因AdaA的过表达株。经LC-MS检测没有发现有PNT的产生,可能是基因敲除和过表达操作对基因簇本身调控机制带来了干扰,影响了PNT生物合成基因簇的表达。利用ARTP诱变选育PNT高产菌株。将Actinomadura sp.ATCC39365作为出发菌株,以致死率为考查指标,优化了ARTP的诱变条件,确定ARTP诱变最优条件为130w,12 SLM,200 s。筛选出遗传稳定性良好的菌株为Actinomadura sp.M-26（2.740mg/L）,与出发菌株相比,PNT摇瓶产量提高了11.75%。利用核糖体工程技术选育具有单抗性的PNT高产菌株。首先,测定备用抗生素对野生型Actinomadura sp.ATCC39365的最小抑菌浓度和最佳筛选浓度。采用最佳筛选浓度获得一株抗Pen且遗传稳定良好的PNT高产菌株Actinomadura sp.M-65（3.298mg/L）,与出发菌株Actinomadura sp.ATCC39365相比,PNT产量提高了34.5%;ARTP诱变选育出的Actinomadura sp.M-26经过Str抗性筛选得到一株稳定性较好的PNT高产菌株Actinomadura sp.MM-10（5.188 mg/L）与Actinomadura sp.M-26菌株相比PNT产量增加了89.34%,且与出发菌株相比摇瓶发酵PNT产量增加了111.58%。利用核糖体工程技术选育双重抗性PNT高产菌株。以PNT高产菌株Actinomadura sp.M-22、Actinomadura sp.M-26、Actinomadura sp.M-53和Actinomadura sp.M-65为出发菌株,再次经过抗性筛选得到6株PNT高产菌株,其中一株遗传稳定较好且产量较高突变株Actinomadura sp.MM-45（6.077 mg/L）,在突变株Actinomadura sp.MM-65基础上PNT产量增加了84.15%,与出发菌株相比摇瓶发酵PNT产量提高了147.84%。突变株关键基因突变位点分析:使用Blast、Clustal X和SnapGene Viewer软件对分别6株Str抗性菌株和1株Gen抗性菌株的关键基因的突变位点分析发现:6株Str抗性菌株中有5株rspL基因的第28位的碱基A缺失,只有Actinomadura sp.MM-46的rspL基因没有发生突变,与已报道文献比较,可能是rspL突变引起了菌株对Str的抗性;6株Str抗性菌株中有5株菌株的rpoB基因发生了随机突变且突变位点较多,其中Actinomadura sp.MM-26没有发生突变,猜测PNT产量的提高与rpoB无关;6株Str抗性菌株的rsmG基因发生突变的主要位置有188位C缺失、193位C缺失和467位T替换C,可能rsmG基因上的突变也能使菌株获得Str抗性。1株Gen抗性菌株的rslF基因发生突变为175位T替换C及462位后插入碱基A,突变结果可能引起菌株获得Gen抗性。
王靓[9]（2018）在《ε-聚赖氨酸产生菌的育种、发酵及高产机制的初步生理解析》文中研究指明ε-聚赖氨酸（ε-poly-L-lysine,ε-PL）是一种由25-35个L-赖氨酸单体通过α-COOH和ε-NH2脱水缩合而成的天然高分子聚合物。由于其易溶于水、对热稳定、可被生物降解、抑菌谱广泛、安全性高和临床疗效良好等优点,ε-PL被作为食品防腐剂、药物载体、食疗剂、乳化剂和水凝胶等在日本、韩国、美国和中国等国家广泛应用。本文以Streptomyces sp.G67为出发菌株,首先利用多轮复合诱变、基因组重排结合核糖体工程,依次筛选出了的单重和多重抗性突变株菌,大幅提高了ε-PL摇瓶产量,并从生理角度解释了高产机制。随后,构建并比较了高产菌与原始菌的ε-PL合成代谢途径,进一步分析了高产机制。最终建立了一种具有工业化应用潜力的酸性pH冲击-溶氧调控策略（PS-PAD）,并考察了该策略在5 L补料-分批发酵过程中引起的生理变化。具体研究内容如下:（1）紫外（UV）、常温常压等离子体（ARTP）和甲基磺酸乙酯（EMS）诱变三种方法中,ARTP和EMS的诱变效果明显好于UV诱变,因此选择这两种方法对G67进行复合诱变。六种作用于核糖体的抗生素中,只有与核糖体工程相关的链霉素、庆大霉素和利福霉素抗性能提高ε-PL产量,其中链霉素抗性（Strr）菌ε-PL产量提高幅度最大,故选择链霉素作为复合诱变的抗性标记。经过3轮“复合诱变+Strr”筛选,获得了单重抗性高产菌GS-1,摇瓶产量由1.9 g·L-1提高到2.81 g·L-1,提高了47.9%。扩增片段长度多态性（AFLP）分析表明“复合诱变+Strr”的育种方法能增加突变株的基因多态性,促使其ε-PL产量的快速提高。（2）利用基因组重排结合庆大霉素抗性（Genr）选育多重抗性菌株。首先,采用ARTP诱变构建“Genr突变库”,经过三轮递推式基因组重排,获得StrrGenr双抗突变株GSG-1,摇瓶产量为3.56 g·L-1,较G67提高了87.3%。AFLP分析表明“基因组重排+Genr”育种方法比诱变更能促进突变株菌基因的多样化。随后,通过三轮核糖体工程育种,进一步提高了双抗突变株的利福霉素抗性（Rifr）,构建了StrrGenrRifr三抗突变株GSGR-1,摇瓶产量为4.23 g·L-1,是G67产量的2.23倍。（3）首先比较突变株与出发菌G67在菌体形态、培养特征、ε-PL摇瓶与5 L罐发酵水平、抗生素抗性与突变位点等方面的差异。随后,通过分析突变株在合成ε-PL时菌体的生理变化,包括菌体死活,ε-PL合成代谢途径中的关键酶活性及转录水平,从生理水平上初步阐释突变株的高产机制。（4）对原始菌S.albulus M-Z18和双重抗性高产菌Streptomyces sp.GSG-1进行全基因组测序和功能注释,利用KEGG分析构建了ε-PL合成代谢图谱。随后,比较M-Z18和GSG-1在ε-PL合成代谢途径与核糖体蛋白上的差异,并推测了GSG-1的高产机制:GSG-1与M-Z18的ε-PL生物合成途径大体相同,由于乙酰-CoA连接酶（EC 6.2.1.13）、葡萄糖脱氢酶（EC 1.1.1.47）、L-Lys 6-氨基转移酶（EC 2.6.1.36）和L-Lys氨基变位酶（EC5.4.3.2）的缺失,促使GSG-1的TCA循环通量增大,副产物（如β-D-葡萄糖,酒精）合成量减少,L-Lys的分解途径减弱。最终造成了GSG-1中心代谢途径的增强和胞内L-Lys的积累,以及ε-PL产量的增加。在5 L发酵罐上进行了分批发酵实验,验证了上述结论。（5）建立了pH冲击-溶氧调控（pH shock-pH asisted DO control strategy,PS-PAD）策略,成功解决了突变株在补料-分批发酵后期菌株呼吸活力减弱,ε-PL产率快速下降的问题,大幅度提高了突变株的5 L罐补料-分批发酵水平。具体步骤是:（1）预培养阶段:pH被设定在5.5并维持10 h;（2）pH冲击阶段:pH自然从4.0下降至3.3,维持5 h;（3）恢复阶段:将pH值设定为3.8,促进菌株快速合成ε-PL。（4）补料阶段溶氧上升时,通过微调pH（3.8-4.2）,将溶氧控制在15%-30%之间直至发酵结束。应用该策略,突变株GSGR-1在5 L发酵罐的补料-分批发酵水平达到了82.3 g·L-1,为目前文献报道的最高水平。为探索PS-PAD策略对ε-PL合成代谢的影响,比较了PS-PAD策略与恒定pH策略下GSGR-1的生理变化,发现PS-PAD策略下细胞呼吸活力、呼吸链活力以及ε-PL合成代谢途径和中心代谢途径的关键酶活全部被强化,并维持到发酵结束。这证明了pH溶氧调控策略能长期维持由酸性pH冲击带来的菌体活力和ε-PL产率的提升,初步揭示了GSGR-1大量合成ε-PL的原因。
解慧欣[10]（2018）在《阿卡波糖高产机制解析及菌株改造》文中进行了进一步梳理阿卡波糖（Acarbose）作为α-葡萄糖苷酶抑制剂类药物,因其高效、安全而被广泛应用于2型糖尿病的治疗,工业上主要采用游动放线菌（Actinoplanes spp.）发酵生产。目前,通用的阿卡波糖高产菌株为Actinoplanes sp.SE50/110,由野生型菌株Actinoplanes sp.SE50随机诱变而来。经测定,高产菌株发酵生产的阿卡波糖产量是野生型的两倍左右,且其中阿卡波糖合成基因簇的转录水平是野生型的48倍。为了解析SE50/110中的高产机制,本研究在测得野生型菌株SE50全基因组序列后,精确比较并分析了高低产菌株基因组之间的差异。PCR验证结果显示二者之间存在15个明确的突变位点,包括11个SNVs位点和4个InDels位点。经过分类整理后我们对8个编码框内部发生错义突变的基因进行了功能考察。发酵结果显示,在SE50中缺失基因ACWT4325（编码乙醇脱氢酶）后,阿卡波糖产量从1.87 g/L上升到了2.34 g/L（SE50/110的63%）,且生物量提高了18%;缺失基因ACWT7629（编码延伸因子G蛋白）后,产量增加到了2.54 g/L（SE50/110的68%）,且阿卡波糖合成基因簇转录水平明显增强。随后,本研究详细解析了突变基因的作用机理,并通过组合缺失实验对高产表型进行了重构。在此基础之上,本研究对高产机制进行了综合分析和利用,进一步改造了高产菌株,将其发酵生产阿卡波糖的产量由3.73 g/L提高到了4.21 g/L。此外,解析阿卡波糖生物合成过程的分子机制并进一步提升产量也是目前亟待解决的问题。本研究考察了不同麦芽糖浓度对阿卡波糖产量的影响,发现随着麦芽糖浓度提高,阿卡波糖产量先上升后下降,最适浓度为50 g/L。同时,检测了不同麦芽糖浓度下阿卡波糖合成相关基因的转录水平,发现麦芽糖浓度提高显着促进了转运蛋白基因acbW的转录。为了进一步考察acbW基因对阿卡波糖产量的影响,在SE50/110中将其缺失后,获得的突变株生长减弱,且无阿卡波糖积累,而加强表达acbW和acbWXY基因后,阿卡波糖产量分别提高了6.4%和8%。综上所述,本研究通过比较基因组学分析,解析了阿卡波糖的高产机制,并利用基因工程方法对高产菌株进行改造,得到了产量进一步提高的衍生菌株。此外,还通过发酵工艺优化及阿卡波糖合成基因簇中基因功能解析,证明acbWXY编码的转运蛋白在阿卡波糖的产生过程中至关重要,且强化该外运途径可有效提高阿卡波糖产量。
二、利福霉素产生菌诱变育种研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、利福霉素产生菌诱变育种研究（论文提纲范文）
（1）天蓝色链霉菌产达托霉素的发酵培养基优化及高产菌株选育（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 达托霉素简介 |
| 1.1.1 达托霉素结构 |
| 1.1.2 达托霉素理化性质 |
| 1.1.3 达托霉素的作用机制研究进展 |
| 1.1.4 达托霉素生物合成研究进展 |
| 1.2 达托霉素发酵工艺研究进展 |
| 1.2.1 培养基各组分对达托霉素产量的影响 |
| 1.2.2 达托霉素发酵工艺的优化策略 |
| 1.3 高产菌株育种技术概述 |
| 1.3.1 物理诱变技术 |
| 1.3.2 化学诱变技术 |
| 1.3.3 基因组重排技术 |
| 1.4 本论文研究的目的和意义 |
| 第二章 响应面法优化达托霉素发酵培养基的成分 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验菌株 |
| 2.1.2 培养基及相关溶液配制 |
| 2.1.3 实验主要仪器设备和试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 菌种保藏与活化 |
| 2.2.2 培养方法 |
| 2.2.3 分析方法 |
| 2.2.4 达托霉素标准溶液的配制 |
| 2.2.5 发酵培养基成分单因素实验优化 |
| 2.2.6 Plackett-Burman试验设计 |
| 2.2.7 最陡爬坡实验设计 |
| 2.2.8 响应面实验设计 |
| 2.2.9 实验数据处理 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 达托霉素标准曲线的绘制 |
| 2.3.2 单因素实验优化结果 |
| 2.3.3 PB实验筛选结果 |
| 2.3.4 最陡爬坡实验结果 |
| 2.3.5 CCD实验结果 |
| 2.3.6 摇瓶产量验证结果 |
| 2.4 小结与讨论 |
| 第三章 达托霉素高产菌株选育 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验菌株 |
| 3.1.2 培养基与相关溶液配制 |
| 3.1.3 实验主要仪器设备和试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 菌种保藏与活化 |
| 3.2.2 培养方法 |
| 3.2.3 分析方法 |
| 3.2.4 紫外诱变 |
| 3.2.5 亚硝基胍诱变 |
| 3.2.6 基因组重排 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 紫外诱变结果 |
| 3.3.2 亚硝基胍诱变结果 |
| 3.3.3 基因组重排实验结果 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 第四章 结论与展望 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
（2）等离子体作用结合氧限制模型选育利福霉素SV高产菌株（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌种与培养基 |
| 1.1.1 菌种 |
| 1.1.2 培养基 |
| 1.1.3 实验仪器 |
| 1.2 培养方法 |
| 1.2.1 平板培养 |
| 1.2.2 种子培养 |
| 1.2.3 发酵培养 |
| 1.2.4 24孔板培养 |
| 1.2.5 ARPT诱变 |
| 1.2.6 氧限制模型 |
| 1.3 测定方法 |
| 1.3.1 效价测定 |
| 1.3.2 菌浓检测 |
| 1.3.3 还原糖测定 |
| 1.3.4 在线参数检测 |
| 2 结果与讨论 |
| 2.1 24孔板高通量培养和检测方法的确定 |
| 2.1.1 孔板供氧水平和发酵时间对利福霉素SV发酵的影响 |
| 2.1.2 孔板培养与摇瓶培养一致性考察 |
| 2.2 诱变筛选高产菌株 |
| 2.2.1 致死率曲线 |
| 2.2.2 氧限制条件下地中海拟分支杆菌的筛选模型 |
| 2.2.3 结合氧限制模型和ARTP诱变选育高产菌株 |
| 2.2.4 高产菌株遗传稳定性验证 |
| 2.2.5 50L发酵罐中低供氧条件下生理代谢参数对比 |
| 3 结论 |
（3）基于ARTP诱变的安丝菌素P-3高产菌株高通量筛选体系的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 抗体药物偶联物(ADCs)的研究进展 |
| 1.2 美登素与安丝菌素的生物合成途径 |
| 1.2.1 美登素与安丝菌素的发现历程 |
| 1.2.2 安丝菌素的相关基因簇及生物合成途径 |
| 1.3 安丝菌素的高产研究现状 |
| 1.3.1 培养条件的优化提高安丝菌素的产量 |
| 1.3.2 代谢工程改造方法提高安丝菌素的产量 |
| 1.3.3 传统方法诱变育种提高安丝菌素的产量 |
| 1.3.4 组合策略方法提高安丝菌素的产量 |
| 1.4 新型诱变方式--常压室温等离子体(ARTP)诱变 |
| 1.5 立题目的及意义 |
| 1.6 本论文主要研究内容 |
| 第二章 实验方法与材料 |
| 2.1 菌株 |
| 2.2 培养基 |
| 2.3 试剂 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 安丝菌素产生菌摇瓶及孔板发酵、后处理及产量检测方法 |
| 2.4.1.1 安丝菌素产生菌摇瓶发酵及后处理方法 |
| 2.4.1.2 安丝菌素产生菌孔板发酵及下发酵方法 |
| 2.4.1.3 安丝菌素产量HPLC检测方法 |
| 2.4.2 常压室温等离子体(ARTP)诱变体系的建立方法 |
| 2.4.3 生测高通量筛选体系的优化方法 |
| 第三章 高通量生测筛选体系的优化 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 结果与讨论 |
| 3.2.1 线黑粉酵母的生长曲线 |
| 3.2.2 孔板至摇瓶不同接种量情况下线黑粉酵母生长变化 |
| 3.2.3 孔板中不同AP-3 浓度下对指示菌生长影响 |
| 3.2.4 AP-3浓度与酶标仪OD_(600)读数之间的变换关系 |
| 3.3 小结 |
| 第四章 ARTP诱变体系的初步优化 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 结果与讨论 |
| 4.2.1 不同培养条件下菌丝体断裂情况 |
| 4.2.2 ARTP诱变时间优化并绘制致死率曲线 |
| 4.2.3 利用生测高通量筛选体系筛选ARTP诱变后高产菌株 |
| 4.2.4 摇瓶传代AP-3 高产菌株以筛选高产稳定遗传突变株 |
| 4.2.5 高产稳定遗传突变株M13 和M144 的二代测序信息分析 |
| 4.3 小结 |
| 第五章 ARTP诱变体系条件的进一步优化 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 结果与讨论 |
| 5.2.1 100W电功率条件下的诱变情况 |
| 5.2.1.1 100W电功率条件下的突变株的致死率情况 |
| 5.2.1.2 100W电功率条件下突变株的正突变率情况 |
| 5.2.1.3 100W电功率下高产突变株的摇瓶复证结果 |
| 5.2.2 120W电功率条件下的诱变情况 |
| 5.2.2.1 120W电功率条件下突变株的致死率情况 |
| 5.2.2.2 120W电功率条件下突变株的正突变率情况 |
| 5.2.2.3 120W电功率下高产突变株的摇瓶复证结果 |
| 5.3 小结 |
| 第六章 单因素实验优化发酵培养基 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 结果与讨论 |
| 6.2.1 单因素实验优化培养基碳氮源 |
| 6.2.2 酵母提取物对安丝菌素产量影响 |
| 6.2.3 前体物质缬氨酸浓度对AP-3产量影响 |
| 6.3 小结 |
| 第七章 总结与展望 |
| 7.1 总结 |
| 7.2 研究创新点 |
| 7.3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间已发表或录用的论文 |
（4）米尔贝霉素单组分高产菌株选育及发酵放大研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩写符号术语表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 米尔贝霉素的组成和结构 |
| 1.2 米尔贝霉素的应用 |
| 1.3 米尔贝霉素的生物合成 |
| 1.4 米尔贝霉素的产生菌 |
| 1.5 米尔贝霉素生产菌种的选育 |
| 1.6 米尔贝霉素的发酵工艺 |
| 1.7 研究目的及内容 |
| 第二章 米尔贝霉素单组分高产菌株的诱变选育 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌种 |
| 2.1.2 培养基 |
| 2.1.2.1 斜面/平板孢子培养基 |
| 2.1.2.2 种子培养基 |
| 2.1.2.3 原始发酵培养基 |
| 2.1.3 原始培养条件 |
| 2.1.4 仪器及药品 |
| 2.2 HPLC测定米尔贝霉素效价的方法 |
| 2.3 实验内容 |
| 2.3.1 菌株的自然分离选育 |
| 2.3.2 菌株的诱变处理 |
| 2.3.2.1 单孢子悬液制备 |
| 2.3.2.2 紫外(UV)诱变处理 |
| 2.3.2.3 NTG(亚硝基胍)诱变处理 |
| 2.3.2.4 EMS(甲基磺酸乙酯)诱变处理 |
| 2.3.2.5 ARTP(常压室温等离子)诱变处理 |
| 2.3.2.6 多种诱变方式的混合诱变 |
| 2.3.2.7 紫外-氯化锂复合诱变 |
| 2.3.3 突变菌株的抗性筛选 |
| 2.3.3.1 出发菌株对不同抗性物质最小抑制浓度的确定 |
| 2.3.3.2 突变菌株的抗性选育 |
| 2.3.4 突变菌株的遗传稳定性研究 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 出发菌株的自然分离选育 |
| 2.4.2 不同诱变方式单独作用最佳诱变条件研究 |
| 2.4.2.1 紫外辐照诱变时间的选择 |
| 2.4.2.2 NTG最佳诱变浓度和诱变时间的研究 |
| 2.4.2.3 EMS最佳诱变条件的选择 |
| 2.4.2.4 ARTP最佳诱变时间的选择 |
| 2.4.2.5 UV-LiCl复合诱变LiCl浓度的确定 |
| 2.4.3 抗性筛选条件的研究 |
| 2.4.3.1 甘氨酸最小抑制浓度的确定 |
| 2.4.3.2 乙酸钠最小抑制浓度的确定 |
| 2.4.3.3 3-溴丙酮酸最小抑制浓度的确定 |
| 2.4.3.4 利福霉素最小抑制浓度的确定 |
| 2.4.4 米尔贝霉素单组分高产菌株的筛选 |
| 2.4.5 突变菌株的遗传稳定性研究 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 单组分高产突变株发酵条件优化 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌种 |
| 3.1.2 培养基 |
| 3.1.3 材料和药品 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 突变菌株培养条件优化 |
| 3.2.1.1 突变菌株移种时间确定 |
| 3.2.1.2 突变菌株最适培养温度的确定 |
| 3.2.1.3 突变菌株最适摇瓶装量的研究 |
| 3.2.1.4 剪切力对突变菌株发酵性能的影响 |
| 3.2.2 突变菌株培养基配方的优化 |
| 3.2.2.1 最适碳源的筛选 |
| 3.2.2.2 迟效氮源的确定 |
| 3.2.2.3 速效有机氮源的确定 |
| 3.2.2.4 无机氮源添加试验 |
| 3.2.2.5 正交试验设计优化培养基的碳源和氮源 |
| 3.2.2.6 豆油最适添加量的确定 |
| 3.2.2.7 米尔贝霉素前体最适添加时间的确定 |
| 3.2.3 测定指标及检测方法 |
| 3.2.3.1 pH检测方法 |
| 3.2.3.2 菌丝浓度检测方法 |
| 3.2.3.3 效价检测方法 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 突变株培养条件优化结果 |
| 3.3.1.1 突变菌株种子培养时间优化结果 |
| 3.3.1.2 突变菌株最适培养温度的确定 |
| 3.3.1.3 突变菌株最适摇瓶装量的研究结果 |
| 3.3.1.4 突变株对剪切力敏感性研究 |
| 3.3.2 突变菌株培养基配方优化结果 |
| 3.3.2.1 最适碳源的筛选 |
| 3.3.2.2 迟效氮源的确定 |
| 3.3.2.3 速效有机氮源的确定 |
| 3.3.2.4 无机氮源的筛选 |
| 3.3.2.5 正交试验设计优化培养基的碳源和氮源 |
| 3.3.2.6 豆油最适添加量的确定 |
| 3.3.2.7 米尔贝霉素前体最适添加时间的确定 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 单组分高产突变株发酵放大工艺的初步研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 菌种 |
| 4.1.2 培养基 |
| 4.1.3 材料和药品 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 两突变株的发酵放大工艺控制 |
| 4.2.2 两突变株的补料工艺控制 |
| 4.2.3 测定指标及检测方法 |
| 4.2.3.1 总糖检测方法 |
| 4.2.3.2 氨基氮检测方法 |
| 4.2.3.3 菌丝浓度的检测方法 |
| 4.2.3.4 葡萄糖、果糖、蔗糖的检测方法 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 突变株75-22模拟摇瓶发酵实验 |
| 4.3.1.1 突变株75-22模拟摇瓶发酵控制曲线 |
| 4.3.1.2 突变株75-22模拟摇瓶发酵代谢曲线 |
| 4.3.1.3 突变株75-22模拟摇瓶糖代谢与效价曲线 |
| 4.3.2 突变株75-22发酵补料实验 |
| 4.3.2.1 突变株75-22补料实验发酵控制曲线 |
| 4.3.2.2 突变株75-22补料实验发酵代谢曲线 |
| 4.3.2.3 突变株75-22补料实验发酵糖代谢与效价曲线 |
| 4.3.3 突变株95-23发酵模拟摇瓶实验 |
| 4.3.3.1 突变株95-23模拟摇瓶发酵控制曲线 |
| 4.3.3.2 突变株95-23模拟摇瓶发酵代谢曲线 |
| 4.3.3.3 突变株95-23模拟摇瓶糖代谢与效价曲线 |
| 4.3.4 突变株95-23发酵补料实验 |
| 4.3.4.1 突变株95-23补料实验发酵控制曲线 |
| 4.3.4.2 突变株95-23补料实验发酵代谢曲线 |
| 4.3.4.3 突变株95-23补料实验发酵糖代谢与效价曲线 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 实验结论 |
| 5.2 论文的创新点 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（5）重离子束辐照恩拉霉素菌株的选育研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 恩拉霉素 |
| 1.1.1 恩拉霉素的化学结构与理化性质 |
| 1.1.2 恩拉霉素的功能与作用机制 |
| 1.1.3 恩拉霉素检测方法 |
| 1.1.4 恩拉霉素的用途及市场前景 |
| 1.2 恩拉霉素生物合成途径 |
| 1.2.1 恩拉霉素生物合成基因簇 |
| 1.2.2 恩拉霉素生物合成方式 |
| 1.3 恩拉霉素菌株选育与发酵调控 |
| 1.3.1 恩拉霉素生产菌株 |
| 1.3.2 恩拉霉素菌株改良筛选 |
| 1.3.3 恩拉霉素发酵优化及过程调控 |
| 1.4 重离子辐照育种技术 |
| 1.5 廉价生物原料 |
| 1.6 DNA分子标记技术 |
| 1.6.1 分子标记技术简介 |
| 1.6.2 分子标记技术在微生物研究中的应用 |
| 1.7 基因组测序 |
| 1.7.1 测序技术的发展 |
| 1.7.2 基于高通量测序技术的突变菌株高产机制研究 |
| 1.8 研究内容、目的及意义 |
| 第2章 重离子束辐照选育恩拉霉素高产菌株 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验菌株 |
| 2.1.2 主要实验仪器 |
| 2.1.3 主要实验试剂 |
| 2.1.4 培养基 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 菌株培养及保存 |
| 2.2.2 重离子辐照处理 |
| 2.2.3 菌株存活测定 |
| 2.2.4 恩拉霉素高产菌株的筛选 |
| 2.2.5 遗传稳定性实验 |
| 2.2.6 扫描电镜观察孢子形态 |
| 2.2.7 发酵参数的比较 |
| 2.2.8 随机扩增多态性(RAPD)分析 |
| 2.2.9 分析方法 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 重离子束辐照SG-01的致死率曲线 |
| 2.3.2 恩拉霉素高产菌株的筛选 |
| 2.3.3 恩拉霉素高产菌株遗传稳定性研究 |
| 2.3.4 突变菌株生理形态变化 |
| 2.3.5 原始菌株和突变菌株发酵参数比较 |
| 2.3.6 重离子束诱变对恩拉霉素产生菌基因多态性的影响 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 恩拉霉素高产突变菌M30的发酵优化 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验菌株 |
| 3.1.2 主要实验仪器 |
| 3.1.3 主要实验试剂 |
| 3.1.4 培养基 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 菌株培养 |
| 3.2.2 恩拉霉素发酵单因素优化实验 |
| 3.2.3 分析方法 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 葡萄糖浓度对恩拉霉素发酵的影响 |
| 3.3.2 可溶性淀粉浓度对恩拉霉素发酵的影响 |
| 3.3.3 玉米浆浓度对恩拉霉素发酵的影响 |
| 3.3.4 不同浓度KH2PO4对恩拉霉素发酵的影响 |
| 3.3.5 不同浓度精氨酸对恩拉霉素发酵的影响 |
| 3.3.6 接种量对恩拉霉素发酵的影响 |
| 3.3.7 初始pH值对恩拉霉素发酵的影响 |
| 3.3.8 摇床转速对恩拉霉素发酵的影响 |
| 3.3.9 S.fungicidicus M30 摇瓶发酵验证 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 甜高粱汁发酵生产恩拉霉素 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验菌株 |
| 4.1.2 主要实验仪器 |
| 4.1.3 主要实验试剂 |
| 4.1.4 培养基 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 菌株培养 |
| 4.2.2 甜高粱汁的来源和除杂处理 |
| 4.2.3 不同浓度除杂甜高粱汁对M30发酵的影响 |
| 4.2.4 除杂甜高粱汁分批补料发酵生产恩拉霉素 |
| 4.2.5 尼泊金甲酯对M30发酵的影响 |
| 4.2.6 分析方法 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 比较葡萄糖和未除杂甜高粱汁对M30发酵的影响 |
| 4.3.2 甜高粱汁中的杂质对M30发酵的影响 |
| 4.3.3 未除杂和除杂甜高粱汁主要成分差异 |
| 4.3.4 不同浓度的除杂甜高粱汁对M30发酵的影响 |
| 4.3.5 除杂甜高粱汁分批补料发酵生产恩拉霉素 |
| 4.3.6 尼泊金甲酯对M30发酵的影响 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 外源添加维生素C对恩拉霉素发酵过程的调控 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验菌株 |
| 5.1.2 主要实验仪器 |
| 5.1.3 主要实验试剂 |
| 5.1.4 培养基 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 菌株培养 |
| 5.2.2 添加维生素C对M30发酵的影响 |
| 5.2.3 抗氧化酶类活性测定 |
| 5.2.4 总抗氧化能力测定 |
| 5.2.5 丙二醛测定 |
| 5.2.6 分批补料发酵实验 |
| 5.2.7 分析方法 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 维生素C对M30生长和恩拉霉素合成的影响 |
| 5.3.2 维生素C对M30抗氧化胁迫能力的影响 |
| 5.3.3 维生素C对细胞膜氧化损伤的影响 |
| 5.3.4 添加维生素C对分批补料发酵的影响 |
| 5.4 本章小结 |
| 第6章 恩拉霉素高产菌株全基因组变异研究 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 实验菌株 |
| 6.1.2 培养基 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 样品收集和制备 |
| 6.2.2 三代全基因组测序与组装 |
| 6.2.3 全基因组重测序及信息分析 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 样品DNA提取与检测 |
| 6.3.2 三代全基因组测序结果 |
| 6.3.3 变异检测与分析 |
| 6.3.4 恩拉霉素合成相关基因变异分析 |
| 6.4 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 结论 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（6）基于核糖体工程技术的ε-聚赖氨酸高产菌株选育及高产机制解析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 ε-聚赖氨酸的研究进展 |
| 1.1.1 ε-聚赖氨酸的概述 |
| 1.1.2 ε-聚赖氨酸产生菌的筛选 |
| 1.1.3 ε-聚赖氨酸高产菌的选育 |
| 1.1.4 ε-聚赖氨酸的合成机制 |
| 1.2 工业微生物育种方法研究现状 |
| 1.2.1 传统诱变育种 |
| 1.2.2 复合诱变育种 |
| 1.2.3 原生质体融合育种 |
| 1.2.4 基因组重排育种 |
| 1.2.5 核糖体工程育种 |
| 1.3 本论文主要研究内容 |
| 1.3.1 立题依据和研究意义 |
| 1.3.2 本论文的主要研究内容 |
| 第二章 小白链霉菌高通量筛选平台技术的建立 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 菌株 |
| 2.2.2 试剂和仪器 |
| 2.2.3 培养基 |
| 2.2.4 微孔板培养 |
| 2.2.5 摇瓶培养 |
| 2.2.6 显微镜观察菌球形态 |
| 2.2.7 分析方法 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 深孔板装液量对ε-PL发酵的影响 |
| 2.3.2 深孔板和摇瓶培养对菌体生长和ε-PL产量的影响 |
| 2.3.3 24孔板与摇瓶发酵的ε-PL产量相关性分析 |
| 2.3.4 分光光度计和酶标仪测定摇瓶发酵ε-PL产量相关性分析 |
| 2.3.5 高通量筛选平台建立 |
| 2.3.6 高通量方法和传统方法比较 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 基于核糖体工程技术选育ε-PL高产菌株 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 菌株 |
| 3.2.2 试剂和仪器 |
| 3.2.3 培养基和相关溶液 |
| 3.2.4 培养条件 |
| 3.2.5 核糖体工程筛选ε-PL高产菌株 |
| 3.2.6 基因组重排筛选ε-PL高产菌株 |
| 3.2.7 分析方法 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 核糖体工程选育ε-PL高产菌株 |
| 3.3.2 基因组重排选育ε-PL高产菌株 |
| 3.3.3 ε-PL高产菌株选育策略 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 生理水平解析ε-PL高产菌高产机制 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 菌株 |
| 4.2.2 试剂和仪器 |
| 4.2.3 培养基及培养条件 |
| 4.2.4 显微镜观察菌球形态 |
| 4.2.5 扫描电镜观察孢子和基内菌丝形态 |
| 4.2.6 rps L和rsm G基因突变位点分析 |
| 4.2.7 酶活检测 |
| 4.2.8 胞内ATP测定 |
| 4.2.9 代谢模型与参数估计 |
| 4.2.10 分析方法 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 Str抗性高产突变株与出发菌株M-Z18在形态上的差异 |
| 4.3.2 Str抗性高产突变株与出发菌株M-Z18 Str抗性能力的差异 |
| 4.3.3 Str抗性高产突变株与出发菌株M-Z18的突变位点分析 |
| 4.3.4 Str抗性高产突变株与出发菌株M-Z18发酵性能的差异 |
| 4.3.5 Str抗性高产突变株与出发菌株M-Z18关键酶活性分析 |
| 4.3.6 Str抗性高产突变株与出发菌株M-Z18 胞内ATP测定 |
| 4.3.7 Str抗性高产突变株与出发菌株M-Z18代谢流分析 |
| 4.3.8 S.albulus SS-62?-PL高产机制生理水平的初步解析 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 蛋白水平解析ε-PL高产菌高产机制 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 菌株和质粒 |
| 5.2.2 试剂和仪器 |
| 5.2.3 培养基及培养条件 |
| 5.2.4 iTRAQ相对定量蛋白质组学 |
| 5.2.5 分子生物学操作 |
| 5.2.6 反转录实时定量PCR(q RT-PCR) |
| 5.2.7 分析方法 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 iTRAQ相对定量蛋白质组学结果 |
| 5.3.2 突变株SS-62与M-Z18 GO和 KEGG分析 |
| 5.3.3 突变株SS-62与M-Z18折叠、复制与修复差异蛋白分析 |
| 5.3.4 突变株SS-62与M-Z18转录调控差异蛋白分析 |
| 5.3.5 突变株SS-62与M-Z18翻译及相关差异蛋白分析 |
| 5.3.6 突变株SS-62与M-Z18碳水化合物代谢差异蛋白分析 |
| 5.3.7 突变株SS-62与M-Z18氨基酸代谢差异蛋白分析 |
| 5.3.8 突变株SS-62与M-Z18能量代谢差异蛋白代谢分析 |
| 5.3.9 突变株SS-62与M-Z18差异蛋白的转录分析 |
| 5.3.10 在S.albulus M-Z18 中过量表达关键差异蛋白验证ε-PL产量 |
| 5.3.11 S.albulus SS-62?-PL高产机制蛋白水平的初步解析 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 基因组水平解析ε-PL高产菌高产机制 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 菌株 |
| 6.2.2 试剂和仪器 |
| 6.2.3 培养基 |
| 6.2.4 培养条件 |
| 6.2.5 基因组的提取 |
| 6.2.6 全基因组测序与组装 |
| 6.2.7 生物信息分析流程 |
| 6.2.8 基因组注释 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 基因组基本信息及基因预测和功能注释 |
| 6.3.2 基因组与质粒圈图 |
| 6.3.3 基因组比较分析 |
| 6.3.4 基因组InDel(插入缺失)基因分析 |
| 6.3.5 S.albulus SG-86?-PL合成代谢途径及基因的缺失 |
| 6.3.6 S.albulus SG-86?-PL高产机制基因水平的初步解析 |
| 6.4 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录:附图 |
| 附录:附表 |
| 附录:作者在攻读博士学位期间发表的论文 |
（7）去甲基金霉素高产菌株的筛选及其发酵工艺优化（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 去甲基金霉素概述 |
| 1.1.1 去甲基金霉素分子结构 |
| 1.1.2 去甲基金霉素的抑菌机理 |
| 1.1.3 去甲基金霉素的应用 |
| 1.2 去甲基金霉素的合成路径 |
| 1.2.1 丙二酰辅酶A的合成过程 |
| 1.2.2 丙二酸半酰胺辅酶A合成过程 |
| 1.2.3 去甲基金霉素总的合成途径 |
| 1.3 去甲基金霉素的合成代谢调控 |
| 1.3.1 金色链霉菌的初级和次级代谢 |
| 1.3.2 不同代谢路径对去曱基金霉素合成产生的影响 |
| 1.3.3 脂肪酸合成对去甲基金霉素合成的影响 |
| 1.3.4 碳源对去甲基金霉素合成的影响 |
| 1.3.5 氮源对去甲基金霉素合成的影响 |
| 1.3.6 磷酸盐对去甲基金霉素合成的影响 |
| 1.3.7 金属离子对去甲基金霉素合成的影响 |
| 1.3.8 前体物质对去甲基金霉素合成的影响 |
| 1.3.9 硫氰酸苄酯对去甲基金霉素合成的影响 |
| 1.3.10 pH对去甲基金霉素合成的影响 |
| 1.3.11 其他因素对去甲基金霉素合成的影响 |
| 1.4 去甲基金霉素发酵过程中的关键酶系 |
| 1.4.1 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 |
| 1.4.2 磷酸果糖激酶 |
| 1.4.3 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 |
| 1.4.4 辅酶A羧基转移酶 |
| 1.4.5 四环素脱水氧化酶 |
| 1.4.6 四环素脱氢氧化酶 |
| 1.5 去甲基金霉素高产菌株的诱变和选育 |
| 1.5.1 去甲基金霉素高产菌株的诱变 |
| 1.5.2 去甲基金霉素高产菌株的筛选 |
| 1.6 相关学科的国内外研究情况 |
| 1.6.1 国内研究情况 |
| 1.6.2 国外研究情况 |
| 1.7 本文研究的主要内容、目的和意义 |
| 第二章 实验材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌种 |
| 2.1.2 主要原材料及试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.2 培养方法 |
| 2.2.1 培养基配方 |
| 2.2.2 培养条件 |
| 2.3 分析方法 |
| 2.3.1 菌丝浓度的测定(PMV法) |
| 2.3.2 总糖和还原糖的测定(斐林试剂法) |
| 2.3.3 氨基氮的测定(甲醛法) |
| 2.3.4 去甲基金霉素效价的测定 |
| 第三章 菌种的诱变选育 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.3 诱变处理和筛选方案设计 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 EMS诱变的结果 |
| 3.4.2 氯化锂结合紫外复合诱变的结果 |
| 3.4.3 ARTP诱变的结果 |
| 3.4.4 去甲基金霉素抗性菌株的定向筛选 |
| 3.4.5 丙二酸钠抗性菌株的定向筛选 |
| 3.4.6 EMS诱变叠加丙二酸钠定向筛选 |
| 3.4.7 氯化锂紫外复合诱变叠加丙二酸钠定向筛选 |
| 3.4.8 ARTP诱变叠加丙二酸钠定向筛选 |
| 3.4.9 高产菌株的稳定性考察 |
| 3.4.10 高产菌株产物组分的考察 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 种子质量对发酵的影响 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 斜面种子保存时间的确认 |
| 4.3.2 发酵级数对发酵的影响 |
| 4.3.3 种子罐接种方式对发酵的影响 |
| 4.3.4 种子罐接种量对发酵的影响 |
| 4.3.5 种子罐种龄对发酵的影响 |
| 4.3.6 发酵罐移种比例对发酵的影响 |
| 4.3.7 去甲基金霉素的生长曲线 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 发酵基础培养基的优化研究 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 不同有机氮源对去甲基金霉素发酵的影响 |
| 5.3.2 黄豆饼粉浓度对去甲基金霉素发酵的影响 |
| 5.3.3 黄豆饼粉颗粒度对去甲基金霉素发酵的影响 |
| 5.3.4 淀粉浓度对去甲基金霉素发酵的影响 |
| 5.3.5 还原糖浓度对去甲基金霉素发酵的影响 |
| 5.3.6 磷酸盐浓度对去甲基金霉素发酵的影响 |
| 5.3.7 碳酸钙浓度对去甲基金霉素发酵的影响 |
| 5.3.8 硫氰酸苄酯浓度对去甲基金霉素发酵的影响 |
| 5.3.9 采用优化配方后去甲基金霉素的发酵情况 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 补料工艺的优化研究 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料和方法 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 发酵过程中补糖方式的选择 |
| 6.3.2 发酵过程中不同总糖浓度对发酵的影响 |
| 6.3.3 不同浓度的淀粉水解液对发酵的影响 |
| 6.3.4 发酵过程中不同pH对发酵的影响 |
| 6.3.5 发酵过程中不同消泡剂对发酵的影响 |
| 6.3.6 30 m~3发酵罐流加补料的发酵情况 |
| 6.4 本章小结 |
| 第七章 搅拌对去甲基金霉素发酵的影响 |
| 7.1 前言 |
| 7.2 材料和方法 |
| 7.3 结果与分析 |
| 7.3.1 搅拌转速对去甲基金霉素种子液的影响 |
| 7.3.2 搅拌器形式对去甲基金霉素发酵的影响 |
| 7.3.3 搅拌转速对去甲基金霉素发酵的影响 |
| 7.4 本章小结 |
| 第八章 总结与展望 |
| 8.1 总结 |
| 8.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 去甲基金霉素菌株鉴定 |
| 作者简历 |
（8）复合育种策略选育喷司他丁高产菌株（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 放线菌 |
| 1.2 喷司他丁 |
| 1.2.1 喷司他丁的概述 |
| 1.2.2 喷司他丁的研究进展 |
| 1.3 放线菌次级代谢途径特异性调控机制的研究进展 |
| 1.4 常压室温等离子诱变(ARTP) |
| 1.4.1 常压室温等离子诱变(ARTP)机理 |
| 1.4.2 常压室温等离子诱变(ARTP)研究进展 |
| 1.5 核糖体工程 |
| 1.5.1 核糖体工程概述 |
| 1.5.2 核糖体工程的应用 |
| 1.6 本论文研究的目的及意义 |
| 1.7 本实验主要研究内容 |
| 第二章 实验材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌种 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 培养基 |
| 2.1.5 质粒与引物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 菌种培养 |
| 2.2.2 单孢子悬液制备 |
| 2.2.3 基因敲除工程菌株的构建 |
| 2.2.4 过表达工程菌株的构建 |
| 2.2.5 ARTP选育PNT高产菌株 |
| 2.2.6 最小抑菌浓度(MIC)的测定 |
| 2.2.7 核糖体工程选育PNT高产菌株 |
| 2.2.8 分析方法 |
| 第三章 结果和分析 |
| 3.1 构建基因敲除和过表达工程菌株 |
| 3.1.1 生物反应途径中Ada E和 Ada J基因的敲除 |
| 3.1.2 生物反应途径中Ada A、Ada C和 AdaL基因的过表达 |
| 3.1.3 结果验证及发酵液的检测分析 |
| 3.2 常压室温等离子诱变(ARTP)选育PNT高产菌株 |
| 3.2.1 ARTP最佳诱变条件 |
| 3.2.2 致死率曲线 |
| 3.2.3 ARTP诱变结果分析 |
| 3.3 核糖体工程选育PNT高产菌株 |
| 3.3.1 抗生素最小抑菌浓度(MIC) |
| 3.3.2 核糖体工程选育单抗性突变株 |
| 3.3.3 核糖体工程选育双重抗性突变株 |
| 3.3.4 突变位点分析 |
| 第四章 主要结论与展望 |
| 4.1 主要结论 |
| 4.2 展望 |
| 4.3 本论文的创新之处 |
| 4.4 本论文的不足和今后进一步工作的建议 |
| 参考文献 |
| 发表论文、参加科研情况说明 |
| 致谢 |
（9）ε-聚赖氨酸产生菌的育种、发酵及高产机制的初步生理解析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 ε-聚赖氨酸的研究进展 |
| 1.1.1 ε-聚赖氨酸的理化性质 |
| 1.1.2 ε-聚赖氨酸的抑菌机制 |
| 1.1.3 ε-聚赖氨酸的应用 |
| 1.1.4 ε-聚赖氨酸产生菌的筛选 |
| 1.1.5 ε-聚赖氨酸高产菌育种 |
| 1.1.6 ε-聚赖氨酸发酵生产 |
| 1.1.7 ε-聚赖氨酸聚合度的控制 |
| 1.1.8 ε-聚赖氨酸合成机制 |
| 1.2 核糖体工程育种 |
| 1.2.1 核糖体工程概述 |
| 1.2.2 链霉素抗性突变 |
| 1.2.3 庆大霉素抗性突变 |
| 1.2.4 利福霉素抗性突变 |
| 1.2.5 其它抗生素抗性突变 |
| 1.3 本论文的研究内容 |
| 1.3.1 立题依据及研究意义 |
| 1.3.2 本论文主要研究内容 |
| 第二章 复合诱变选育链霉素抗性ε-PL高产菌 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 微生物菌种 |
| 2.2.2 培养基 |
| 2.2.3 诱变剂量的确定 |
| 2.2.4 抗生素最小抑菌浓度(MIC)的确定 |
| 2.2.5 小白链霉菌复合诱变筛选流程 |
| 2.2.6 摇瓶发酵 |
| 2.2.7 限制性片段长度多态性分析 |
| 2.2.8 分析方法 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 UV诱变剂量 |
| 2.3.2 EMS诱变剂量 |
| 2.3.3 ARTP诱变剂量 |
| 2.3.4 三种方法的诱变效果评估 |
| 2.3.5 不同抗生素抗性对菌株产量的影响 |
| 2.3.6 “ARTP+EMS”复合诱变选育链霉素抗性ε-PL高产菌株 |
| 2.3.7 高产菌株的形态特征 |
| 2.3.8 “复合诱变+Strr”育种对链霉菌基因多态性的影响 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 基因组重排与核糖体工程选育多重抗性ε-PL产生菌 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 微生物菌种 |
| 3.2.2 培养基、培养条件和相关溶液的配制 |
| 3.2.3 摇瓶发酵 |
| 3.2.4 链霉素、庆大霉素、利福霉素MIC的测定 |
| 3.2.5 ARTP诱变制备庆大霉素抗性（Genr）突变菌株库 |
| 3.2.6 “基因组重排+庆大霉素抗性(Genr)”选育双重抗性ε-PL高产菌 |
| 3.2.7 核糖体工程选育三重抗性ε-PL高产菌株 |
| 3.2.8 限制性片段长度多态性分析 |
| 3.2.9 分析方法 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 ARTP诱变筛选Genr突变株 |
| 3.3.2 基因组重排结合核糖体工程选育双抗ε-PL高产菌 |
| 3.3.3 核糖体工程构建三抗ε-PL高产菌 |
| 3.3.4 GSGR-1菌株稳定性 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 突变菌高产ε-PL的生理生化机制初探 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 微生物菌种 |
| 4.2.2 培养基 |
| 4.2.3 培养条件 |
| 4.2.4 ε-PL聚合度 |
| 4.2.5 扫描电镜观察孢子和胞内菌丝形态 |
| 4.2.6 突变位点的分析 |
| 4.2.7 酶活测定 |
| 4.2.8 RT-PCR比较四株菌关键酶活转录水平差异 |
| 4.2.9 细胞活力染色和CTC染色 |
| 4.2.10 分析方法 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 突变株生理形态、培养特征的变化 |
| 4.3.2 ε-PL摇瓶产量和抗性突变位点的差异 |
| 4.3.3 ε-PL聚合度 |
| 4.3.4 G67与GSGR-1菌丝活力的差异 |
| 4.3.5 恒定pH和酸性pH冲击策略下补料-分批发酵过程差异 |
| 4.3.6 抗性突变株关键酶活性的变化 |
| 4.3.7 突变株的转录水平差异 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 S.albulusM-Z18与Streptomycessp.GSG-1全基因组序列分析及ε-PL合成代谢途径对比 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 菌株 |
| 5.2.2 培养基 |
| 5.2.3 培养条件 |
| 5.2.4 链霉菌全基因组样品制备 |
| 5.2.5 全基因组测序流程 |
| 5.2.6 生物信息分析流程 |
| 5.2.7 基因预测和功能注释 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 M-Z18和GSG-1大片段DNA的提取 |
| 5.3.2 全基因组测序结果 |
| 5.3.3 基因预测和功能注释 |
| 5.3.4 Strr与Genr对GSG-1核糖体蛋白的影响 |
| 5.3.5 基于?-PL合成代谢图谱的高产机制阐述 |
| 5.3.6 GSG-1的高产机制的补充验证 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 PS-PAD策略促进突变株GSGR-1大量合成ε-PL |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 微生物菌种 |
| 6.2.2 培养基 |
| 6.2.3 培养条件 |
| 6.2.4 细胞活力染色和CTC染色 |
| 6.2.5 平均比合成速率计算 |
| 6.2.6 胞内代谢物质分析 |
| 6.2.7 酶活测定 |
| 6.2.8 分析方法 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 GSGR-1发酵生产ε-PL的最适pH值探究 |
| 6.3.2 pH调控溶氧工艺(pHasistedDOcontrolstrategy,PAD)的建立 |
| 6.3.3 建立适配GSGR-1的酸性pH冲击策略 |
| 6.3.4 PS-PAD补料-分批发酵策略的构建 |
| 6.3.5 PS-PAD策略对GSGR-1发酵水平的影响 |
| 6.3.6 PS-PAD策略对ε-PL合成代谢途径的调控 |
| 6.3.7 PS-PAD策略对细胞呼吸活力的影响 |
| 6.3.8 PS-PAD策略对胞内ATP的影响 |
| 6.3.9 PS-PAD策略对呼吸链活力动态的影响 |
| 6.3.10 G67,GSG-1,GSGR-1在PS-PAD策略下的补料-分批发酵水平 |
| 6.4 小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 论文创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录：附表 |
| 附录：附图 |
| 附录：作者在攻读博士学位期间发表的论文 |
| 附录：本课题项目支持 |
（10）阿卡波糖高产机制解析及菌株改造（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 阿卡波糖的研究现状 |
| 1.1.1 阿卡波糖的生物合成研究进展 |
| 1.1.2 阿卡波糖高产菌株选育及发酵工程研究进展 |
| 1.1.3 阿卡波糖产生菌遗传操作体系研究进展 |
| 1.1.4 阿卡波糖产生菌的组学研究进展 |
| 1.2 比较基因组学研究进展 |
| 1.2.1 红霉素产生菌比较基因组学研究进展 |
| 1.2.2 普那霉素产生菌比较基因组学研究进展 |
| 1.2.3 利福霉素产生菌比较基因组学研究进展 |
| 1.2.4 盐霉素产生菌比较基因组学研究进展 |
| 1.3 ABC转运蛋白的研究现状 |
| 1.3.1 阿维菌素产生菌ABC转运蛋白加强表达研究进展 |
| 1.3.2 普那米星产生菌ABC转运蛋白加强表达研究进展 |
| 1.4 研究内容和目的 |
| 1.4.1 研究内容 |
| 1.4.2 研究目的 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 研究中所用菌株 |
| 2.2 研究中所用质粒 |
| 2.3 研究中所用引物 |
| 2.4 研究中所用培养基 |
| 2.5 研究中所用试剂 |
| 2.6 实验方法 |
| 2.6.1 基因组差异位点验证 |
| 2.6.2 阿卡波糖产生菌基因缺失方法 |
| 2.6.3 游动放线菌的培养和发酵 |
| 2.6.4 阿卡波糖产量分析检测方法 |
| 2.6.5 菌体干重测定 |
| 2.6.6 菌种保存方法 |
| 2.6.7 转录水平测定 |
| 2.6.8 乙酰辅酶A、磷酸烯醇式丙酮酸测定方法 |
| 2.6.9 ppGpp测定方法 |
| 2.6.10 2-表-5-表-有效醇酮测定方法 |
| 第三章 基于比较功能基因组学的阿卡波糖高产机制解析 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 结果与讨论 |
| 3.2.1 高产菌株SE50/110 与野生型菌株SE50 表型差异 |
| 3.2.2 野生型菌株Actinoplanes sp.SE50 全基因组测序和基本特征 |
| 3.2.3 Actinoplanes sp.SE50与SE50/110 基因组比较 |
| 3.2.4 突变基因对阿卡波糖产量影响功能验证 |
| 3.2.5 基因ACWT_4325 缺失提高阿卡波糖产量和菌株生物量 |
| 3.2.6 基因ACWT_7629 缺失提高阿卡波糖产量和合成基因簇转录水平 |
| 3.2.7 组合缺失模拟还原高产机制 |
| 3.2.8 基于高产机制的阿卡波糖产生菌高产改造 |
| 3.3 小结 |
| 第四章 麦芽糖及转运蛋白对游动放线菌生产阿卡波糖的影响 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 结果与讨论 |
| 4.2.1 麦芽糖浓度对游动放线菌生长和阿卡波糖产量的影响 |
| 4.2.2 acbW缺失对SE50/110 生长和阿卡波糖产量的影响 |
| 4.2.3 加强表达acbW对游动放线菌生长和阿卡波糖产量的影响 |
| 4.2.4 acbWXY联合加强表达对阿卡波糖产量的影响 |
| 4.3 小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 研究创新点 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间已发表或录用的论文 |
四、利福霉素产生菌诱变育种研究（论文参考文献）
- [1]天蓝色链霉菌产达托霉素的发酵培养基优化及高产菌株选育[D]. 张昊月. 河北大学, 2021(09)
- [2]等离子体作用结合氧限制模型选育利福霉素SV高产菌株[J]. 栗波,王泽建,梁剑光,刘爱军,李海东. 中国生物工程杂志, 2021(Z1)
- [3]基于ARTP诱变的安丝菌素P-3高产菌株高通量筛选体系的构建[D]. 栾书慧. 上海交通大学, 2020(01)
- [4]米尔贝霉素单组分高产菌株选育及发酵放大研究[D]. 周丽. 浙江大学, 2020(03)
- [5]重离子束辐照恩拉霉素菌株的选育研究[D]. 刘璐. 中国科学院大学(中国科学院近代物理研究所), 2020(01)
- [6]基于核糖体工程技术的ε-聚赖氨酸高产菌株选育及高产机制解析[D]. 刘永娟. 江南大学, 2020(01)
- [7]去甲基金霉素高产菌株的筛选及其发酵工艺优化[D]. 沈政. 浙江大学, 2019(03)
- [8]复合育种策略选育喷司他丁高产菌株[D]. 周秋玲. 天津商业大学, 2019(07)
- [9]ε-聚赖氨酸产生菌的育种、发酵及高产机制的初步生理解析[D]. 王靓. 江南大学, 2018(04)
- [10]阿卡波糖高产机制解析及菌株改造[D]. 解慧欣. 上海交通大学, 2018(01)