一、两种反转录聚合酶链反应检测甲型肝炎病毒（论文文献综述）
孙悦[1]（2021）在《四种病毒组学方法的比较及在旱獭肠道样品中的应用》文中认为病毒作为微生物的重要组成部分,不仅能够引起宿主多种类型的感染,同时对人类和动物机体的内稳态、生理健康发挥着至关重要的作用。近年来多种新发传染病都是由动物源性的新型病毒引起,加之各种危害人类健康的自然疫源性疾病的频繁出现,发现新病毒以及持续监测和掌握自然宿主携带的病毒本底极其重要。病毒宏基因组学（Viral metagenomics,VM）是宏基因组学在病毒领域的应用,是病毒发现、追踪和溯源的有力工具。合适的病毒宏基因组学技术和方案能够有效提高病毒组研究的效率和准确性。目前国际上针对不同目的的病毒宏基因组分析建立了多种病毒组学研究策略,但它们在检测各种病毒及其丰度上的性能还未得到系统的比较与评价。本研究以五种已知病毒为测试对象,构建了含有不同滴度和不同核酸类型的病毒组人工模拟样品,系统评价和比较了四种病毒组学方法——宏转录组法（Meta-transcriptome,MTT）、宏基因组法（Metagenomic,MTG）、单引物扩增法（Sequence-independent amplification,SIA）和多重置换扩增法（Multiple displacement amplification,MDA）的特异性、灵敏性和全基因组覆盖能力;探究病毒载量、测序深度与reads数量和覆盖度的对应关系。在此基础上应用这四种方法对新疆喀什地区喜马拉雅旱獭肠道样品进行了病毒宏基因组分析,以此检验对四种方法的评价效果,为今后应用病毒组学技术提供数据支撑及可选方案,同时根据病毒组结果,还对具有潜在意义的病毒进行检测以及遗传演化分析。结果表明,对已知载量的病毒组模拟样品进行测序时,MTT法的灵敏度最高,且MTT法和MDA法在灵敏度及覆盖度方面要优于SIA法和MTG法。MTT法对RNA病毒特异性及覆盖度均较高;SIA法则对RNA、DNA病毒均有捕获能力,但相较于MTT和MDA法reads检出率较低;MTG和MDA法对DNA病毒特异性强,MDA对环状DNA病毒有较强的覆盖度和检出率;随后通过应用这四种病毒组学方法对31只旱獭肠道样品进行病毒组学分析,结果发现30个科的病毒,其中12个为脊椎动物病毒科,6个为植物病毒科,昆虫病毒科和噬菌体分别有1个和12个。四种方法测试临床样品得到的结果与模拟样品的结果一致。根据病毒组结果,挑选7种病毒进行检测,发现旱獭肠道样品阳性率最高的为博卡细小病毒（93.5%）,其次是圆环病毒（71%）。重点对具有潜在意义的星状病毒、甲型肝炎病毒、腺病毒、博卡细小病毒进行遗传进化分析,发现星状病毒、腺病毒都与已知病毒具有明显的遗传差异性,为病毒新种;而甲型肝炎病毒、博卡细小病毒与参考毒株差异较小。综上所述,在进行全病毒组研究时,可以单独采用SIA法,或者MTT结合MDA法,后者虽然增加了研究成本,但具有更高的灵敏度。无论哪种方法,病毒的载量与测序reads数量以及覆盖度均呈正相关,说明reads数量能反映病毒群落组分的丰度,此外,加大测序深度也能够有效提高病毒reads的检出能力及覆盖度。同时应用四种病毒组学方法对旱獭肠道进行了较为全面细致的病毒组分析验证了四种病毒组学方法的应用场景,对部分病毒的流行率和遗传进化分析,揭示了新疆地区旱獭携带病毒的流行本底,丰富了对该动物携带病毒多样性的认识。
李茂仕[2]（2021）在《血清HBV RNA在慢性HBV感染者病情评估和耐药监测中的应用》文中研究表明背景及目的:慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染是全球性的公共卫生问题,肝细胞内的共价闭合环状DNA（ccc DNA）是HBV难以彻底清除进而引起不同临床结局的根本原因,但因检测需依赖肝活检而难以临床普及;虽然外周血中无法直接检测ccc DNA,但可通过其他血清指标来反映ccc DNA的变化。目前,核苷（酸）类似物（NAs）是主要的抗HBV治疗手段,但并不能直接清除ccc DNA,绝大部分的慢性HBV感染者均需长期用药。尽管高耐药屏障NAs使用后发生耐药的几率较前大为减少,但因HBV突变的必然性和复杂性,耐药株的出现实际上是NAs长期治疗不可避免的临床问题。不同于乙型肝炎表面抗原（HBs Ag）和HBV DNA,HBV RNA仅由ccc DNA转录产生且不受NAs治疗的影响,可较为真实反映肝内ccc DNA的表达情况。然而,HBV RNA检测尚无公认的标准化检测方法,其在慢性HBV感染者病情评估以及在NAs治疗耐药监测中的临床价值尚缺乏针对性研究。我们首先使用微滴数字PCR（dd PCR）技术建立了定量检测血清HBV RNA的方法,并使用商业化的实时荧光定量PCR方法进行对比评估以确保检测结果的准确性。然后我们观察了未治的慢性HBV感染者不同临床表型的血清HBV RNA水平,并追踪分析了恩替卡韦初治但在随访过程中发生了基因型耐药（GR）和部分病毒学应答（PVR）患者血清HBV RNA的动力学特征以及耐药突变情况,以期为血清HBV RNA应用于慢性HBV感染者病情评估以及监测耐药突变提供新的依据。方法:1.获取治疗和未治疗的慢性HBV感染者的血清各32例,平行使用dd PCR和商品化的q PCR方法检测血清HBV RNA水平,使用直线回归分析和Bland-Altman分析两种方法的相关性和一致性;以1例高浓度的HBV RNA样本进行梯度稀释,两种检测方法平行进行测定,每个梯度重复5次以明确两种方法的重复性,敏感性。2.根据常见临床指标将149例未治的慢性HBV感染者分为HBe Ag阳性伴ALT正常（EPNA）、HBe Ag阳性伴ALT升高（EPEA）、HBe Ag阴性伴ALT正常（ENNA）、HBe Ag阳性伴ALT升高（ENEA）等4种临床表型。使用q PCR法检测血清HBV RNA水平并在血清HBV DNA或/和HBV RNA阴性的患者中实施肝活检。使用单因素logistics回归分析探讨HBe Ag阴性患者中与ALT升高相关的危险因素。3.以31例HBe Ag阴性、HBV DNA阳性、ALT正常或者轻度异常（<2倍正常参考值上限,ULN）的未治慢性HBV感染者为研究对象,检测其血清HBV RNA水平,肝活检Scheuer评分系统对肝脏炎症评分（G）≥2判定为显着性肝炎,以受试者工作曲线（ROC）探讨血清HBV RNA水平在鉴别显着性肝炎中的价值。4.在我院肝炎数据库中筛选出5例ETV初治的慢性乙型肝炎（CHB）患者,其中包含了在持续抗病毒治疗过程中被检出GR的患者3例以及未检出耐药的PVR患者2例。耐药突变的信息是采用一代测序针对血清HBV DNA检测得到。调取生物样本库中该患者从初治到随访终点之间的血清样本,以dd PCR方法检测血清HBV RNA水平,观察其与HBs Ag、HBV DNA动态变化的特征,并使用三代测序技术（TGS）对部分随访点的血清HBV RNA的反转录区进行耐药突变的长期监测。结果1.两种血清HBV RNA检测方法在未治疗组和治疗组中的直线回归系数（R2）分别为0.912和0.874,95%一致性界限分别为（-1.430,1.506）和（-1.533,1.648）。梯度稀释实验显示dd PCR法和商品化的q PCR法在血清HBV RNA≥2.0 log10 copies/m L时检出率均为100%,CV值分别介于2.29%～10.8%和3.11%～7.33%;但在血清HBV RNA<2.0 log10 copies/m L时,随着梯度稀释倍数的增加,检出率逐渐下降,最低检测下限（LLo D）分别约为61 copies/m L和15 copies/m L。dd PCR法和商品化的q PCR法在HBV RNA可测结果和稀释倍数之间存在显着性线性相关,R2分别为0.895和0.938,P<0.0001。2.EPNA、EPEA、ENNA和ENEA四种临床表型的可测血清HBV RNA水平(log10copies/m L)分别为6.02±1.48、6.54±1.27、2.51±0.78和3.54±1.25。HBV RNA低水平(<2.0 log10 copies/m L)中以ENNA表型为主（76.9%）,高水平(>6.0 log10 copies/m L)中以HBe Ag阳性表型（EPNA和EPEA）为主（98.1%）。在EPNA、EPEA和ENEA中,血清HBV RNA与血清HBV DNA显着正相关,相关系数（r）分别为0.868(P=9.480×10-9)、0.687(P=2.621×10-8)、0.769(P=6.686×10-9),但在ENNA表型中,两者没有显着性相关关系（r=0.324,P=0.075）。在EPNA、EPEA表型中,血清HBV RNA与HBs Ag呈现显着正相关,相关系数分别为0.777(P=2.999×10-6)和0.637(P=4.993×10-7),但在HBe Ag阴性表型中则无此显着相关性。血清HBV DNA和HBV RNA水平均是与HBe Ag阴性患者ALT升高相关的独立危险因素,比值比（OR）分别为2.650（1.640～4.282）,P=6.823×10-5和2.570（1.541～4.286）,P=2.971×10-4。血清HBs Ag水平则处于接近于显着性的状态（P=0.053）。7例血清HBV DNA阴性,但RNA阳性的患者肝组织活检均显示为中度或重度肝脏炎症（G≥2）。3.血清HBV RNA水平具有鉴别HBe Ag阴性、DNA阳性、ALT正常或者轻度异常（<2×ULN）患者显着性肝炎的能力,受试者工作曲线下面积（AUC）为0.737（0.549,0.925）,P=0.029,而HBV DNA则不具有这种能力（P=0.248）。根据最大优登指数得出HBV RNA用于鉴别肝脏显着性炎症的最佳截断值为2.81 log10 copies/m L,此时敏感度73.7%,特异度66.7%,准确度71.0%。4.患者GR1、GR2和GR3分别在其抗病毒治疗第208、186及142周时检测出了耐药突变,在这时间点之前,3例患者血清HBV RNA持续>4.0 log10 copies/m L。2例PVR患者在我们观测的抗病毒治疗期间HBV RNA持续>6.0 log10 copies/m L。患者GR1和GR2在换用或者加用TDF之后,血清HBV RNA水平分别在此之后的26、22周时下降了1.63 log10和2.58 log10,HBV DNA水平则分别从4.40 log10和3.44 log10均降至LLo D,而HBs Ag则几乎没有变化(分别上升0.03log10和下降0.02log10)。3例GR患者和2例PVR患者的血清HBV RNA的RT区耐药位点突变结果与HBV DNA的耐药位点检测结果是一致的。利用三代测序技术对HBV RNA RT区长期监测发现,患者GR1和GR3在耐药发生之前没有观测到常见耐药位点的突变,而GR2患者则从初治开始就具备rt L180M+M204I突变。结论:1.我们使用dd PCR建立的方法和q PCR方法均是可靠的血清HBV RNA定量检测方法,低浓度血清样本的检出是困难的,但可以增加重复检测次数来改善;2.血清HBV RNA在不同临床表型中的水平存在差异,提示血清HBV RNA可以用于未治慢性HBV感染者病情的评估。血清HBV RNA与血清HBV DNA均是未治HBe Ag阴性患者ALT升高的独立危险因素,因此在血清HBV DNA阴性患者中检测HBV RNA是必要的,血清HBV RNA可补充HBV DNA用于反映肝脏炎症;3.在未经治疗的正常或者轻度ALT异常（ALT<2×ULN）的HBe Ag阴性患者中,血清HBV RNA可以用来判定肝脏炎症程度但HBV DNA不具备这样的能力,因此这部分患者可通过血清HBV RNA水平作为启动抗病毒治疗的依据;4.血清HBV RNA水平以及利用HBV RNA测序分析适合用于长期监测慢性乙型肝炎患者NAs抗病毒疗效和基因耐药突变的发生。总之,血清HBV RNA作为一个病毒学指标,可在血清HBV DNA阴性或者ALT<2×ULN的未治HBe Ag阴性患者中用于肝脏炎症的评估;血清HBV RNA也适合用于持续NAs治疗患者抗病毒疗效的评估以及耐药突变的长期监测,进而帮助临床医师为患者制定个体化管理和治疗策略提供参考依据。
卞莲莲,王一平,孙世洋,高帆,吴星,毛群颖,梁争论[3]（2020）在《基于叠氮溴化丙锭-定量反转录-聚合酶链式反应的甲型肝炎疫苗病毒滴度快速检测方法》文中指出目的建立快速检测甲型肝炎减毒活疫苗感染性病毒滴度的叠氮溴化丙锭-定量反转录-聚合酶链式反应（PMA-qRT-PCR）方法。方法比较叠氮溴化丙锭（PMA）浓度、光解时间、孵育温度和时间,以及不同灭活方式、pH值和添加剂预处理对PMA-qRT-PCR法检测的影响;进行线性、平行性、灵敏度、重复性、相关性、特异性和初步适用性研究。结果确定最适反应条件为PMA终浓度50μmol/L,4℃避光孵育30 min,光解30 min,病毒液pH值为1.48～7.43。方法学研究结果显示,该方法特异性良好;线性范围为5.0～8.0 lgCCID50/ml,线性和平行性良好;定量下限为5.0 lgCCID50/ml;重复性变异系数（CV）为2.78%～3.58%;与法定方法检测结果具有显着相关性（相关系数R2=0.698）。初步适用性结果显示,4个实验室使用各自细胞系检测同一样品结果差异无统计学意义（P=0.071～0.997）;不同企业生产的疫苗在不同细胞系上检测适用性良好。结论建立了甲型肝炎减毒活疫苗感染性病毒滴度的PMA-qRT-PCR方法,为冻干甲型肝炎减毒活疫苗的效力评价提供了快速检测方法。
管飘萍[4]（2020）在《2017～2019年山东省部分地区鸭甲肝病毒的分子特征分析和VP1基因的表达》文中研究表明鸭病毒性肝炎（Duck viral hepatitis,DVH）,是由鸭肝炎病毒（Duck hepatitis virus,DHV）引起的雏鸭的一种高度致死,传播迅速的传染病,是危害养鸭业最严重的疫病之一。鸭肝炎病毒可分为3个血清型:血清1型鸭肝炎病毒(（鸭甲肝病毒（Duck hepatitis A virus,DHAV）,DHAV 又分为 DHAV-A、B、C 或（称 DHAV-1、2、3）3 个基因型）、血清2型鸭肝炎病毒（又称为鸭星状病毒1型（Duck astrovirus 1,DAstV-1））、血清3型鸭肝炎病毒（又称为鸭星状病毒2型（Duck astrovirus 2,DAstV-2））。目前我国的鸭病毒性肝炎主要是由DHAV-1和DHAV-3引起的,且常出现两种亚型的混合感染,DHAV-3已代替DHAV-1成为优势血清型,这也许是许多鸭场已经接种了传统DHAV-1疫苗,却仍暴发鸭肝炎的原因之一。目前市面上还未出现针对DHAV-3的商品化疫苗,研发出能针对DHAV-3的诊断和防治的生物制剂具有重要意义。VP1蛋白作为DHAV的主要衣壳蛋白,含有主要保护性抗原位点,能刺激产生特异性保护受体,且VP1基因也是DHAV基因组的高变区,具有最大遗传多样性,决定了不同毒株的分子特征。因此,为进一步了解鸭甲肝病毒的病原学特征,研制出诊断和防治DHAV-3的生物制品,本研究分离鉴定了 8株DHAV-1和14株DHAV-3病毒,对其VP1基因序列进行测定和分析,并以DHAV-3分离株的VP1基因为模板分别进行了真核和原核表达,以纯化的原核表达蛋白为抗原,初步建立了检测DHAV-3抗体的ELISA方法,对真核表达作为DNA疫苗候选生物材料的可能性进行了初步评价。本研究主要分为三部分:1、22株鸭甲肝病毒的分离鉴定及VP1基因的分子特征分析对2017～2019年从山东省采集的27份疑似感染鸭肝炎病毒的病料进行了分离、鉴定,并对分离株的VP1基因进行了序列测定以及遗传变异分析。结果表明,27份疑似病料接种鸡胚进行病毒分离,共分离出了 22株病毒,8株为DHAV-1,14株为DHAV-3。VP1基因序列比对结果显示:8株DHAV-1分离株与15株参考株的核苷酸同源性为91.7%～98.6%,氨基酸同源性为93.7%～97.5%。8株DHAV-1分离株之间的核苷酸同源性为97.2%～1 00%,氨基酸同源性为97.9%～100%;14株DHAV-3分离株与17株参考株的核苷酸同源性为89.4%～98.9%,氨基酸同源性为92.1%～100%。14株DHAV-3分离株之间的核苷酸同源性为93.9%～100%,氨基酸同源性为96.7%～100%,属于Ⅰ型（GI型）。2、鸭甲肝病毒3型VP1基因的真核表达设计了三对引物（其中一对引物含有Kozak序列）分别RT-PCR扩增DHAV-3分离株的VP1基因,插入不同的真核载体,构建出了重组质粒pcDNA3.1-3-VP1,KpcDNA3.1-3-VP1和pCAGGS-3-VP1,并将其转染Vero细胞,表达产物经间接免疫荧光和WB鉴定。结果表明:VP1基因在pcDNA3.1和pCAGGS中均获得表达,表达的重组蛋白大小为27kDa,与预期相符。进一步将重组质粒作为DNA疫苗免疫小鼠,每种质粒免疫5只BALB/c小鼠,并用空载体设置阴性对照,每只100 μg,2周免疫一次,共免疫3次。三免后14天取血清采用间接ELISA方法检测小鼠体内抗体水平,结果显示:小鼠三免后14天能够检测到抗体,而对照组未检测到特异性抗体,表明本实验构建的真核重组质粒能够诱导小鼠产生特异性抗体。3、鸭甲肝病毒3型VP1基因的原核表达以及抗体检测ELISA方法的初步建立RT-PCR扩增DHAV-3分离株的VP1基因,插入原核表达载体,构建了带有His标签的重组质粒PET-32a-3-VP1,并将其转化至大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）中,经IPTG诱导表达,经SDS-PAGE电泳鉴定,出现了 40.8kDa大小的表达产物条带,与预期相符。结果表明:重组质粒PET-32a-3-VP1构建成功,能在大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）中表达。随后利用His-标签蛋白纯化柱对原核表达的VP1重组蛋白进行纯化,将其作为检测抗原,建立ELISA方法,优化了反应条件:最佳抗原包被浓度为4.28μg/mL,最佳血清浓度为1:20,最佳酶标二抗浓度为1:400,最佳包被条件为4℃过夜,最佳封闭时间为90min,最佳酶标二抗时间为90min,最佳显色时间为15min,该方法具有较高的重复性和特异性,这些结果为和DHAV-3抗体的检测奠定了基础。
刘永华[5]（2020）在《辽东湾近海双壳贝类主要生物和重金属污染现状调查及生态风险评价》文中认为辽东湾是渤海三个海湾之一,位于渤海东北部,此海湾盛产扇贝、鲍鱼、对虾、牡蛎等,是辽宁近海重要的海产捕捞区和人工养殖区。辽东湾有多条河流携带大量陆源污染物汇入其中,导致环境污染问题日益突出。同时,特殊的地理地貌导致辽东湾对污染物的自净能力较差,变相加剧了此地的污染。环境污染的加剧导致重要渔业资源种群衰退,对当地生物群落和生态环境造成严重破坏。辽东湾的环境污染物主要是生物（细菌、病毒、寄生虫）、重金属和有机污染物。生物污染可引起人的食物中毒、感染患病及海洋生物患病甚至死亡。重金属和有机污染物均是具有潜在风险的环境污染物,其毒性效应对人类具有严重的健康风险。双壳贝类生活在泥沙滩涂中（如四角蛤蜊、菲律宾蛤仔和毛蚶）,或固着在礁石上（太平洋牡蛎和紫贻贝）,或生活在坚硬海底（虾夷扇贝）,通过沉积取食或过滤取食从沉积物或海水中获取浮游生物与海藻营生,这种取食方式极易富集重金属和微生物。因此,开展辽东湾双壳贝类生物污染和主要重金属污染水平调查及生态风险评价,对辽东湾生态环境及生物多样性保护以及水产品安全标准修订等具有重要的理论和现实意义。从2013-2017年,选择辽东湾近海沿岸的普湾（S1）、鲅鱼圈（S2）、二界沟（S3）、凌河口（S4）、老河口（S5）、葫芦岛（S6）和沙后所（S7）7地作为采样点,每年7-8月,采集双壳贝类（四角蛤蜊、菲律宾蛤仔、毛蚶、太平洋牡蛎、紫贻贝和虾夷扇贝）和表层沉积物,对双壳贝类生物污染和重金属污染现状进行调查并做生态风险评价,主要研究内容如下:1、双壳贝类生物污染调查:在7个采样点采集太平洋牡蛎、虾夷扇贝和紫贻贝,通过PCR检测和生化鉴定的方法检测样品中的细菌、病毒和寄生虫,并进行污染状况分析。2、双壳贝类重金属污染及风险评估:用石墨炉原子吸收分光光度法检测四角蛤蜊、菲律宾蛤仔和毛蚶中的Cd、Cr和Pb含量,用原子荧光分光光度法检测As和Hg含量,并分析双壳贝类重金属污染程度、分布特征及组织积累情况;利用重金属含量计算目标危害系数（THQs）和最大日消费量（CRmax）,评价贝类中重金属对人类造成的潜在健康风险。3、表层沉积物中重金属污染调查及生态风险分析:检测表层沉积物中重金属含量,通过对表层沉积物中地累积指数(Igeo)、污染指数（Cfi）、污染程度指数（mCd）和污染负荷指数（PLI）的计算,分析该地区重金属的污染程度;通过潜在生态风险指数（Eri）、综合潜在生态风险指数（RI）和沉积物质量标准（SQGs）分析,评估重金属污染的潜在生态风险。主要研究结果如下:1、辽东湾双壳贝类主要生物污染情况7个采样点的太平洋牡蛎、虾夷扇贝和紫贻贝中均检出副溶血性弧菌,感染率分别为10.29%、7.49%和9.74%,被检贝类中副溶血性弧菌的平均感染率为9.28%。7个采样点的太平洋牡蛎、虾夷扇贝和紫贻贝中均有病毒存在,其中甲型肝炎病毒的感染率为8.19%,诺如病毒的感染率为3.62%,A群轮状病毒的感染率为8.81%。在普湾和沙后所的太平洋牡蛎中检出尼氏单孢子虫,感染率为2.10%;在普湾的太平洋牡蛎中检出沿岸单孢子虫,感染率为1.26%。在普湾的太平洋牡蛎和虾夷扇贝中检出微细胞虫,感染率为1.01%。在普湾、凌河口、老河口和葫芦岛的紫贻贝中检出条纹槌虫,感染率为1.57%。2、辽东湾双壳贝类中重金属污染情况2013-2017年,辽东湾近海四角蛤蜊、菲律宾蛤仔和毛蚶中5种金属的变化趋势基本一致,As含量缓慢降低,Cd和Cr含量下降明显,Hg和Pb的含量有波动。在沙后所As的含量远超过海洋生物质量I类标准。三种贝类中Cd污染严重,葫芦岛、沙后所菲律宾蛤仔中Cd含量接近海洋生物质量III类标准,其他采样点Cd含量均超过海洋生物质量I类标准;普湾贝类中Cr的含量、凌河口贝类中Hg的含量均超过海洋生物质量I类标准,显着高于其他采样点;各采样点Pb的含量均超过海洋生物质量I类标准,老河口贝类中Pb的含量高于其他点,但低于海洋生物质量II类标准。整个辽东湾贝类中As、Cr和Hg的含量较低,低于或接近各金属的海洋生物质量I类标准;Cd和Pb的含量在各个金属海洋生物质量I类和II类标准之间。3、辽东湾东西两岸双壳贝类中重金属的分布特点辽东湾西岸四角蛤蜊中As、Cd和Cr的含量,菲律宾蛤仔中As、Cd、Cr、Hg和Pb的含量,毛蚶中As、Cd和Pb的含量均显着高于东岸（p<0.05）,其他重金属东西岸差异不显着（p>0.05）。四角蛤蜊的金属污染指数（MPI）按S5>S6>S4>S7>S3>S1>S2的顺序降低,菲律宾蛤仔的MPI按S6>S4=S7>S5>S3>S1>S2的顺序降低,毛蚶的MPI按S5>S6>S7>S4>S1>S3>S2的顺序降低。西岸（S4-S7）的MPI都高于东岸（S1-S3）,这些结果表明,辽东湾西岸的重金属污染比东岸严重。4、辽东湾双壳贝类中重金属的组织特异性及对人体的健康风险双壳贝类内脏中的As、Cr和Hg含量显着高于肌肉组织（p<0.05）;而肌肉组织中Cd含量显着高于内脏（p<0.05）,Pb在两种组织中差异不显着（p>0.05）。四角蛤蜊、菲律宾蛤仔和毛蚶中Cd的THQs均高于其他重金属且大于1,其他重金属的THQs<1,说明辽东湾近海四角蛤蜊、菲律宾蛤仔和毛蚶中Cd的污染最重,对人体存在健康风险,而其他金属对人类没有显着风险。三种贝类中Pb的CRmax相对较高,Cd的CRmaxs最低,显着低于其他重金属的CRmaxs,表明食用这三种贝类,由Cd带来的健康风险概率高于其他重金属。5、辽东湾近海表层沉积物中重金属检测结果及生态风险分析与其他采样点相比,沙后所表层沉积物中As和Cd的含量略高,但差异不显着,凌河口的Hg、普湾、鲅鱼圈、二界沟和沙后所的Pb含量较高,但都低于海洋沉淀物质量I级标准。辽东湾近海表层沉积物中Igeo和Cfi显示,重金属的污染程度是Cd>Pb>As>Hg>Cr。Cd为轻度污染,其他重金属为清洁级,表明Cd是该地区的主要污染物。m Cd和PLI分析都表明该地区无污染或污染程度很低。2013-2017年,辽东湾近海表层沉积物中Cd和Hg的Eri值逐年缓慢下降,其他3种重金属无明显变化,结果表明辽东湾重金属的生态风险顺序为:Cd>Hg>As>Pb>Cr,Cd存在一定生态风险。RI分析表明,各种重金属的生态风险逐年降低,2013-2014年的凌河口、2013-2016年的沙后所RI值在130-260之间,为中等污染,其他各点为低污染。辽东湾近海表层沉积物中重金属的平均RI值小于130,为低污染水平。通过负面生物学效应和沉积物毒性的计算分析,表明As、Cd、Cr、Hg和Pb这5种重金属的组合对环境造成毒性风险的几率为21%,毒性风险不大。以上结果表明,双壳贝类体内和表层沉积物中重金属造成的健康风险不重,但是这些污染物在海洋生态系统中的潜在影响不容忽视,需要进行连续监测。
王炫普[6]（2020）在《戊型肝炎病毒在河北省饲养动物中流行情况的调查研究》文中研究表明[目的]戊型肝炎病毒（HEV）是戊型肝炎的病原体,已有研究表明HEV的一些基因型在动物中流行并且能够跨物种传播给人类。调查河北省饲养动物中HEV的流行情况、分析动物HEV的基因型分布,为戊型肝炎预防控制措施的制定提供依据。[方法]2017年10月-2019年5月从河北省不同地区的养殖场采集猪、家兔、牛、羊等动物粪便样本,从猪和家兔屠宰场采集血液样本,并从屠宰场及市场采集猪肉、猪内脏等样本。样本处理后,分别利用酶联免疫吸附实验（ELISA）和反转录巢式PCR（RT-Nested PCR）进行HEV抗原（HEV-Ag）和HEV核酸（HEV RNA）检测,利用ELISA对血液样本进行血清HEV总抗体（HEV-Ab）检测。应用SPSS 22.0软件,分别计算不同动物不同种类样品各个检测指标的阳性率,应用χ2检验进行率的比较。HEV RNA阳性样本的PCR产物进行基因序列测定,应用MEGA7.0进行HEV基因序列比对及基因进化分析。[结果]（1）从河北省不同地区的6个猪场采集猪粪便样本共136份,其中4个养猪场有HEV-Ag和HEV-Ag阳性样本检出,136份猪粪便样本HEV-Ag和HEV RNA的平均阳性率为分别为6.62%和4.41%;屠宰场采集的猪血液、肝脏和肾脏样本的HEV RNA阳性率分别为0.87%（1/115）、6.33%（5/79）和2.22%（2/90）;市售猪肝、猪肾及猪血制品中均检测到了HEV-RNA,阳性率分别为6.14%（7/114）、3.10%（4/129）、1.18%（2/170）;但屠宰场及市售猪瘦肉样本均没有检出HEV-RNA。（2）从6家养兔场采集家兔粪便共256份,其中5家检测到HEV-Ag和HEV-RNA阳性粪便,256份粪便样本HEV-Ag和HEV-RNA平均阳性率分别为14.06%和11.33%;屠宰场采集211份肉兔和248份獭兔血液样本,肉兔和獭兔血清抗体阳性率分别为2.84%和15.49%;肉兔HEV-Ag和HEV-RNA的阳性率分别为1.9%和0.95%;獭兔HEV-Ag和HEV-RNA的阳性率分别为2.82%和2.42%。（3）在不同地区养殖场采集的182份牛和97份羊的粪便样本中,分别有1份样本为HEV-Ag阳性,但没有检测到HEV RNA;其它动物粪便样本,马47份、狐狸47份、貂60份,均未检测到HEV-Ag和HEV RNA。（4）经过基因序列分析显示所有来源于猪的HEV均属于基因4型、来源于兔群的HEV均属于基因3型兔HEV。[结论]本研究表明河北省猪群中HEV流行普遍,少数待出栏的猪仍处于病毒血症期,屠宰场和市场销售的猪内脏中有少部分含有基因4型HEV,可以推测消费者购买的猪肝、猪肾等内脏可能含有HEV,如果烹饪加热不彻底,食用后有被感染的风险。研究表明河北省各地家兔中HEV流行比较普遍,屠宰时家兔有一部分为基因3型兔HEV阳性,提示兔肉及兔肉制品有传播HEV的风险。猪和家兔HEV的普遍流行,还提示饲养员和屠宰场工人等与猪和家兔密切接触感染的风险。牛、羊中出现HEV-Ag抗原阳性样本,但未检测到HEV RNA,尚不能确定是否感染HEV,应进一步进行调查研究。没有发现其它动物有HEV感染。
吴昌鸿[7]（2020）在《黄芪提取物对HIV-1的抑制作用及机制研究》文中进行了进一步梳理艾滋病毒即人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus,HIV）是导致艾滋病这一具有严重危害的慢性传染病的病原体,艾滋病毒可以导致被感染者免疫功能的部分或完全丧失,CD4+细胞数目减少,继而引发机会性感染和肿瘤等疾病,其临床表现多种多样。目前,HIV感染已成为影响人类健康的主要公共卫生问题,同样也是严重威胁我国公民健康的重要公共卫生问题。黄芪是我国的一种传统中药,具有益气固表、利水消肿、脱毒生肌、延缓衰老等各种药理功效,在中医中应用广泛。随着对黄芪研究的深入,明确了黄芪提取物的药理作用。研究表明,黄芪主要的化学成分包括黄酮类、皂苷类和多糖类等多种活性物质,具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、保护心脑血管、增强免疫能力等多种作用。其中黄芪提取物的抗病毒作用十分广泛,对以人为宿主的病毒如疱疹病毒、乙型肝炎病毒和禽畜感染病毒如禽流感病毒、猪圆环病毒等也具有良好的抑制作用。本研究采用pNL4-3ΔVif/ΔEnv-EGFP和VSVG假病毒包装系统,转染HEK293T细胞制备病毒,研究黄芪组分:毛蕊异黄酮、黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅱ、Cyclocanthoside E和异黄芪皂苷Ⅰ五种黄芪提取物对HIV-1病毒的作用。利用Western Blot证实了成功制备了病毒,将病毒感染Magi细胞,通过流式细胞术检测病毒感染能力,结果证实黄芪甲苷和异黄芪皂苷Ⅰ能够有效抑制HIV-1病毒的感染,结果显示黄芪甲苷和异黄芪皂苷Ⅰ不能直接杀死病毒。为了进一步探讨黄芪甲苷和异黄芪皂苷Ⅰ抑制HIV-1病毒感染的机制,我提取了经不同药物处理的病毒感染后的宿主细胞总DNA,并通过实时荧光定量PCR检测了HIV-1的复制前期、复制后期和整合期的DNA浓度,发现黄芪提取物对HIV-1病毒的整合产生了抑制作用;但Western Blot结果显示黄芪甲苷和异黄芪皂苷Ⅰ并没有直接抑制病毒整合酶的产生。综上所述,本论文通过实验证明了中药黄芪的两类提取物黄芪甲苷和异黄芪皂苷Ⅰ对HIV-1的感染能力产生明显的抑制作用,初步确定了该提取物可能通过抑制HIV-1的整合从而抑制其感染,但具体作用于哪种病毒因子仍有待进一步探究和验证。
孙迪[8]（2019）在《1型鸭甲型肝炎病毒3C蛋白的水解酶功能研究》文中研究表明1型鸭甲型肝炎病毒（Duck hepatitis A virus type 1,DHAV-1）是鸭病毒性肝炎的重要病原,主要感染三周龄以内的雏鸭,发病雏鸭的死亡率高达100%。国内外对于该病的防治措施主要是对雏鸭进行弱毒疫苗的接种和高免卵黄抗体的注射,仍缺乏有效的抗病毒药物。3C蛋白是小RNA病毒保守的蛋白之一,参与病毒多聚蛋白的加工以及宿主蛋白的水解,在病毒的复制、翻译、免疫逃逸和释放过程中发挥着重要作用。然而,目前关于DHAV-1 3C蛋白的功能尚无相关报道,因此本论文对3C蛋白的水解酶活性、细胞内定位及其对宿主细胞蛋白翻译的影响进行研究,具体内容和结果如下:1 1型鸭甲型肝炎病毒3C蛋白的水解酶活性研究根据DHAV-1 X毒株（JQ316452.1）序列设计引物扩增3C基因,构建原核表达载体及其相应表达菌。将纯化的3C蛋白与荧光多肽底物Dabcyl-ASFMNQSKVRRFE-Edans进行体外酶切实验,结果显示DHAV-1 3C蛋白能够识别和水解病毒多聚蛋白中P2区和P3区之间的氨基酸序列FMNQ-S,具有蛋白水解酶活性;该蛋白最适反应温度为37℃,最适反应p H为7.0,最适Na Cl浓度为150 m M;根据酶促反应动力学的米氏方程,测得Km值和Vmax值分别为50.78μM和16.52 nmol/min。利用优化后3C蛋白的反应条件,检测到芦平曲韦（AG7088）对DHAV-1 3C蛋白水解酶活性有抑制作用。2 1型鸭甲型肝炎病毒3C蛋白水解酶活性关键位点的研究对DHAV-1的3C蛋白进行生物信息学分析表明,其具有由144位半胱氨酸、38位组氨酸和69位天冬氨酸组成的典型催化三分子结构和保守的Gx CG基序。进一步构建3C基因的重组真核表达载体并转染鸭胚成纤维细胞和293T细胞,以原核表达的3C蛋白制备的多克隆抗体进行Western blot检测,结果显示转染3C基因的细胞中检测到正确表达的融合蛋白以及单独存在的EGFP蛋白和3C蛋白;而将3C蛋白的38位组氨酸或144位半胱氨酸突变为丙氨酸后,只能检测到融合蛋白的条带,确定DHAV-1 3C蛋白的38位组氨酸和144位半胱氨酸为其水解酶活性的关键位点。3 1型鸭甲型肝炎病毒3C蛋白的定位以及对宿主细胞蛋白翻译的抑制以3C蛋白多克隆抗体对DHAV-1感染和3C基因重组真核质粒转染的鸭胚成纤维细胞进行间接免疫荧光检测,结果显示在DHAV-1感染和3C基因重组真核质粒转染的鸭胚成纤维细胞中,3C蛋白在细胞质和细胞核内均有分布;而将水解酶活性位点38位组氨酸或144位半胱氨酸突变为丙氨酸后,3C蛋白会在细胞质中积聚,表明其水解酶活性能影响入核能力。Puromycin标记法检测结果显示DHAV-1感染鸭胚成纤维细胞后可抑制细胞内蛋白质的合成,但3C蛋白抑制剂AG7088能阻断病毒对宿主蛋白翻译的抑制作用,表明3C蛋白参与病毒抑制细胞的蛋白翻译过程。为进一步研究3C蛋白抑制宿主翻译的具体机制,在293T细胞中转染3C基因真核表达载体,Western blot检测与翻译相关的宿主蛋白表达情况,结果显示e IF4G、e IF5B、PTB、hn RNP K和hn RNP M的蛋白表达水平无明显变化,但PABP蛋白含量显着降低,表明PABP蛋白可能是3C蛋白抑制宿主翻译的靶点。4 1型鸭甲型肝炎病毒3C蛋白对PABP蛋白的水解收集DHAV-1感染不同时间点的鸭胚成纤维细胞总蛋白,Western blot检测PABP蛋白的表达情况,结果显示在感染后1～6 h,PABP蛋白含量逐渐减少;而在6～12 h蛋白含量逐渐增加。使用未感染病毒的鸭胚成纤维细胞总蛋白和原核表达的鸭PABP蛋白分别进行体外酶切实验,结果显示,3C蛋白可以水解PABP蛋白产生两个大小在37 k Da～40 k Da的裂解产物,表明3C蛋白对PABP蛋白的水解不需要其他病毒蛋白或宿主蛋白的协助。构建p ET32a-Flag-PABPWT-HA、p ET32a-Flag-PABPQ341A-HA、p ET32a-Flag-PABPQ367N-HA和p ET32a-Flag-PABPG368N-HA重组载体,原核表达鸭PABP蛋白和PABP突变蛋白进行体外酶切实验,结果显示3C蛋白可水解PABPWT、PABPQ341A和PABPG368N蛋白,而不能水解PABPQ367N蛋白,鉴定出3C蛋白能特异性水解PABP蛋白的WTAQ367-G368氨基酸序列。DHAV-1分别感染si RNA敲低PABP和过表达PABP蛋白的鸭胚成纤维细胞,q RT-PCR检测病毒拷贝数,结果显示PABP的敲低降低了病毒拷贝数;而PABP的过表达显着提升了病毒拷贝数。进一步的研究发现,在表达PABPQ367N突变蛋白的细胞中DHAV-1拷贝数低于表达PABPWT蛋白的细胞,但均显着高于空载对照组;单独表达N端PABP1-367截短蛋白时,病毒的拷贝数没有变化;表达C端PABP368-557截短蛋白可降低病毒拷贝数。这些结果表明,PABP蛋白能促进DHAV-1的复制,其被3C蛋白水解后产生的N端产物不再具有促进病毒复制的作用,而C端产物可抑制病毒的复制。5 1型鸭甲型肝炎病毒3C蛋白参与病毒诱导细胞凋亡分别收集DHAV-1感染后72 h和96 h的鸭胚成纤维细胞以及转染3C基因真核表达载体60 h的鸭胚成纤维细胞,抽提DNA ladder并进行电泳,结果显示DHAV-1的感染和3C蛋白的表达均能使鸭胚成纤维细胞的基因组发生断裂,表明DHAV-1和3C蛋白均可诱导细胞发生凋亡。在DHAV-1感染的鸭胚成纤维细胞中,q RT-PCR检测了在不同感染时间点凋亡相关因子的转录水平,结果显示凋亡因子caspase-3、caspase-8、caspase-9在感染48 h开始显着上调,Cyt-c在60 h出现显着上调,均在72 h达到峰值,其中,caspase-8和Cyt-c m RNA上调水平显着高于其他凋亡因子。这些结果表明DHAV-1感染60～72 h,细胞凋亡开始发生。Western blot检测结果显示在DHAV-1感染鸭胚成纤维细胞12～84 h,细胞的RIPK1蛋白含量减少;3C基因真核表达质粒的转染致使鸭胚成纤维细胞中RIPK1蛋白含量降低,但体外酶切实验证明3C蛋白不能直接切割RIPK1,表明RIPK1蛋白的减少不是由于3C蛋白的直接水解,可能是3C蛋白抑制宿主细胞的翻译所致。综上,DHAV-1感染细胞过程中能够编码具有蛋白水解酶活性的3C蛋白;3C蛋白的38位组氨酸和144位半胱氨酸是其水解酶活性位点;且3C蛋白能识别P1位为谷氨酰胺,P1’位为丝氨酸、甘氨酸或天冬酰胺,P4位为疏水性氨基酸如苯丙氨酸或色氨酸的底物。依赖于水解酶活性,3C蛋白在病毒感染和单独表达过程中能进入细胞核;能特异性水解真核翻译起始必需的PABP蛋白,水解位点是PABP蛋白的Q367-G368,从而参与DHAV-1抑制鸭胚成纤维细胞的蛋白翻译过程。此外,3C蛋白也是DHAV-1感染晚期诱导细胞发生凋亡的重要因素。
李慧莹[9]（2019）在《不同样本中诺如病毒核酸检测方法的研究》文中研究表明诺如病毒（Norovirus,NoV）是引起全球急性胃肠炎的主要致病原,全年均可感染,主要感染儿童、老人和免疫力低下人群。诺如病毒可以食物和水源为载体导致人类患病,又被称作食源性病毒（Foodborne Virus）和水源性病毒（Waterborne Virus）。食源性病毒和水源性病毒主要通过粪-口途径传播,因其传染性强和传播速度快等特征,成为严重威胁人民群众的健康和生命安全,甚至影响社会稳定的重大因素。在食源性病毒和水源性病毒引起的食品安全事故或突发公共卫生事件中,诺如病毒占据了重要地位。由于食品种和水源的种类繁多,成分复杂,污染的病毒含量低,病毒分布不均一,且含有各种抑制病毒检测的因子等因素,使得食源性病毒和水源性病毒检测成为全球公共卫生面临的重点和难点。我国已建立了全国病毒性腹泻监测网络,具备了完整的引起腹泻病毒病相关病毒的检测技术体系。但我国建立食源性病毒和水源性病毒检测体系起步晚,体系还不完善。目前我国仅发布了食品（硬质表面食品、软质水果、生食蔬菜和贝类消化腺）中诺如病毒检测的食品安全国家标准（GB 4789.42-2016）,该标准是在欧盟的ISO/TS 15216-2的基础上建立,并没有进行检测方法优化。并且该国标也不包括脂肪、蛋白类即时食品中和水中诺如病毒检测方法。而在欧盟的ISO/TS 15216-2中也是仅有瓶装水中诺如病毒的检测,缺少大量水中诺如病毒的检测方法。但是目前大部分水源性病毒的暴发均与现场水源（地表水、地下水和自来水）有关,而为了能检测到现场水源中低浓度和分布不均的病毒粒子,需要建立适宜的方法来开展现场采样和提高病毒检测的灵敏度。本研究旨在对已有的临床样本中诺如病毒核酸检测方法进行实验室评价和应用;通过建立水和食品中诺如病毒检测方法与形成水和食品中病毒检测方法的操作规范,为我国水源性和食源性病毒病的检测、监测和应对提供了可借鉴的标准化实验室检测技术。一、临床样本中诺如病毒检测方法的实验室评价和应用实验室评价已发表的诺如病毒GI、GII基因型多重荧光定量反转录聚合酶链反应（Realtime RT-PCR）检测方法,应用该方法对内蒙古呼和浩特市2012年-2017年1863份住院儿童急性胃肠炎粪便样本进行诺如病毒检测。结果显示在1863份住院儿童粪便样本中,诺如病毒阳性率24.25%（12.78-32.92%）,诺如病毒全年感染,冬季为感染高峰期。获得306条诺如病毒VP1区基因序列,包括6个基因型:GII.3（71.24%）,GII.4（23.53%）,GII.2,GII.5,GII.6,和GII.13。诺如病毒聚合酶区序列分析显示GII.P12/GII.3、GII.Pe/GII.4和GII.P4/GII.4是主要流行基因型。二、水中诺如病毒检测方法的建立与应用以鼠诺如病毒（Murine Norovirus-1,MNV-1）作为模式病毒和过程对照病毒,结合膜吸附洗脱富集技术（viral adsoption-elution,VIRADEL）和 Realtime RT-PCR,按照采集水的体积及采样方式的不同建立和评估了两种不同的水源性诺如病毒富集方法。结果显示（1）瓶装、桶装水采用阴或阳离子膜吸附法进行病毒初次浓缩,病毒滞留率分别可以达到99.92%和98.23%;无论是阴离子膜还是阳离子膜,1%Tralk洗液洗脱效果最佳;超滤法对洗脱液进行二次浓缩,最终将待检水样浓缩至200μL;该检测体系能在10个小时内较好地完成0.1mL-5L水中诺如病毒和甲肝病毒的浓缩和检测,并且诺如病毒和甲肝病毒的回收率分别为15.25%和6.76%。最后该方法通过了三家实验室的验证。（2）自主研发了一种适合野外现场采样的病毒采集系统（Biotroy半自动微生物采集系统）。该系统能在野外现场无外电源的条件下2个小时内完成1000L环境水的采集（水流速10L/min）;仅需将过滤完水样的Nanoceram膜装置低温带回实验室,用Tralk洗液洗脱病毒,再通过PEG-6000沉淀和超滤二次浓缩最终获得了 1mL浓缩水样,并且Tralk洗液对Nanoceram膜的MNV-1洗脱率达到70.45%。（3）对北京市昌平区京密水渠饮用水进行了病毒富集,通过高通量测序和病毒宏基因组分析了该饮用水的病毒谱,发现了 5个病毒科的哺乳动物病毒谱,其中一些与人类疾病相关,包括通过粪口途径传播的主要常见病毒如诺如病毒（NoV GII.17）、肠道病毒（Enterovirus 71,EV 71）、甲肝病毒（HAV）和爱知病毒（Aichivirus,Aichi1）。本研究建立了适合实验室的瓶装、桶装水中诺如病毒富集检测方法和适合野外现场的大量水中诺如病毒的富集和检测方法,并应用自主研发的Biotroy半自动微生物采集系统对我国北京市昌平区京密水渠开展了饮用水中病毒的富集和检测。三、食品中诺如病毒检测方法的优化与评估以MNV-1为模式病毒和过程对照病毒,结合Realtime RT-PCR检测方法,优化和评估了软浆果、碳水化合物类食品及蛋白质、脂肪类即食食品中诺如病毒的检测方法。（1）考察Tralk洗液、TGBE洗液、TPB洗液和NaPP洗液对软浆果（草莓和葡萄）和碳水化合物类食品（生菜和洋葱）中MNV-1的洗脱效果,比较洗脱液的二次浓缩方法PEG6000沉淀和超滤对MNV-1的浓缩效果。评估优化后方法对不同食品中诺如病毒的富集效果。结果表明软浆果草莓中TGBE洗液-PEG6000沉淀组合方法的MNV-1回收效果优于其他组合,诺如病毒检测限为103基因拷贝/10g;葡萄中TGBE洗液-超滤的MNV-1回收效果优于其他组合,诺如病毒检测限为104基因拷贝/10g;生菜中Tralk洗液-PEG沉淀的MNV-1回收效果优于其他组合,诺如病毒检测限为103基因拷贝/10g;洋葱中Tralk洗液-超滤的MNV-1回收效果优于其他组合,诺如病毒检测限为104基因拷贝/10g。（2）比较了洗脱-浓缩方法和直接RNA提取法回收蛋糕和午餐肉中MNV-1的回收效果,结果显示前者没有检测到蛋糕和午餐肉的MNV-1,后者成功回收到了 MNV-1,但是诺如病毒的检测限高于其他种类食品,分别为106基因拷贝/10g和104基因拷贝/10g。本研究建立了软浆果、碳水化合物类食品和脂肪蛋白类即食食品中诺如病毒的检测方法。优化和完善了我国食品中诺如病毒检测体系。四、贝类中病毒的检测以MNV-1为模式病毒和过程对照病毒,结合Realtime RT-PCR检测方法,初步探讨了贝类中诺如病毒两种不同检测方法的检测效果。（1）比较蛋白酶K结合PEG沉淀和蛋白酶K结合直接RNA提取两种贝类中诺如病毒检测效果。用蛋白酶K结合PEG沉淀得到的MNV-1回收效果优于蛋白酶K结合直接RNA提取方法获得的MNV-1回收效果。（2）收集我国北京市330份贝类样本,蛋白酶K结合PEG沉淀处理贝类消化腺和肠道后,利用高通量测序和病毒宏基因组分析获得贝类中的病毒谱。本研究通过高通量测序后共获得了 4594270条被注释病毒的基因序列,其中以动物为宿主的病毒序列占21%（965185/4594270）。而在以动物为宿主的病毒序列中,被注释到哺乳动物为宿主的病毒序列占1.26%（12205/965185）,包括20个病毒科,其中就有小RNA病毒科（Picornaviridae）的12个病毒属和杯状病毒（Caliciviridae）的诺如病毒属（Norovirus）和札如病毒属（Sapovirus）,包括常见的人疾病暴发相关的EV、HAV 和 NoV,其中 NoV 的基因型包括 GII.1、GII.2、GII.13、GII.14 和GII.17。NoV GII.2基因序列与目前我国NoV主要流行株的氨基酸同源性达到100%,而GII.17与流行株的氨基酸同源性为98%。总之,实验室评价了已发表诺如病毒Realtime RT-PCR检测方法,通过该方法获得了 2012年-2017年内蒙古呼和浩特市5岁以下住院儿童诺如病毒的分子流行特征。本研究自主研发了一套适合现场水样采集的Biotroy半自动微生物采集系统,建立了水和食品中诺如病毒的回收检测方法,形成了水和食品中诺如病毒检测方法操作规范,并结合病毒宏基因组学方法初步探讨了饮用水源和贝类中的病毒谱。
王茜[10]（2018）在《鸭坦布苏病毒、鸭瘟病毒、鸭甲型肝炎病毒1型和3型一步法多重RT-PCR检测方法的建立及其应用》文中进行了进一步梳理鸭坦布苏病毒（Duck tembusu virus,DTMUV）、鸭瘟病毒（Duck plague virus,DPV）、鸭甲型肝炎病毒（Duck hepatitis A virus,DHAV）血清1型（DHAV-1）和3型（DHAV-3）均为危害养鸭业发展的重要病毒性病原,为了快速检测这几种病毒。本研究建立了DTMUV、DPV、DHAV-1和DHAV-3的一步法多重RTPCR检测方法,并对该方法的灵敏度、特异性和重复性等要素进行评估,并将建立的方法应用于病料的鉴别诊断,结果如下:1.DTMUV、DPV、DHAV-1和DHAV-3一步法多重RT-PCR检测方法的建立根据DTMUV、DPV、DHAV-1和DHAV-3在GenBank上全基因组保守序列设计四对引物,以4种病毒的核酸为模板,通过对反应退火温度和引物浓度等条件进行优化,建立了一步法多重RT-PCR方法,分别能扩增出322bp、804bp、648bp和1314bp的目的片段。特异性试验结果显示:以鸭乙肝病毒、禽流感病毒、鸭圆环病毒、鹅细小病毒、鸭疫里默氏杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和健康鸭脾脏组织为模板的扩增结果均为阴性。对同一批次的阳性样本三次重复检测的结果一致。敏感性试验结果显示:DTMUV、DHAV-1和DHAV-3最低检出限均为0.1pg,DPV最低检测限为1pg,而同一体系中同时检测出DTMUV、DPV、DHAV-1和DHAV-3四种病毒的最低检测限为1pg。2.建立的一步法多重RT-PCR样品检测的应用选择上述病毒对无母源抗体7日龄健康雏鸭攻毒模拟混合感染,采集脾脏和法氏囊共108份样品,采用建立的一步法多重RT-PCR方法和经典的其他PCR方法检测结果显示:对于DTMUV、DPV、DHAV-1和DHAV-3的检测结果阳性符合率分别为98.3%、100%、96.7%和97.4%,阴性符合率分别为87.5%、100%、97.4%和95.7%,也表明了建立的方法可信度高。应用该方法对67例广汉、什邡、德阳、邛崃、眉山、绵阳、乐山、简阳及云南等地送检样品进行检测,结果显示:检出DHAV-1和DTMUV阳性病料分别为16份、4份,检出率分别为23.9%、6.0%,均未见混合阳性样品检出,且DPV和DHAV-3检测结果均为阴性。
二、两种反转录聚合酶链反应检测甲型肝炎病毒（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、两种反转录聚合酶链反应检测甲型肝炎病毒（论文提纲范文）
（1）四种病毒组学方法的比较及在旱獭肠道样品中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 病毒宏基因组学概述 |
| 1.1 病毒宏基因组学的发展及应用 |
| 1.2 病毒宏基因组学的研究方法 |
| 1.3 不同病毒宏基因组学方法的优缺点 |
| 2 啮齿动物病毒组研究进展 |
| 第二章 四种病毒组学方法的比较 |
| 1 材料 |
| 1.1 试剂 |
| 1.2 耗材 |
| 1.3 仪器 |
| 1.4 软件 |
| 2 方法 |
| 2.1 模拟样品的制备 |
| 2.2 四种病毒组学方法的处理 |
| 2.3 高通量测序与生物信息学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 四种病毒组学方法的灵敏度及特异性的比较 |
| 3.2 四种病毒组学方法对全基因组覆盖能力的比较 |
| 3.3 病毒载量、测序深度与reads数量及覆盖度的对应关系 |
| 4 讨论 |
| 第三章 四种病毒组学方法的应用 |
| 1 材料 |
| 1.1 试剂 |
| 1.2 耗材 |
| 1.3 仪器 |
| 1.4 软件 |
| 2 方法 |
| 2.1 样品信息 |
| 2.2 病毒宏基因组学处理 |
| 2.3 高通量测序与病毒组学分析 |
| 2.4 部分病毒PCR检测 |
| 2.5 病毒遗传进化分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 病毒宏基因组结果 |
| 3.2 部分病毒的PCR检测结果 |
| 3.3 病毒进化分析 |
| 4 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的学术成果 |
| 致谢 |
（2）血清HBV RNA在慢性HBV感染者病情评估和耐药监测中的应用（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 微滴数字PCR用于血清HBVRNA定量方法的建立及与实时荧光定量PCR方法的对比评价 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 血清HBV RNA在未治慢性HBV感染者中的分布特点及其临床意义 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 恩替卡韦耐药及部分病毒学应答患者血清HBV RNA动力学特征以及用于长期监测耐药突变的初步研究 |
| 4.1 研究对象和方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 全文总结与研究展望 |
| 参考文献 |
| 文献综述 慢性乙型肝炎血清学标志物研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的文章 |
| 致谢 |
（3）基于叠氮溴化丙锭-定量反转录-聚合酶链式反应的甲型肝炎疫苗病毒滴度快速检测方法（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞及培养基 |
| 1.1.2 疫苗和质粒标准品 |
| 1.1.3 主要试剂及设备 |
| 1.1.4 引物和探针 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结 果 |
| 2.1 条件优化和影响因素的研究 |
| 2.1.1 PMA浓度和光解时间的选择 |
| 2.1.2 PMA孵育温度和时间的选择 |
| 2.1.3 不同灭活方式的影响 |
| 2.1.4 pH值的影响 |
| 2.1.5 添加剂的影响 |
| 2.2 方法学研究 |
| 2.2.1 特异性 |
| 2.2.2 线性、平行性和灵敏度 |
| 2.3 重复性 |
| 2.4 相关性 |
| 2.5 初步适用性研究 |
| 2.5.1 4个实验室检测同一样品的比较 |
| 2.5.2 不同疫苗样品在不同细胞系的适用性比较 |
| 3 讨 论 |
（4）2017～2019年山东省部分地区鸭甲肝病毒的分子特征分析和VP1基因的表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第1章 综述 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 鸭病毒性肝炎的流行情况 |
| 1.3 鸭甲肝病毒的病原学 |
| 1.3.1 分类 |
| 1.3.2 理化特性 |
| 1.3.3 培养特性 |
| 1.3.4 纯化 |
| 1.3.5 分子生物学特性 |
| 1.3.6 VP1蛋白 |
| 1.4 鸭甲型病毒性肝炎的临床症状和病理变化 |
| 1.5 鸭甲型病毒性肝炎的诊断 |
| 1.5.1 电镜检测 |
| 1.5.2 血清学检测 |
| 1.5.3 分子生物学诊断 |
| 1.6 鸭甲型病毒性肝炎的防治 |
| 1.6.1 灭活疫苗 |
| 1.6.2 弱毒疫苗 |
| 1.6.3 基因工程疫苗 |
| 1.6.4 中药治疗 |
| 1.7 本研究的目的和意义 |
| 第2章 22株鸭甲肝病毒的分离鉴定及VP1基因的分子特征分析 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 病料来源 |
| 1.1.2 试剂与仪器 |
| 1.1.3 引物设计 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 病料处理 |
| 1.2.2 病毒分离 |
| 1.2.3 病毒的RNA提取 |
| 1.2.4 RT-PCR鉴定 |
| 1.2.5 病原的电镜检测 |
| 1.2.6 雏鸭的致病性实验 |
| 1.2.7 VP1扩增 |
| 1.2.8 VP1序列分析 |
| 1.3 结果与分析 |
| 1.3.1 病毒分离结果 |
| 1.3.2 RT-PCR鉴定结果 |
| 1.3.3 电镜结果 |
| 1.3.4 雏鸭的致病性结果 |
| 1.3.5 VP1序列分析 |
| 1.4 讨论 |
| 第3章 鸭甲肝病毒3型VP1基因的真核表达 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 质粒与毒株 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要试剂配制 |
| 1.1.4 主要仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 引物设计 |
| 1.2.2 目的基因的获取 |
| 1.2.3 目的基因的克隆 |
| 1.2.4 重组质粒的构建和鉴定 |
| 1.2.5 重组质粒的表达 |
| 1.2.6 小鼠免疫实验 |
| 1.3 结果与分析 |
| 1.3.1 目的基因的克隆 |
| 1.3.2 重组质粒的酶切鉴定 |
| 1.3.3 IFA分析VP1蛋白在Vero细胞中的表达 |
| 1.3.4 WB分析VP1蛋白在Vero细胞中的表达 |
| 1.3.5 小鼠体内抗体检测结果 |
| 1.4 讨论 |
| 第4章 鸭甲肝病毒3型VP1基因的原核表达以及抗体检测ELISA方法的初步建立 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 质粒与毒株 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要试剂配制 |
| 1.1.4 主要仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 引物设计 |
| 1.2.2 目的基因的获取 |
| 1.2.3 目的基因的亚克隆 |
| 1.2.4 重组质粒的构建和鉴定 |
| 1.2.5 重组质粒的表达 |
| 1.2.6 基于重组VP1蛋白的间接ELISA方法的初步建立 |
| 1.3 结果与分析 |
| 1.3.1 目的基因的扩增 |
| 1.3.2 重组质粒的酶切鉴定 |
| 1.3.3 重组蛋白的诱导表达及纯化 |
| 1.3.4 VP1-ELISA方法的初步建立 |
| 1.4 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文 |
| 致谢 |
（5）辽东湾近海双壳贝类主要生物和重金属污染现状调查及生态风险评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 辽东湾近海双壳贝类污染调查的背景及意义 |
| 1.2 辽东湾近海双壳贝类污染特征 |
| 1.2.1 辽东湾近海双壳贝类生物性污染现状 |
| 1.2.2 辽东湾近海双壳贝类重金属污染现状 |
| 1.3 双壳贝类生态风险评价方法 |
| 1.3.1 双壳贝类生物污染的风险评价 |
| 1.3.2 双壳贝类重金属污染的风险评价 |
| 1.3.3 基于辽东湾近海沉积物重金属总量的生态风险评价 |
| 1.4 辽东湾近海贝类污染研究现状与存在的问题 |
| 1.4.1 辽东湾近海双壳贝类生物污染研究现状与存在问题 |
| 1.4.2 辽东湾近海贝类重金属污染研究现状与存在问题 |
| 1.4.3 辽东湾近海表层沉积物中重金属污染现状与存在问题 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要仪器和设备 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 常见溶液配制 |
| 2.1.4 引物序列 |
| 2.2 试验总体设计 |
| 2.2.1 技术路线 |
| 2.2.2 样品采集 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 双壳贝类中常见生物污染的检测 |
| 2.3.2 双壳贝类中重金属的检测 |
| 2.3.3 辽东湾近海沉积物中重金属的检测 |
| 2.3.4 数据统计分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 双壳贝类中细菌检测结果 |
| 3.1.1 贝类中细菌PCR产物电泳结果 |
| 3.1.2 细菌培养结果 |
| 3.1.3 细菌感染情况分析 |
| 3.2 双壳贝类中病毒检测结果 |
| 3.2.1 贝类中病毒PCR产物电泳和测序结果 |
| 3.2.2 辽东湾双壳贝类病毒感染情况分析 |
| 3.3 双壳贝类中寄生虫检测结果 |
| 3.3.1 贝类中主要寄生虫PCR产物结果 |
| 3.3.2 双壳贝类中寄生虫感染情况分析 |
| 3.4 辽东湾近海双壳贝类中重金属检测结果 |
| 3.4.1 2013-2017年辽东湾近海不同采样点三种贝类中重金属含量分析 |
| 3.4.2 四角蛤蜊、菲律宾蛤仔、毛蚶中五种重金属的年际变化情况分析 |
| 3.4.3 辽东湾东岸和西岸近海三种贝类中重金属的地理分布特点 |
| 3.4.4 菲律宾蛤仔肌肉和内脏中重金属的累积分析 |
| 3.4.5 贝类中重金属对人体的健康风险评价 |
| 3.5 辽东湾近海表层沉积物中重金属分析 |
| 3.5.1 沉积物中重金属污染情况 |
| 3.5.2 2013-2017年辽东湾表层沉积物中重金属的I_(geo) |
| 3.5.3 2013-2017年辽东湾表层沉积物中重金属的C_f~i |
| 3.5.4 2013-2017年辽东湾表层沉积物中重金属的mCd |
| 3.5.5 2013-2017年辽东湾表层沉积物中重金属PLI的空间分布 |
| 3.5.6 2013-2017年辽东湾表层沉积物中重金属E_r~i的时空分布 |
| 3.5.7 辽东湾表层沉积物中重金属的负面生物学效应和沉积物毒性 |
| 4 讨论 |
| 4.1 辽东湾双壳贝类生物污染和重金属污染检测点、检测对象的确定 |
| 4.2 辽东湾双壳贝类中生物污染分析 |
| 4.2.1 辽东湾近海双壳贝类中的细菌和病毒污染分析 |
| 4.2.2 辽东湾双壳贝类中寄生虫的感染分析 |
| 4.3 辽东湾近海重金属的来源 |
| 4.4 辽东湾近海双壳贝类中重金属污染分析 |
| 4.5 辽东湾近海双壳贝类中重金属的潜在健康风险评价 |
| 4.6 辽东湾近海表层沉积物中重金属污染评价 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录 A 论文中英文缩写对应中文名称 |
| 附录 B 论文参考相应标准 |
| 附录 C 双壳贝类图片 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（6）戊型肝炎病毒在河北省饲养动物中流行情况的调查研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 戊型肝炎病毒的生物学特征 |
| 1.1.2 戊型肝炎的临床特征 |
| 1.1.3 戊型肝炎的流行情况 |
| 1.1.4 戊型肝炎病毒在动物中的流行情况 |
| 1.2 戊型肝炎流行及戊型肝炎的研究进展 |
| 1.2.1 发达国家戊型肝炎的流行及研究现状 |
| 1.2.2 发展中国家戊型肝炎的流行及研究现状 |
| 1.2.3 我国戊型肝炎的流行及研究现状 |
| 1.3 研究的目的及意义 |
| 第二章 研究方法 |
| 2.1 实验仪器 |
| 2.2 样本的采集及处理 |
| 2.2.1 样本的采集 |
| 2.2.2 样本的处理 |
| 2.3 样本的检测 |
| 2.3.1 HEV总抗体的检测 |
| 2.3.2 HEV抗原的检测 |
| 2.3.3 HEV RNA的检测 |
| 2.4 HEV RNA基因序列的测定及分析 |
| 2.4.1 基因序列测定 |
| 2.4.2 基因序列分析 |
| 2.5 统计分析 |
| 第三章 研究结果 |
| 3.1 养殖场中动物HEV的流行情况 |
| 3.1.1 养殖场猪粪便样本HEV检测结果 |
| 3.1.2 养殖场家兔粪便样本HEV检测结果 |
| 3.1.3 牛、羊等其它动物HEV检测结果 |
| 3.2 屠宰场中动物HEV的流行情况 |
| 3.2.1 屠宰猪的血清阳性率 |
| 3.2.2 生猪肉、猪肝、猪肾、猪血制品HEV RNA存在情况 |
| 3.2.3 屠宰兔子的血清阳性率 |
| 3.3 市售猪肉、猪内脏及肉制品HEV的污染情况 |
| 3.4 HEV分离株基因序列的的比对及分型结果 |
| 3.4.1 猪HEV分离株ORF2 区域PCR扩增片段基因序列的分析 |
| 3.4.2 家兔HEV分离株ORF2 区域PCR扩增片段基因序列的分析 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 小结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间取得的科研成果 |
（7）黄芪提取物对HIV-1的抑制作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 艾滋病的研究进展 |
| 1.1.1 艾滋病流行现状 |
| 1.1.2 艾滋病毒简介 |
| 1.1.3 艾滋病毒检测 |
| 1.1.4 艾滋病治疗研究进展 |
| 1.1.5 中医药与艾滋病治疗 |
| 1.2 中药黄芪的研究进展 |
| 1.2.1 黄芪主要化学成分 |
| 1.2.2 黄芪提取物抗病毒作用研究 |
| 1.2.3 黄芪提取物其他药理作用研究 |
| 1.3 主要研究内容及意义 |
| 第2章 黄芪提取物对HIV-1 抑制作用研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料、试剂与仪器 |
| 2.2.1 实验所用菌种和细胞系 |
| 2.2.2 常规质粒 |
| 2.2.3 抗体 |
| 2.2.4 实验仪器 |
| 2.2.5 化学试剂 |
| 2.2.6 相关试剂配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养与传代 |
| 2.3.2 细胞冻存及复苏 |
| 2.3.3 药物处理细胞 |
| 2.3.4 MTT实验 |
| 2.3.5 贴壁293T细胞PEI转染法 |
| 2.3.6 病毒收集和保存 |
| 2.3.7 蛋白质免疫印迹 |
| 2.3.8 病毒感染实验 |
| 2.3.9 结果处理与统计学分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 黄芪提取物细胞毒性检测 |
| 2.4.2 HIV-1 病毒包装及加药处理 |
| 2.4.3 不同药物处理后HV-1 病毒感染能力检测 |
| 2.5 分析与讨论 |
| 第3章 黄芪提取物对HIV-1 抑制作用的机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料、试剂与仪器 |
| 3.2.1 实验所用细胞系 |
| 3.2.2 抗体 |
| 3.2.3 实验仪器 |
| 3.2.4 化学试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞总DNA提取实验 |
| 3.3.2 实时荧光定量PCR |
| 3.3.3 蛋白质免疫印迹 |
| 3.3.4 结果处理与统计学分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 黄芪甲苷和异黄芪皂苷Ⅰ影响HIV-1 的整合 |
| 3.4.2 黄芪甲苷和异黄芪皂苷Ⅰ不直接抑制HIV-1 的病毒活性 |
| 3.4.3 黄芪甲苷和异黄芪皂苷Ⅰ不直接抑制整合酶的合成 |
| 3.5 分析与讨论 |
| 第4章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 发表论文及参加科研情况 |
| 致谢 |
（8）1型鸭甲型肝炎病毒3C蛋白的水解酶功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 常用英文缩写词汇 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 小RNA病毒的研究概况 |
| 1.1 小RNA病毒的基因组结构 |
| 1.2 小RNA病毒的生命周期 |
| 2 小RNA病毒3C蛋白的研究概况 |
| 2.1 3C蛋白的结构和生物特性 |
| 2.2 3C蛋白与宿主细胞的相互作用 |
| 3 鸭病毒性肝炎的研究概况 |
| 3.1 鸭肝炎病毒的分类 |
| 3.2 鸭甲型肝炎病毒的病原学和基因组结构 |
| 3.3 鸭甲型病毒性肝炎的流行特点 |
| 3.4 鸭甲型病毒性肝炎的防治措施 |
| 4 选题目的及意义 |
| 第二章 1型鸭甲型肝炎病毒3C蛋白的水解酶活性研究 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 病毒与菌株 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 引物 |
| 1.4 试剂与设备 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 1型鸭甲型肝炎病毒3C蛋白的进化树分析 |
| 2.2 1型鸭甲型肝炎病毒3C蛋白表达载体的构建 |
| 2.3 1型鸭甲型肝炎病毒3C蛋白酶活性检测 |
| 2.4 1型鸭甲型肝炎病毒3C蛋白的抑制剂检测 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 1型鸭甲型肝炎病毒3C蛋白的系统进化树分析 |
| 3.2 1型鸭甲型肝炎病毒3C蛋白原核表达载体的构建 |
| 3.3 重组1型鸭甲型肝炎病毒3C蛋白的表达 |
| 3.4 重组1型鸭甲型肝炎病毒3C蛋白的水解酶活性检测 |
| 3.5 重组3C蛋白的抑制剂检测 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 1型鸭甲型肝炎病毒3C蛋白抑制宿主细胞的蛋白翻译 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 菌株 |
| 1.2 试剂 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 药物抑制试验 |
| 2.2 1型鸭甲型肝炎病毒3C基因真核表达载体的构建和鉴定 |
| 2.3 瞬时转染真核表达载体 |
| 2.4 SUnSET嘌呤霉素标记法检测蛋白合成 |
| 2.5 细胞活性检测 |
| 2.6 3C蛋白兔抗血清的制备 |
| 2.7 3C蛋白鼠抗血清的制备 |
| 2.8 免疫印迹实验 |
| 2.9 间接免疫荧光检测 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 1型鸭甲型肝炎病毒3C蛋白真核表达载体的构建 |
| 3.2 1型鸭甲型肝炎病毒3C蛋白兔抗血清的制备 |
| 3.3 1型鸭甲型肝炎病毒3C蛋白鼠抗血清的制备 |
| 3.4 1型鸭甲型肝炎病毒3C蛋白的真核表达 |
| 3.5 1型鸭甲型肝炎病毒3C蛋白在细胞内定位 |
| 3.6 1型鸭甲型肝炎病毒3C蛋白水解活性对病毒复制的影响 |
| 3.7 1型鸭甲型肝炎病毒3C蛋白对细胞蛋白合成的影响 |
| 3.8 1型鸭甲型肝炎病毒3C蛋白对宿主翻译所需蛋白的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 1型鸭甲型肝炎病毒3C蛋白对多聚腺苷酸结合蛋白的水解 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 菌株和质粒 |
| 1.2 引物 |
| 1.3 实验试剂 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 鸭PABP蛋白的表达 |
| 2.2 1型鸭甲型肝炎病毒3C蛋白对鸭PABP蛋白的水解 |
| 2.3 1型鸭甲型肝炎病毒3C蛋白对鸭PABP蛋白水解位点的鉴定 |
| 2.4 PABP蛋白对1型鸭甲型肝炎病毒复制的影响 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 重组PABP蛋白的表达 |
| 3.2 1型鸭甲型肝炎病毒3C蛋白与PABP蛋白的相互作用 |
| 3.3 1型鸭甲型肝炎病毒3C蛋白对PABP蛋白水解位点的鉴定 |
| 3.4 PABP蛋白对1型鸭甲型肝炎病毒复制的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第五章 1型鸭甲型肝炎病毒3C蛋白参与病毒诱导细胞凋亡 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 菌株和质粒 |
| 1.2 引物 |
| 1.3 实验试剂 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 DNA ladder检测病毒诱导细胞凋亡 |
| 2.2 qRT-PCR检测凋亡因子的mRNA水平 |
| 2.3 1型鸭甲型肝炎病毒3C蛋白与细胞凋亡 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 1型鸭甲型肝炎病毒诱导鸭胚成纤维细胞凋亡 |
| 3.2 1型鸭甲型肝炎病毒3C蛋白诱导细胞凋亡 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 本文的创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（9）不同样本中诺如病毒核酸检测方法的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1. 诺如病毒 |
| 1.1.介绍 |
| 1.2. 基因和病毒结构 |
| 1.3. GII4基因型诺如病毒 |
| 2. 食源性病毒和水源性病毒 |
| 2.1. 介绍 |
| 2.2. 根据临床特点分类 |
| 2.3. 食源性和水源性诺如病毒 |
| 2.4. 诺如病毒的传播途径 |
| 3. 不同样本中诺如病毒检测 |
| 3.1. 临床样本、食品样本和水样本 |
| 3.2. 诺如病毒检测策略 |
| 3.3. 病毒分离 |
| 3. 本文关注的科学问题 |
| 第一部分 腹泻样本中诺如病毒检测方法实验室评价与应用 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1. 实验仪器 |
| 1.2. 常用试剂 |
| 1.3. 常用耗材 |
| 1.4. 实验病毒株 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1. 核酸提取 |
| 2.2. 病毒检测方法实验室评价 |
| 2.3. 诺如病毒检测方法在临床样本中的应用 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1. 病毒Realtime RT-PCR检测方法评估 |
| 3.2. 呼和浩特市诺如病毒分子流行情况 |
| 4. 讨论 |
| 第二部分 水中诺如病毒检测方法建立与应用 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1. 实验仪器 |
| 1.2. 常用试剂 |
| 1.3. 常用耗材 |
| 1.4. 实验病毒株 |
| 1.5. 常用溶剂的配置方法 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1. 细胞复苏、传代培养和冻存 |
| 2.2. MNV-1病毒培养和病毒滴定测定 |
| 2.3. 核酸提取 |
| 2.4. 病毒检测方法研究 |
| 2.5. 瓶装或桶装水中病毒浓缩 |
| 2.6. 大量水中病毒浓缩 |
| 2.7. 高通量测序 |
| 3. 结果 |
| 3.1. MNV-1 Realtime RT-PCR标准曲线建立 |
| 3.2. 瓶装和桶装水中病毒回收效果 |
| 3.3. Biotroy半自动微生物采集系统回收MNV-1效果评价 |
| 3.4. 饮用水中病毒回收 |
| 4. 讨论 |
| 第三部分 食品中诺如病毒检测方法优化与评估 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1. 实验仪器 |
| 1.2. 常用试剂 |
| 1.3. 常用耗材 |
| 1.4. 病毒毒株 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1. 模拟样本制备 |
| 2.2. 病毒洗脱 |
| 2.3. 二次浓缩 |
| 2.4. 直接RNA提取 |
| 2.5. 病毒检测 |
| 2.6. ISC-RT-qPCR检测NoVs |
| 3. 实验结果 |
| 3.1. 碳水化合物类食品中MNV-1回收效果 |
| 3.2. 脂肪、蛋白类食品中MNV-1回收效果 |
| 3.3. 食品中诺如病毒的回收效果 |
| 3.4. 基于受体捕获诺如病毒检测草莓中诺如病毒 |
| 4. 实验讨论 |
| 第四部分 贝类中病毒检测 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1. 实验仪器 |
| 1.2. 常用试剂 |
| 1.3. 常用耗材 |
| 1.4. 过程对照病毒MNV-1毒株制备 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1. 贝类样本收集 |
| 2.2. 贝类样本处理 |
| 2.3. 贝类病毒的分离 |
| 2.4. 高通量测序 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1. 比较不同贝类中诺如病毒检测方法 |
| 3.2. 贝类中病毒宏基因组分析结果 |
| 3.3. 贝类中动物病毒基因组的分析结果 |
| 3.4. 贝类中胃肠炎疾病相关的病毒基因组分析 |
| 4. 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（10）鸭坦布苏病毒、鸭瘟病毒、鸭甲型肝炎病毒1型和3型一步法多重RT-PCR检测方法的建立及其应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一部分 文献综述 |
| 1 病原简述 |
| 2 分子生物学检测技术 |
| 2.1 核酸探针杂交技术 |
| 2.2 常规(RT-)PCR技术 |
| 2.3 巢式RT-PCR技术 |
| 2.4 实时荧光定量PCR |
| 2.5 环介导等温扩增技术 |
| 3 多重PCR技术简介 |
| 3.1 多重PCR检测方法 |
| 3.2 多重PCR在诊断病毒学研究中的应用 |
| 3.3 多重PCR方法在兽医中的应用 |
| 4 本研究的目的意义 |
| 第二部分 试验部分 |
| 第一章 鸭坦布苏病毒、鸭瘟病毒和鸭甲型肝炎病毒的一步法多重RT-PCR检测方法的建立 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 毒株和菌株 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 引物设计与合成 |
| 2.2 病毒增殖 |
| 2.3 病毒核酸的提取 |
| 2.4 单一RT-PCR扩增 |
| 2.5 一步法多重RT-PCR扩增 |
| 2.6 一步法多重RT-PCR反应退火温度的优化 |
| 2.7 一步法多重RT-PCR反应引物浓度优化 |
| 2.8 一步法多重RT-PCR反应的特异性试验 |
| 2.9 一步法多重RT-PCR方法检测单一病毒的敏感性试验 |
| 2.10 一步法多重RT-PCR方法的敏感性试验 |
| 2.11 一步法多重RT-PCR方法的重复性试验 |
| 2.12 一步法多重RT-PCR产物测序鉴定 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 单一RT-PCR扩增 |
| 3.2 单一RT-PCR反应退火温度优化结果 |
| 3.3 一步法多重RT-PCR反应退火温度优化结果 |
| 3.4 一步法多重RT-PCR反应引物浓度优化结果 |
| 3.5 一步法多重RT-PCR反应特异性试验 |
| 3.6 一步法多重RT-PCR方法检测单一病毒的敏感性试验 |
| 3.7 一步法多重RT-PCR反应敏感性试验 |
| 3.8 一步法多重RT-PCR反应的重复性试验 |
| 4 讨论 |
| 4.1 鸭坦布苏病毒、鸭瘟病毒和鸭甲型肝炎病毒的一步法多重RT-PCR检测方法的建立 |
| 4.2 多重PCR的条件优化 |
| 4.3 一步法多重RT-PCR的优势与不足 |
| 第二章 鸭坦布苏病毒、鸭瘟病毒和鸭甲型肝炎病毒的一步法多重RT-PCR检测方法的初步应用 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 试验动物和临床样品 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 一步法多重RT-PCR方法检测人工感染样品 |
| 2.2 一步法多重RT-PCR方法检测临床样品 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 人工感染样品的混合感染情况 |
| 3.2 人工感染样品的检测结果与其他PCR方法检测结果比较 |
| 3.3 对四川及云南等地送检的随机病料检测结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 一步法多重RT-PCR对临床病料的检测及与其他方法对比 |
| 4.2 建立的一步法多重RT-PCR技术的适用性分析 |
| 4.3 靶器官的选择 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 作者简历 |
四、两种反转录聚合酶链反应检测甲型肝炎病毒（论文参考文献）
- [1]四种病毒组学方法的比较及在旱獭肠道样品中的应用[D]. 孙悦. 扬州大学, 2021(02)
- [2]血清HBV RNA在慢性HBV感染者病情评估和耐药监测中的应用[D]. 李茂仕. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(01)
- [3]基于叠氮溴化丙锭-定量反转录-聚合酶链式反应的甲型肝炎疫苗病毒滴度快速检测方法[J]. 卞莲莲,王一平,孙世洋,高帆,吴星,毛群颖,梁争论. 中国病毒病杂志, 2020(06)
- [4]2017～2019年山东省部分地区鸭甲肝病毒的分子特征分析和VP1基因的表达[D]. 管飘萍. 扬州大学, 2020(01)
- [5]辽东湾近海双壳贝类主要生物和重金属污染现状调查及生态风险评价[D]. 刘永华. 东北农业大学, 2020(07)
- [6]戊型肝炎病毒在河北省饲养动物中流行情况的调查研究[D]. 王炫普. 河北大学, 2020(08)
- [7]黄芪提取物对HIV-1的抑制作用及机制研究[D]. 吴昌鸿. 天津大学, 2020(02)
- [8]1型鸭甲型肝炎病毒3C蛋白的水解酶功能研究[D]. 孙迪. 四川农业大学, 2019(06)
- [9]不同样本中诺如病毒核酸检测方法的研究[D]. 李慧莹. 中国疾病预防控制中心, 2019(02)
- [10]鸭坦布苏病毒、鸭瘟病毒、鸭甲型肝炎病毒1型和3型一步法多重RT-PCR检测方法的建立及其应用[D]. 王茜. 四川农业大学, 2018(02)