一、骨髓基质细胞的生物学特性及应用研究（论文文献综述）
齐嵘嘉[1]（2020）在《1.当归多糖逆转5-FU介导骨髓基质细胞成骨/成脂分化失衡的作用及机制研究 2.人参皂苷Rg1通过FOXO1转录因子预防D-半乳糖诱导的小鼠脂肪性肝病》文中认为骨髓造血抑制和以骨量丢失为主的骨质疏松症是化疗常见的副作用。骨髓基质细胞（Bone marrow stromal cells,BMSCs）中的干细胞群具有多向分化潜能,既可朝骨系细胞方向分化也可分化为脂肪细胞,成骨/成脂分化平衡是稳定造血微环境成骨细胞龛的必要条件,而成骨细胞龛对维持正向造血调控起着至关重要的作用。既往研究表明氧化应激会导致BMSCs降低成骨分化潜能而朝成脂方向分化,骨髓内成骨细胞及其前体细胞减少,骨髓腔脂肪化,其机制可能与氧化应激促进FOXO与β-catenin结合,激活FOXO转录,抑制β-catenin下游成骨相关因子转录、增强成脂相关因子转录相关。当归多糖（Angelica sinensis Polysaccharides,ASP）是传统中药当归的有效活性成分,具有抗氧化、促造血等功效。课题组前期研究证实ASP可减轻化疗药物5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-FU）对BMSCs的氧化损伤从而延缓造血细胞氧化应激性早衰。ASP对造血的保护机制是否与ASP减轻成骨细胞龛损伤有关目前尚不清楚。本研究以ASP为研究对象,建立人骨髓基质细胞体外药物模型和小鼠在体化疗药物模型,观察ASP对化疗后骨髓造血抑制的逆转作用,探讨具有抗氧化特性的ASP对造血的保护作用是否与其抑制氧化应激维持骨髓基质细胞分化平衡稳定成骨细胞龛的作用相关,并进一步阐明该作用机制是否与ASP调控FOXO/Wnt-β-catenin信号有关。本研究为深入探究ASP的药理作用以及减轻化疗损伤提供理论思路和实验依据。方法1.以具有多向分化潜能的人骨髓基质细胞细胞株（HS-5）为研究对象,应用5-FU、ASP和Li Cl建立体外药物模型,探讨当归多糖保护5-FU化疗损伤骨髓基质细胞成骨分化潜能、抑制成脂分化能力的作用,及其对β-catenin信号分子的调控作用。CCK-8检测5-FU对HS-5细胞的抑制率,后续实验选择浓度为25μg/m L的5-FU作用HS-5细胞48 h。实验分为对照组:常规培养;ASP组:常规培养基础上加入100μg/m L的ASP;5-FU组:常规培养基础上加入25μg/m L的5-FU;5-FU+ASP组:常规培养基础上加入浓度为100μg/m L的ASP预处理细胞,6 h后加入25μg/m L5-FU。5-FU+Li Cl组:常规培养基础上加入浓度为10 mmol/L的Li Cl预处理细胞,6 h后加入25μg/m L 5-FU,37℃培养48 h。流式细胞术检测HS-5细胞凋亡;细胞成骨诱导分化后茜素红检测成骨结节,测定成骨分化能力;细胞成脂诱导分化后油红O检测脂滴,测定成脂分化能力;Western blot检测HS-5细胞Runx2、PPARγ和β-catenin蛋白的表达;RTq PCR检测Runx2、Osterix、OCN、BMP-2、PPARγ及β-catenin基因的表达。2.采用化疗药物5-FU建立小鼠体内骨髓抑制模型,研究当归多糖预处理对化疗小鼠骨髓造血抑制和骨髓微环境损伤的保护作用及其机制。C57小鼠随机分为对照组:腹腔注射10 m L/kg/d生理盐水7天;ASP组:连续腹腔注射7天100 mg/kg/d ASP;5-FU组:连续腹腔注射6天10m L/kg生理盐水,第7天腹腔注射150 mg/kg 5-FU;5-FU+ASP组:连续腹腔注射6天100 mg/kg/d ASP,第7天同时腹腔注射100 mg/kg ASP和150mg/kg 5-FU。血细胞计数分析仪检测小鼠血液中红细胞、白细胞和血小板数量变化。无菌条件下取C57小鼠双侧股骨和胫骨,制备全骨髓细胞悬液,进行计数。4%多聚甲醛固定股骨,0.5%硝酸脱钙,石蜡切片HE染色光学显微镜下检测小鼠股骨形态学改变;免疫组化检测骨髓成骨细胞SDF-1因子表达。全骨髓法培养小鼠骨髓基质细胞,流式细胞术以及DCFH-DA荧光检测骨髓基质细胞内ROS水平,TBA法、WST-8法、可见光法分别检测骨髓基质细胞MDA含量,Mn SOD和CAT活力;Western blot和RT-q PCR法检测骨髓基质细胞成骨分化与成脂分化的相关指标以及FOXO与Wnt通路中关键信号分子。3.建立小鼠骨髓基质细胞体外药物模型检测成骨成脂分化能力。取C57小鼠股骨和胫骨骨髓细胞进行体外全骨髓细胞培养,贴壁传代至第三代时,细胞分为对照组:常规培养;ASP组:常规培养加入100μg/m L的ASP;5-FU组:常规培养加入25μg/m L 5-FU;5-FU+ASP组:ASP预培养细胞6 h,再加入25μg/m L 5-FU。37℃,5%CO2条件下培养48 h,进行成骨成脂诱导分化,检测成骨成脂分化能力。结果1.ASP可以减少5-FU诱导后HS-5细胞凋亡;ASP逆转5-FU对HS-5细胞成骨分化潜能的抑制:成骨诱导分化后成骨结节明显增多,促进成骨分化因子Runx2蛋白的表达,促进Runx2、Osterix、OCN和BMP-2成骨分化基因转录;ASP减轻5-FU对HS-5细胞成脂分化的促进作用:成脂诱导分化后脂滴明显减少,成脂分化因子PPARγ蛋白和基因表达均明显下降。ASP减轻5-FU对β-catenin表达的抑制,上调β-catenin的表达。2.ASP减轻5-FU诱发的小鼠骨髓抑制:ASP提升5-FU作用后外周血红细胞、白细胞和血小板数量,并加快外周血象恢复进程;ASP减轻5-FU作用后骨髓腔细胞数量下降,抑制骨髓脂肪化。ASP阻止5-FU诱导后小鼠股骨骨小梁稀疏、变短、间隙增大等损伤,促进股骨骨小梁长度以及宽度的恢复;ASP逆转骨髓内成骨细胞数量及造血细胞趋化因子SDF-1的表达。3.ASP可以拮抗5-FU对小鼠骨髓基质细胞抗氧化能力的削弱,增加细胞抗氧化能力,增强细胞Mn SOD、CAT活性,减少胞内活性氧（Reactive oxygen species,ROS）和脂质氧化标志物MDA含量。4.在小鼠骨髓基质细胞体外药物模型中,ASP预处理可以纠正5-FU介导的小鼠骨髓基质细胞分化失衡,诱导分化后的成骨结节显着性增多,脂滴明显减少。上调骨髓基质细胞成骨分化能力、下调成脂分化,成骨相关因子Runx2、OCN、BMP-2以及Osterix表达升高,而PPARγ表达降低。5.在体实验骨髓基质细胞的Western blot结果表明,ASP可以抑制5-FU对FOXO1的激活,ASP促进FOXO1的磷酸化,抑制FOXO1及其下游Bim和P27-Kip1的表达;ASP逆转5-FU介导的FOXO1对Wnt通路关键蛋白β-catenin的竞争性抑制作用,上调β-catenin、p-GSK-3β和Lef-1蛋白的表达,抑制GSK-3β的表达。结论1.ASP可以逆转5-FU所致的骨髓抑制,促进骨髓造血功能恢复。2.ASP可以减轻5-FU诱发的骨髓基质细胞氧化应激,增强骨髓基质细胞成骨分化能力,下调成脂分化水平,保持骨髓基质成骨/成脂分化平衡,维持成骨细胞龛稳定,促进造血。3.ASP维持骨髓基质细胞分化平衡的机制可能与减轻氧化应激,下调FOXO1进而激活Wnt/β-catenin信号,上调其下游成骨转录因子、抑制成脂转录因子有关。肝细胞衰老与多种慢性肝脏疾病的发展有关。衰老伴随非酒精性脂肪肝病（Non Alcoholic Fatty Liver Disease,NAFLD）发生,了解衰老驱动NAFLD的潜在机制和寻找有效的治疗方法来限制慢性肝脏疾病的发生与发展具有重要意义。人参是一种广泛用于治疗包括肝脏疾病在内的各种疾病的中药,有抗衰老和抗氧化等特性,Rg1是人参最有效的活性成分,本实验探究Rg1对衰老驱动慢性肝病的潜在保护作用及其相关机制。方法1.40只SPF级别健康C57BL/6雄鼠随机分为四组:对照组:腹腔注射10 m L/kg生理盐水;Rg1组:腹腔注射42天浓度为40 mg/kg/d的人参皂苷Rg1;Rg1+D-gal组:连续腹腔注射16天浓度为120 mg/kg/d的D-gal,第17天起连续腹腔注射26天浓度为40 mg/kg/d的人参皂苷Rg1;D-gal组:腹腔注射小鼠42天浓度为120 mg/kg/d的D-gal。称量小鼠体重以及肝脏湿重,计算各组小鼠肝脏指数;收集血清,微板法检测血清ALT和AST含量;制备肝脏匀浆,分别检测各组小鼠MDA、SOD和CAT含量。2.制备冰冻切片SA-β-gal染色检测肝脏衰老情况,油红O染色观察肝脏中的脂肪。透射电子显微镜观察肝脏超微结构,HE染色、高碘酸希夫染色和TUNEL凋亡染色对肝脏进行组织病理学研究。3.酶联免疫吸附测定肝脏匀浆中炎症因子IL-1β、IL-6和MCP-1的表达,免疫组织化学染色法检测肝脏FOXO1因子的表达,Western blot检测肝脏组织中P53、P21、FOXO1、p-FOXO1、Bcl-2、Bax和Bim蛋白的表达。结果1.Rg1减轻D-gal引起的肝损伤,下调肝脏指数,逆转D-gal诱导的血清ALT和AST异常升高。2.Rg1降低D-gal诱导的小鼠肝细胞衰老相关标志物SA-β-gal和衰老相关蛋白P53、P21蛋白的表达;Rg1减轻肝脂肪变性、肝葡萄糖生成减少、水样变性,减少衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype,SASP）包括IL-1β、IL-6和MCP-1炎症因子分泌和淋巴细胞浸润。3.Rg1抑制FOXO1磷酸化的急剧升高,维持D-gal作用后的肝脏FOXO1蛋白表达水平,增强FOXO1靶向超氧化物歧化酶（SOD）以及过氧化氢酶（CAT）活性,降低脂质过氧化标志物丙二醛（MDA）的含量。结论1.Rg1具有保持肝脏FOXO1活性的药理作用,增强肝细胞抗氧化能力。2.Rg1降低SASP抑制炎症,维持肝脏代谢稳态,保护肝脏免于衰老引起的肝脏脂肪变性疾病。
谢辉[2]（2019）在《新型多孔钽金属的制备及在股骨头坏死治疗中的应用》文中研究表明股骨头坏死是骨科尚未解决的难题,发病率逐年提高,致残率较高;尤其当股骨头坏死病变进展到中晚期,伴随股骨头软骨下微骨折及骨量的缺失,将导致股骨头塌陷,退变将不可逆。在保留股骨头手术方案中,骨科医生需要对即将失去完整结构、塌陷的股骨头进行修复及重建。传统经典的方法是采用自体带或不带血运髂骨或游离腓骨进行移植修复,但仍存在修复后生物力学强度不够及分布不均,再次塌陷不可避免。随着生物组织工程技术进步及新型生物材料研究的发展,有望为股骨头坏死后保髋治疗提供新的方式。基于组织工程技术三大要素,理想的骨组织工程支架材料应该具有以下特征:（1）具备稳定化学特征及良好的生物相容性,与组织体液无炎症反应:（2）支架材料具有与骨结构类似的力学性能,从而避免应力遮挡,特别是在弹性模量上与相应骨组织（0.01～30 GPa）越接近越好,同时具有足够的生物力学强度;（3）在空间结构上与骨组织类似,可为种子细胞提供有利的生长空间和物质交换场所。目前常用医用生物金属材料面临弹性模量高、孔隙率低、接触面摩擦系数低、易出现应力遮挡,造成宿主骨相应骨折及内植入物失效等问题。多孔钽金属（Porous tantalum）具有类似骨小梁结构,平均孔径在400～600μm之间,整体孔隙率为75%～85%,弹性模量与人体皮质骨结构相近,能更好地减少植入后应力遮挡,有利于骨重建及塑形。其相关产品在临床得到广泛应用,并取得了良好临床效果。但多孔钽金属材料制备技术被垄断,应用价格高昂,因而实现多孔钽金属国产化势在必行。本研究以多孔碳化硅材料为支架,应用化学气相沉积技术,制备新型多孔钽金属材料,并进行初步的生物性评价;开展了多孔钽金属材料复合骨髓基质干细胞修复骨坏死的实验研究,并在临床对股骨头坏死患者进行治疗,综合评价新型多孔钽金属的生物学特性及在股骨头坏死治疗中的临床疗效,具体内容如下:1.以多孔碳化硅为支架材料应用化学气相沉积（Chemical Vapor Deposition,CVD）技术将钽金属沉积在其表面形成国产新型多孔钽金属材料,采用超景深三维数字显微系统观察碳化硅支架材料在涂层前后表面金属形态特征,及扫描电镜和EDX能谱分析确定钽金属涂层厚度及钽元素能谱分析证实新型多孔钽金属制备工艺,成功制备出新型国产多孔钽金属。制备过程证实了最佳的氢气流量为150mL/min,最佳基体反应温度为900℃,沉积时间为10小时。采用化学气象沉积技术能够将钽金属均匀沉积到多孔碳化硅支架孔隙表面,涂层与碳化硅基体的结合力良好。新型多孔钽金属不仅具备理想的孔隙率率及三维互通的网状结构,有具有与骨组织相匹配的力学性能。2.通过原代提取兔骨髓基质干细胞（BMSCs）进行分离、培养,应用流式细胞检测仪检测细胞表面CD45、CD44及CD34蛋白,进行BMSCs特异性抗原鉴定。分别将BMSCs与钽金属浸提液、正常培养基及多孔钽金属材料共培养7天,分别观察1、3、5、7天细胞生长、增殖曲线,发现1、3、5天三组间无明显差异,7天时钽金属共培养组高于其他两组,具有统计学意义。采用MTT法测定三组间细胞生长、增殖情况,反映多孔钽金属具有良好的细胞相容性。应用扫描电镜观察BMSCs在多孔钽金属支架材料上粘附、生长及增值情况,联合培养至第7d,相邻细胞间突触交织融合,粘附爬行相互连接,多孔钽金属表面完全被细胞所覆盖,并可见多孔钽金属孔隙内部充满细胞,并分泌基质覆盖在材料表面。另外将多孔钽切割制作成直径为0.5cm、长0.7cm大小的圆片状,植入兔背部筋膜及肌肉处,观察多孔钽植入后与周围结缔组织纤维相容性。12周后,发现多孔钽被结缔组织包围,局部没有红肿、破溃、流脓等炎症反应和肿瘤形成。Van Gieson染色结果表明,皮下植入的多孔钽完全整合到结缔组织中,无免疫排斥反应。证实了新型多孔钽支架材料具有良好体内体外生物相容性,进而可为下一步进行骨植入提供可靠的理论基础。3.针对BMSCs具有向成骨细胞转化的潜力和特性,体外培养骨髓基质干细胞结合多孔钽形成复合体,植入兔股骨坏死区域,观察其改善成骨以及骨修复的情况。首先通过体外实验我们采用骨髓基质干细胞分别与多孔碳化硅、多孔钛金属和自制新型多孔钽金属共同培养,7天培养后与多孔钽支架组的细胞增殖均高于Ti合金和SiC支架组（P<0.05）;通过细胞的成骨诱导,并经茜素红染色和碱性磷酸酶钴钙法染色进一步验证了所提取、培养的细胞符合干细胞具有成骨分化的特性;将骨髓基质干细胞与多孔钽支架复合培养,细胞数量随着复合培养的天数也不断增加。两周后,可荧光定量PCR检测到多孔钽金属复合培养组的骨钙素、骨桥蛋白表达增高,证实了多孔钽金属具有一定促进骨生成作用;在体内实验中,制备成激素型骨坏死模型并多孔钽金属及复合细胞后植入修复骨坏死,进行植入物周围骨组织免疫组织化学染色,结果显示两组间骨组织内均有不同程度的BMP-2和VEGF表达,在骨髓、微血管周围及周围骨组织内可见黄褐色颗粒,其中多孔钽金属联合BMSCs组深染,表达较明显,12周时强烈表达,多孔钽金属联合BMSCs组明显高于对照组,有明显差异,具有统计学意义（P<0.05）;硬组织切片结果显示在单纯植入多孔钽12周后,多孔钽的孔隙几乎全部被新生的类骨质所填充,多孔钽联合BMSCs共培养组,可见再生的骨小梁（红色）在多孔钽的内部。通过此次试验再次证明了新型多孔钽金属具有良好的生物相容性,符合骨植入材料的基本要求;动物试验结果表明多孔钽金属联合骨髓基质干细胞修复骨坏死取得了良好的效果,可为治疗中晚期骨坏死提供一些思路和选择。4.应用新型多孔钽棒复合骨髓基质干细胞联合带血管蒂髂骨瓣转移方法对青壮年股骨头缺血性坏死病人进行了保留股骨头的手术治疗,在明确骨髓基质干细胞具有促成骨作用,多孔钽金属棒具有诱导骨生长及生物力学支撑的情况下,研究联合带血管蒂髂骨瓣转移治疗股骨头坏死,对中晚期的年轻股骨头坏死病人进行了治疗,取得了满意的疗效,研究结果发现新型多孔钽棒复合骨髓基质干细胞联合带血管蒂髂骨瓣转移有效的清除了股骨头内坏死骨,促进了股骨头内新骨再生,提供了可靠的血供及生物力学支撑,预防塌陷的进一步发生,并且不增加手术的并发症。
蒋敏[3]（2019）在《NF-κB信号通路在慢性淋巴细胞白血病中的作用和机制探讨》文中提出慢性淋巴细胞白血病是一种单克隆B淋巴细胞在外周血、骨髓和外周淋巴组织或器官中聚集的疾病。NF-κB是一种具有多向性转录调节作用的蛋白质因子家族。研究发现,CLL细胞中NF-κB活性可呈一定程度的增强,NF-κB表达和活性的变化与CLL细胞的生存率之间存在密切的联系,但CLL中NF-κB活化的具体机制至今尚不清楚。本研究选择由苏州大学附属第一医院血液科明确诊断的CLL患者的骨髓标本作为研究对象,对NF-κB家族成员mRNA表达水平进行分析,发现骨髓来源CLL细胞中NF-κB家族各成员在CLL细胞中存在不同程度的表达。NF-κB的DNA结合活性分析发现,CLL患者骨髓细胞中NF-κB活性具有异质性。定量分析显示,CLL患者骨髓B细胞的平均RelA活性明显高于正常人B细胞。CLL患者骨髓B细胞与正常人B细胞的RelB活性无显着性差异。RelB活性在不同CLL患者中差异显着。RelB在CLL-B细胞中确实存在,但只在部分CLL-B细胞中升高。对不同NF-κB活性的CLL患者进行临床特征性分析,发现RelA高表达、RelB低表达的患者,常处于疾病早期,且IgHV为突变状态,提示预后较好。将CLL-B细胞在有骨髓基质细胞和无基质细胞两种条件下进行培养,通过流式细胞术对不同NF-κB活性的CLL-B细胞死亡率进行分析,结果发现,无论有无骨髓基质细胞存在,RelA+/RelB+组生存率均高于RelA+/RelB-组。RelB活性增强,同时有RelA活性,标志着骨髓中CLL-B细胞的生存优势。CLL-骨髓基质细胞共培养诱导CLL-B细胞RelA和RelB的表达。通过探讨RelB活性与CLL患者对氟达拉滨和蛋白酶体抑制剂（PS-341,MG-132）的敏感性的关系,发现CLL-B细胞对氟达拉滨的敏感性与RelB活性无关。RelB的活化使CLL-B细胞对蛋白酶体抑制剂的反应性增强。与MG-132相比,PS-341诱导CLL-B细胞的死亡率更高。NOTCH1和MYD88基因突变介导NF-κB活化,与CLL化疗耐药和不良预后相关。在本研究中,我们建立了一个准确而灵敏的HRM法,检测出6.02%（8/133）的CLL患者存在NOTCH1的PEST区域的基因突变,而8例突变患者中有7例的熔解曲线完全相同,经直接测序法证实为c.75417542delCT（p.P2514fs*4）突变,1名患者的熔解曲线与前7例也存在不同,经直接测序法被确认为c.75357536 insC（p.2513fs*3）突变。4.65%（6/129）的CLL患者具有与野生型完全不同的熔解曲线,经直接测序法证实存在MYD88 p.L265P突变。所有CLL标本均经过直接测序法进一步验证,结果发现,HRM结果与直接测序法完全一致,准确性达到100%。通过分析HRM法和直接测序法的敏感性进行比较,发现直接测序法和HRM法的敏感性分别为10%和1%,HRM法的敏感性优于直接测序法。我们建立的NF-κB通路相关分子NOTCH1和MYD88基因的HRM突变检测方法有效、快速、敏感,与直接测序法相比,它具有更高的敏感度、更短的检测时间,非常适用于常规进行CLL患者基因突变的高通量筛查,有助于患者个体化临床治疗策略的制定和确认。第一部分经典性和非经典性NF-κB活性在慢性淋巴细胞白血病中的作用目的:分析CLL中经典和非经典性NF-κB信号通路的活性和表达。方法:1,采用qRT-PCR法检测CLL患者骨髓中B细胞的NF-κB家族成员的mRNA表达水平,并与正常人骨髓来源的B细胞进行比较。2,通过凝胶迁移实验和NF-κB DNA结合实验对CLL细胞中NF-κB的DNA结合活性分别进行定性和定量分析。3,对不同NF-κB活性的CLL患者进行临床特征性分析。结果:1,NF-κB家族各成员在CLL细胞中存在不同程度的表达。所有CLL患者的B细胞中均存在RelA mRNA的表达。p50、RelB和p52的mRNA表达在CLL患者中存在差异,部分患者未测出。2,凝胶迁移实验发现部分CLL患者骨髓细胞中CD19+CD5+细胞核蛋白检测到很强的κB-DNA结合活性;部分患者κB-DNA结合活性弱,还有一些几乎检测不到κB-DNA结合活性。NF-κB DNA结合实验定量结果显示,CLL患者骨髓细胞平均RelA活性明显高于正常人的B细胞。CLL患者骨髓B细胞与正常人B细胞RelB活性无显着性差异。RelB活性在不同CLL患者中差异显着。RelB在CLL-B细胞中确实存在,但只在部分CLL-B细胞中升高。3,不同NF-κB活性的CLL患者临床特征分析发现,RelA高表达、RelB低表达的患者,常处于病程早期并伴有IgHV突变状态,提示预后较好。RelB活性与细胞的遗传学改变、ZAP-70和CD38的表达,NOTCH1基因突变与否无相关性。结论:CLL患者骨髓B细胞中均有RelA mRNA的表达,部分的CLL-B细胞中有RelB mRNA的表达。不同CLL-B细胞中RelA mRNA和RelB mRNA表达水平不同;CLL患者骨髓细胞平均RelA活性明显高于正常人的B细胞,CLL患者骨髓B细胞与正常人B细胞RelB活性无显着性差异,RelB活性在不同CLL患者中差异显着;RelA高表达,RelB低表达的患者与IgHV突变呈正相关,预后较好。第二部分非经典途径NF-κB分子活性影响CLL细胞对蛋白酶体抑制剂的敏感性目的:研究不同NF-κB信号通路活性对CLL细胞体外存活的影响以及对蛋白酶体抑制剂的敏感性。方法:1,将CLL-B细胞在有骨髓基质细胞和无基质细胞两种条件下进行培养,采用流式细胞术在0、24、48和72 h分别检测CLL细胞死亡率。2,采用Western blot法检测共培养后CLL-B细胞中RelA和RelB的表达。3,CLL-B细胞分别与氟达拉滨以及蛋白酶体抑制剂MG-132和PS-341共同孵育,共培养0、24、48和72 h,采用流式细胞术检测CLL细胞的死亡率。结果:1,无骨髓基质细胞参与情况下:RelA+/RelB-组骨髓中的CLL-B细胞比RelA+/RelB+组中的细胞早24 h开始死亡。存在骨髓基质细胞进行培养情况下,RelA+/RelB-组死亡率均高于RelA+/RelB+组,差异有显着性。无论有无骨髓基质细胞存在,RelA+/RelB+组生存率高于RelA+/RelB-组。2,骨髓基质细胞与CLL-B细胞相互作用,诱导RelA+/RelB-组骨髓CLL-B细胞中RelA和RelB的表达,并呈时间依赖性。在RelA+/RelB+组,骨髓基质细胞与CLL-B细胞相互作用,RelB在细胞浆中的表达降低,但RelB在细胞核中的表达显着增强。3,在RelA+/RelB+和RelA+/RelB-组间,不管是否存在骨髓基质细胞,使用氟达拉滨治疗下,两者细胞的死亡率差异无统计学差异（P>0.05）。4,加入1μM MG-132后,与骨髓基质细胞共培养24h和48 h时,RelA+/RelB+组的细胞死亡率高于氟达拉滨,差异有显着性（P<0.05）;而RelA+/RelB-组无此情况（P>0.05）;骨髓基质细胞对 RelA+/RelB+和 RelA+/RelB-组 B细胞在MG-132治疗中起到保护作用。无论骨髓细胞存在与否的条件下,RelA+/RelB-组的CLL-B细胞对MG-132的敏感度均偏低。5,在有骨髓基质细胞或无骨髓基质细胞共培养情况下,PS-341处理后,各时间点CLL-B细胞的死亡率明显高于氟达拉滨和 MG-132（P<0.05）。培养 24 h 和 48 h 后,在 RelA+/RelB+组,PS-341 诱导细胞死亡率高于RelA+/RelB-组（P<0.05）,且与骨髓基质细胞存在与否无关,骨髓基质细胞对PS-341治疗下细胞的保护仅发生在24 h。结论:1,RelB活性增强,同时有RelA活性,标志着骨髓中CLL-B细胞的生存优势。2,CLL-骨髓基质细胞共培养,诱导CLL-B细胞的RelA和RelB表达,这是骨髓基质细胞发挥保护作用的原因。3,骨髓中CLL-B细胞对氟达拉滨的敏感性与RelB无关。RelB的活化使CLL-B细胞对蛋白酶体抑制剂的反应性增强。与MG-132相比,PS-341诱导CLL-B细胞的死亡率更高。第三部分与NF-κB活性相关分子NOTCH1基因突变的HRM检测方法的建立及其意义目的:建立筛查NOTCH1突变的HRM方法并探讨NOTCH1突变在CLL中突变的意义。方法:采集133例CLL患者骨髓,提取CLL-B细胞gDNA。同时培养急性淋巴细胞白血病细胞Molt 4细胞和急性T细胞白血病细胞系Jurkat细胞,作为NOCH1突变的阳性和阴性对照,建立HRM法筛查CLL患者中NOTCH1的突变情况,并与直接测序法进行比较,并对HRM法进行敏感性和准确性的评估。结果:在133例初诊为CLL的患者中,6.02%（8/133）的患者与其余125例其他患者的熔解曲线有明显差异。其中7位患者的熔解曲线一致,经直接测序法确认为c.75417542delCT（p.P2514fs*4）突变。1名患者的突变完全不同,经直接测序法被确认为c.75357536 insC（p.2513fs*3）突变。HRM分析检测到的突变的结果与直接测序的结果是完全一致的,准确性达到100%,直接测序法和HRM法的敏感性分别为10和1%,HRM法的敏感性优于直接测序法。结论:HRM法通过产生的不同熔解曲线来分辨CLL患者NOTCH1野生型和突变型的标本,结果经直接测序法证实为可靠,且灵敏度较高,可以作为临床筛查慢性淋巴细胞白血病NOTCH1基因突变的常规检查方法。第四部分与NF-κB活性相关分子MYD88基因突变的HRM检测方法的建立及其意义目的:建立筛查MYD88突变的HRM方法并探讨MYD88突变在CLL中突变的意义。方法:采集129例CLL患者骨髓,提取CLL-B细胞gDNA,采用TA克隆法制备MYD88野生型质粒,采用定点突变法制备MYD88突变型质粒,分别作为阴性和阳性对照,建立HRM法筛查CLL患者中最常见的MYD88 p.L265P的突变,并与直接测序法进行比较,并对HRM法进行敏感性和准确性的评估。结果:通过HRM法,发现129例标本中有6例出现MYD88 p.L265P突变,突变率4.65%。结果与直接测序法完全一致,准确性达到100%。直接测序和HRM的敏感性分别为10和1%,HRM法的敏感性优于直接测序法。结论:HRM与直接测序法比较,有较高的敏感度,操作简便,耗时少。HRM法可以作为临床筛查CLL中MYD88 p.L265P突变的常规检查方法。
刘阳[4]（2011）在《骨髓基质干细胞的生物学特性及对胶质瘤的趋向效应的实验研究》文中研究表明神经系统肿瘤疾病中胶质瘤的发病率最高,约占40～50%。尽管临床的综合治疗方案能产生一些疗效,但胶质瘤的预后仍然很差。基因治疗的出现为我们展示了良好的前景。但由于病毒载体自身毒性、目的基因表达周期短、靶向性问题、免疫源性或者不能选择到合适的追踪浸润瘤细胞载体等原因,在I期和II期临床试验都未能取得预期的疗效。骨髓基质干细胞作为一种新型的载体出现引起了科学工作者的关注,它培养方法简单成熟,具有多向分化潜能和定向迁移能力,而且外源性基因表达稳定,来源安全可靠,没有伦理学困扰,因此能够选作为种子细胞进行靶向治疗。骨髓基质干细胞的分离培养鉴定分化等生物学特性研究是各项干细胞实验的基础,也是研究的热点和难点。在体内干细胞向神经元方向分化的比例相当低。这就需要给予合适的诱导策略增加其神经方向的分化率。碱性成纤维细胞生长因子的诱导血管生成,促进有丝分裂等生物学作用较显着。体内研究中由于外源性因子的导入困难,而应激条件下被激活的内源性碱性成纤维细胞生长因子表达有限,所以骨髓基质干细胞分化为神经细胞修复整合受伤的神经网络的功能有限,因此将相关基因导入骨髓基质干细胞使其能够持续稳定的表达有助于神经系统损伤的治疗。骨髓基质干细胞能够选择性趋向体内各损伤部位,他的这种归巢性被认为是其发挥肿瘤治疗作用的重要基础。而且骨髓基质干细胞能够通过多种机制治疗脑肿瘤。骨髓基质干细胞体外所处环境与体内微环境不同,目前在体外模拟体内环境条件下干细胞对胶质瘤细胞趋向效应的研究较少。考虑到未来临床使用的可操作性问题,应该选择经何种途径移植干细胞治疗胶质瘤才能达到最大效果。在脑胶质瘤的发生发展的病理过程中常有一些相关特异性因子参与,这些因子的表达变化可以作为胶质瘤治疗效果的评估指标。葡萄糖转运蛋白-3被认为是脑恶性肿瘤糖代谢的第一个限速因子,缺氧诱导因子-1α是恶性肿瘤参与肿瘤血管生成、肿瘤细胞代谢、凋亡的重要核转录因子。目前对这几种因子在中枢神经系统肿瘤中的共同表达研究甚少。基于此,我们进行以下研究。第一部分骨髓间充质干细胞的生物学特性研究目的:研究骨髓间充质干细胞的生物学特性。方法:对BMSCs进行体外分离培养诱导分化,并免疫组化,流式细胞术,免疫荧光鉴定。构建bFGF过表达载体并测序,慢病毒包装后转染BMSCs,分别在体外体内通过形态学,免疫组化,免疫荧光,western blot,PCR,观察bFGF基因修饰后的骨髓基质干细胞增殖、分化及迁移效应的情况。结果:BMSCs分离接种24h后,可见细胞贴壁,3d以后,进入细胞对数生长期。1W左右,可观察到细胞逐渐增多并形成突起相互联系,生长速度减慢。培养12d后,细胞达到融合成片铺满瓶底。实验组细胞数量与未经诱导组相比有显着统计学差异（P<0.05）;免疫细胞化学方法检测发现CD44,CD29,CD90,CD105染色的细胞胞浆呈现棕黄色。CD44阳性细胞率为92.0±3.2%,CD29阳性细胞率为94.6±4.8%,而CD45,CD11b,CD34染色的细胞胞内几乎没有表达;流式细胞术检测细胞表面标记可见CD90为99.64%,CD34为1.23%,CD44为99.54%,CD11b为0.43%;BMSCs经诱导分化3d后表达Nestin抗原,7d后细胞表现出典型的神经元样改变,检测到来源于BMSCS的部分细胞可分别表达NeuN和GFAP。NSE、NeuN、GFAP免疫反应阳性细胞的比例在培养的早期随时间延长而逐渐增多。但到1W后,比例逐渐降低。经诱导的组别的NeuN阳性细胞明显多于对照组（P<0.05）。载体构建和病毒包装实验中,筛选酶切后得到pUC57-SL08重组质粒酶切后的SL08片段。将SL08片段克隆入pLenti6/V5-D-TOPO得到pLenti6-SL08重组质粒,对重组质粒进行测序,鉴定成功构建bFGF的过表达载体,慢病毒滴度定量测得为3×107v.p./ml。pLenti6-SL08转染大鼠骨髓基质干细胞48 h后,通过Western blot与RT-PCR检结果发现各组均有bFGF基因的表达,bFGF基因修饰的BMSCs组中bFGF表达效果最明显。体外培养实验中,基因转染后BMSCs各组细胞24小时后细胞数量开始增加,48至72小时后,细胞数量均显着增多,pLenti6-SL08组细胞数量多于其他两组,但各组间数量无显着差异（P>0.05）,7天左右均可见有明显神经元样改变细胞出现,此时三组细胞数量增长均显着放缓,但是pLenti6-SL08组细胞数量显着多于其他两组（P<0.05）,其他两组间细胞数无明显差异（P>0.05）。流式细胞术结果显示,pLenti6-SL08组CD90 96.44%,CD34 0.61%,BMSCs-2组CD44 99.95%, CD11b0.73%。细胞体外培养到一周后,3组细胞均见大部分细胞出现明显神经元样改变。pLenti6-SL08组神经元样改变细胞数量与其他两组比有显着差异（P<0.05）。pLenti6-SL08载体转染大鼠骨髓基质干细胞48 h后,通过Western blot与RT-PCR检测bFGF表达,证明经bFGF修饰的骨髓基质干细胞组的bFGF基因表达明显强于其他两组,转染结果可靠。培养7天后免疫细胞组织化学方法发现三组细胞中均可见Nestin, NeuN, GFAP的表达。pLenti6-SL08组细胞的Nestin, NeuN表达显着多于其他两组（P<0.05）。Western blot检测pLenti6-SL08组Nestin, NeuN均显着高于其他两组（P<0.05）,而其他两组间Nestin, NeuN的表达无明显差异（P>0.05）。脑创伤体内模型中,免疫组织化学结果显示:各时间点损伤侧BrdU阳性细胞多于对侧（P <0.001）,而且经bFGF修饰BMSCs组在各时间点阳性细胞均多于未经修饰组（P <0.001）;1W后所检出的BrdU阳性细胞开始减少,但在损伤同侧部位bFGF修饰BMSCs组降低幅度要小的多（P =0.08）。Western blot检测各组脑组织不同时间点bFGF的表达情况发现实验组,对照组不同时间点bFGF表达有显着差异（P<0.05）。实验组bFGF7d时明显增高（P<0.05）,14d时虽下降但无统计差异（P =0.12）;对照组bFGF7d时明显增高（P<0.05）,14d时显着下降（P<0.05） ;各时间点bFGF在实验组表达强于对照组（P<0.05）。免疫荧光双标实验中发现两组干细胞移植到脑内后均可以表达干细胞标记的BrdU,并且同样能够分化为神经元和神经胶质细胞,但分化为神经胶质细胞的比例远大于神经元。同侧脑室、皮质区域可见BMSCs组和bFGF修饰BMSCs组均有大量BMSCs分布,两组间有显着差异（P<0.05）;在同侧脑室、皮质区域可见bFGF修饰BMSCs组干细胞分化为神经元显着多于BMSCs组（P<0.05）。结论:骨髓基质干细胞体外分离培养可以得到高纯度的骨髓基质干细胞,bFGF修饰的骨髓基质干细胞在体内外均能稳定持续地增殖和神经细胞方向的分化,而且能更显着地向脑外伤后的损伤部位迁移。第二部分骨髓基质干细胞对胶质瘤细胞的趋向效应目的:研究骨髓基质干细胞在体外和体内向胶质瘤细胞的趋向及对胶质瘤细胞的抑制效应。方法:通过免疫组化,Western blot评估GLUT-3、HIF-1α是否可作为评估胶质瘤生物学行为的指标之一。然后模拟体内环境,采用Transwell、MTT、平板克隆等方法观察预处理的BMSCs对胶质瘤细胞的趋向、抑制等方面效应,然后构建大鼠C6胶质瘤模型,经不同途径移植BMSCs,通过行为学,形态学,组织病理学,分子生物学等方法观察BMSCs对胶质瘤细胞的趋向、抑制效应。结果:免疫组化方法检测发现GLUT-3、HIF-1α其表达强度随胶质瘤的病理分级增加而升高（P<0.001）。western blot检测两者的表达与免疫组化结果相似。体外实验部分:我们观察到C6细胞生长迅速,传代后细胞增殖速度依然很快。在Transwell共培养体系中预处理和未经预处理的BMSCs分别与C6胶质瘤细胞共培养,HE染色方法发现两组小室内膜上均有大量细胞通过,实验组通过小孔的细胞数量多于对照组（P<0.001）。MTT结果显示用含有普通骨髓基质干细胞上清液培养的C6细胞生长增殖速度明显高于预诱导骨髓基质干细胞上清液培养的C6细胞组（P<0.05）。平板克隆实验结果显示,对照组上清液培养的C6细胞形成的克隆数多于实验组（P<0.05）。这两组用Western blot检测发现预处理骨髓基质干细胞培养液组GLUT-3和HIF1α表达明显被抑制（P<0.05）。体内实验:发现对照组最早出现颅内压增高症状症状,且很快加重,BMSC-1组最晚出现以上症状。对照组第3天时即开始出现死亡病例,BMSC-1组存活时间最长为45天,各组生存率有显着差异（P<0.05）。HE发现胶质瘤细胞十分密集,向正常脑组织浸润,正常组织区别明显,细胞小核大,多见核分裂相,有明显的癌巢。对照组肿瘤体积最大,经脑室组最小（P<0.05）。BrdU免疫组化染色结果显示:骨髓基质干细胞在通过侧脑室移植入鼠脑胶质瘤模型后,干细胞在脑室周围,血管和海马等处分布较明显,主要集中在胶质瘤的边缘部位或与临近组织处交接范围。肿瘤同侧半球中的表达高于肿瘤内部表达（P <0.001）。同侧半球分布明显多于对侧半球分布（P <0.001）。经尾静脉途径移植组发现BrdU阳性细胞主要集中在肿瘤所在半球的血管和肿瘤周边,在肿瘤内、脑室附近及对侧半球极少,肿瘤同侧半球中的表达多于肿瘤内部表达（P <0.001）,同侧半球分布明显多于对侧半球分布（P <0.001）。两组相比较,经侧脑室移植途径肿瘤内部BrdU阳性细胞多于尾静脉途径移植组（P <0.001）在肿瘤同侧半球的阳性细胞也明显多于尾静脉途径移植组（P <0.001）,对侧半球阳性细胞也多于尾静脉组（P <0.001）。Western blot检测显示在BMSCs-1、BMSCs-2组及对照组中GLUT-3,HIF1α的表达分别成递增趋势（P<0.05）。RT-PCR检测与Western blot相似, GLUT-3和HIF1α的表达也均成递增趋势（P<0.05）。结论:初步证实了GLUT-3和HIF1α是参与胶质瘤发病机制的重要因子,在体外经预诱导处理的骨髓间充质干细胞对胶质瘤细胞的趋向性更强,可抑制脑胶质瘤细胞的增殖,降低GLUT-3和HIF1α的表达,体内经脑室移植途径干细胞能更多地向胶质瘤迁移,能明显抑制瘤体增大,降低GLUT-3和HIF1α的表达和改善预后。
周云丽[5]（2010）在《神经激肽受体-1与乳腺癌侵袭转移的相关性研究》文中研究表明研究目的：通过检测乳腺癌组织和乳腺癌细胞系中全长型神经激肽受体-1（Neurokinin-1receptor Fulllength, NK1R-FL）和截短型神经激肽受体-1（Neurokinin-1receptor Truncated, NK1R-Tr）的表达,并研究二者对乳腺癌细胞生物学行为的影响,探讨NK1R-FL和NK1R-Tr与乳腺癌侵袭转移的相关性,判断NKIR-Tr是否具备癌基因的特性；利用乳腺癌细胞和人骨髓间充质干细胞的体外共培养系统,分析NK1R表达的变化对促进乳腺癌细胞在骨髓中长入的作用；判定TGF-β、SDF-1α是否通过调节NKIR-Tr表达,维持乳腺癌细胞在进入骨髓基质早期的静息状态,为乳腺癌骨转移的靶向和预防性治疗提供参考。研究方法：本课题分四部分进行研究：第一部分：用免疫组织化学法检测41例乳腺癌组织、30乳腺良性病变和20例正常乳腺组织的NK1R和NK1R-FL的表达,并对不同分型、分期和有无淋巴结转移的乳腺癌组织NK1R和NK1R-FL的表达进行分析比较；用Real-time PCR和Western Blot法对人乳腺癌细胞系MDA-MB-231、T-47D、MCF-7、SK-Br-3、非肿瘤源性的人乳腺上皮细胞HBL-100和人骨髓间充质干细HMSC-bm的NK1R-FL、 NK1R-Tr基因和蛋白表达水平进行检测分析,同时应用Real-time PCR和Western Blot/ELISA法检测上述细胞系的NK2R和SP表达。第二部分：建立NKIR-Tr稳定过表达的HBL-100-NK1R-Tr细胞和NK1R-FL稳定过表达的MDA-MB-231-NK1R-FL细胞,用Real-time PCR和Western Blot法对两个细胞株NK1R-FL和NKIR-Tr的基因和蛋白表达进行鉴定；以未转染和pEGFP-C2空载体转染的MDA-MB-231细胞和HBL-100细胞为对照,NK1R-Tr和NK1R-FL的稳定过表达细胞株进行细胞生长曲线分析、细胞周期测定、用体外细胞粘附试验和Transwell小室体外侵袭与迁移试验；用Real-time PCR和Western Blot法测定NK1R-Tr和NK1R-FL的稳定过表达细胞株NK2R基因和蛋白的表达水平,用MTS/PMS法和软琼脂集落形成试验检测在NK1R和NK2R受体拮抗剂存在下其增殖和锚定非依赖性生长情况；荧光标记NKIR-Tr细胞和NK1R-FL过表达细胞,注射裸鼠的尾静脉,用小动物活体成像系统对裸鼠进行肺、肝和骨转移活体检测,切除裸鼠的肺和肝组织,石蜡切片进行HE染色,分析肺和肝转移情况。第三部分：建立高转移性的乳腺癌细胞MDA-MB-231和人骨髓间充质干细胞HMSC-bm的共培养体系,在共培养的不同汇合状态,分离乳腺癌细胞,用Real-time PCR、Western Blot和流式细胞术的间接免疫荧光法检测NK1R-FL、 NK1R-Tr的基因和蛋白表达水平,并进行分析。第四部分：应用RNA干扰技术,构建MDA-MB-231-SDF-1αⅠ和MDA-MB-231-TGF-β1Ⅰ稳定表达抑制细胞株,用Real-time PCR法和ELISA法分别对稳定株的SDF-1α和TGF-β1的基因和蛋白蛋白表达抑制情况进行鉴定;用Real-timePCR法和ELISA法分别测定的MDA-MB-231细胞、HBL-100细胞、HBL-100-NKlR-Tr和HMSC-bm细胞SDF-1α的分泌表达；建立MDA-MB-231-SDF-1αⅠ和HMSC-bm的共培养体系,荧光显微镜下观察细胞生长情况,在培养汇合早期分离MDA-MB-231-SDF-1αⅠ细胞,用Real-time PCR法和Western Blot法检测分离前后NK1R-FL和NK1R-Tr的表达情况；在共培养体系中分别加入人重组的SDF-1α因子或SDF-1α中和抗体,分离MDA-MB-231-SDF-1αⅠ细胞,检测NK1R-FL和NK1R-Tr的表达情况；用Real-time PCR法和ELISA法分别测定的MDA-MB-231细胞、HBL-100细胞、HBL-100-NK1R-Tr和HMSC-bm细胞TGF-β1的分泌表达,荧光显微镜下观察细胞生长情况,并在培养汇合早期分离MDA-MB-231-TGF-β1Ⅰ细胞,用Real-time PCR法和Western Blot法检测分离前后NK1R-FL和NK1R-Tr的表达情况；在共培养体系中分别加入人重组的TGF-β1因子或TGF-β1中和抗体,分离MDA-MB-231-TGF-β1Ⅰ细胞,检测NK1R-FL和NK1R-Tr的表达情况。研究结果：第一部分：（1）乳腺癌临床组织标本研究结果显示：乳腺癌组织NK1R的表达与乳腺良性病变和正常乳腺组织相比差别无统计学意义,且不同乳腺癌分型、分期和有无淋巴结转移的乳腺癌组织NK1R的表达差别均无统计学意义（P>0.05）；乳腺癌组织NK1R-FL表达与正常乳腺癌组织相比显着降低,且在浸润性导管癌和导管内癌组织中均降低,在浸润性导管癌中下降更为显着（P<0.05）；不同分期乳腺癌组织NK1R-FL表达与正常乳腺癌组织相比均显着降低,且随组织分期的升高而逐渐降低（P<0.05）；有、无淋巴结转移的乳腺癌组织NK1R-FL表达均显着低于正常乳腺组织（P<0.05）,且有淋巴结转移的乳腺癌组织NK1R-FL表达降低更为显着。（2）对不同的乳腺癌细胞系、非肿瘤源性的乳腺上皮细胞系和人骨髓间充质干细胞的研究结果显示：所有细胞均表达NK1R-Tr基因和蛋白,但MDA-MB-231细胞、T-47D和MCF-7细胞只表达NKIR-Tr基因和蛋白,且其表达水平显着高于SK-Br-3细胞、HBL-100细胞和HMSC-bm细胞（P<0.05）;SK-Br-3细胞低表达NK1R-FL基因和NK1R-Tr基因；HBL-100细胞和HMSC-bm细胞均高表达NK1R-FL基因和蛋白,其表达水平显着高于SK-Br-3细胞（P<0.05）;SK-Br-3细胞NK1R-Tr基因和蛋白表达与HBL-100细胞和HMSC-bm细胞无显着性差别。HBL-100细胞的PPT基因和SP的分泌表达均显着高于其它各组细胞（P<0.05）,其它各组细胞间无显着性差别（P>0.05）。相较于NK1R-FL和NKIR-Tr基因和蛋白,各组细胞均低表达NK2R基因和蛋白,HBL-100细胞和HMSC-bm细胞的NK2R表达高于MDA-MB-231细胞、T-47D、MCF-7和SK-Br-3,但无显着性差别（P>0.05）。第二部分：（1）构建了能稳定过表达NK1R-FL和NK1R-Tr基因的MDA-MB-231和HBL-100细胞株,用Real-time PCR和Western Blot法对两个细胞株NK1R-FL和NK1R-Tr的进行鉴定：MDA-MB-231-NK1R-FL细胞与MDA-MB-231细胞相比,NK1R-FL明显表达；HBL-100-NKlR-Tr比HBL-100细胞NK1R-Tr表达上升1.9倍。（2）细胞生长曲线分析表明：与未转染和pEGFP-C2空载体转染的MDA-MB-231细胞相比,MDA-MB-231-NK1R-FL细胞的生长速度明显降低（P<0.05）;与未转染和pEGFP-C2空载体转染的HBL-100细胞相比,HBL-100-NK1R-Tr细胞生长速度加快,但差别无显着性（P>0.05）。细胞周期测定结果表明：与未转染和空载体转染的细胞相比,MDA-MB-231-NK1R-FL细胞的G1期百分比显着升高、G2和S期细胞百分比显着下降,HBL-100-NKlR-Tr细胞的G1期百分比下降,G2和S期细胞百分比升高但变化不显着。Matrigel胶的体外细胞粘附试验显示：与未转染和空载体转染的细胞相比,MDA-MB-231-NK1R-FL细胞的粘附率显着下降（P<0.05）,HBL-100-NK1R-Tr细胞粘附率显着升高（P<0.05）。Transwell小室体外侵袭与迁移实验结果均显示：与未转染和空载体转染的细胞相比,MDA-MB-231-NK1R-FL细胞的侵袭和迁移能力均下降（P<0.05）,HBL-100-NK1R-Tr细胞的侵袭和迁移能力的均升高（P<0.05）。（3） NK1R-Tr与NK1R-FL和NK2R的反馈调节研究结果显示：与未转染和pEGFP-C2空载体转染的细胞相比,MDA-MB-231-NK1R-FL的NK2R表达升高,HBL-100-NKlR-Tr的NK2R表达下降（P<0.05）; NK1R受体拮抗剂可以抑制MDA-MB-231-NK1R-FL细胞在体外的增殖,不同浓度下的抑制率与MDA-MB-231和MDA-MB-231-C2对照组比较均有显着性差异（P<O.05）,并且随药物浓度的升高及作用时间的延长,抑制率逐渐增加,最高抑制率为56.8%；HBL-100-NK1R-Tr细胞在NK1R受体拮抗剂浓度为2μmol/L开始增殖受抑制,随浓度升高抑制率升高,但不同浓度下的抑制率均显着低于HBL-100和HBL-100-C2细胞,最高抑制率为31.6;NK2R受体拮抗剂可以随浓度升高抑制MDA-MB-231-NK1R-FL细胞在体外的增殖,不同浓度下的抑制率与MDA-MB-231和MDA-MB-231-C2对照组比较均升高,但在低浓度下差异尤其显着（P<O.05）,最高抑制率为66.3%；同样条件下,HBL-100-NKlR-Tr细胞在NK1R受体拮抗剂浓度为2μmo1/L开始增殖受抑制,而HBL-100和HBL-100-C2细胞在1μmol/L开始增殖受抑制,各组细胞均随浓度升高抑制率升高,但HBL-100-NKlR-Tr细胞在不同浓度下的抑制率均低于HBL-100和HBL-100-C2细胞,在低浓度下,抑制率降低更显着,最高抑制率为58.6；在无拮抗剂、NK1R和NK2R受体拮抗剂存在条件下,MDA-MB-231-NK1R-FL细胞软琼脂集落形成能力均显着低于MDA-MB-231细胞和MDA-MB-231-C2细胞（P<0.05）；在无拮抗剂存在下,HBL-100-NK1R-Tr细胞软琼脂集落形成能力高于HBL-100和HBL-100-C2细胞,但无显着性差别（P>0.05）,在NK1R和NK2R受体拮抗剂存在条件下集落形成能力则均显着高于HBL-100和HBL-100-C2细胞（P<0.05）（4）裸鼠的体内研究表明：裸鼠尾静脉MDA-MB-231-NK1R-FL细胞相较于MDA-MB-231细胞,小动物活体成像系统显示肺、和骨转移显着降低,肺组织的大体标本和HE染色的转移灶计数均显着降低；裸鼠尾静脉注射HBL-100细胞未见肺、肝、骨的转移灶,HBL-100-NKlR-Tr细胞裸鼠尾静脉5周后肺组织HE染色即发现肺微小转移灶,8周后X-Ray可检测到骨转移灶。第三部分：（1）相较于单独培养的两种细胞,MDA-MB-231细胞和HMSC-bm细胞的共培养显示：MDA-MB-231细胞和HMSC-bm细胞的1：100共培养体系中,MDA-MB-231细胞不生存；1：10共培养体系中,MDA-MB-231细胞生存但不增殖,HMSC-bm生长速度不改变；1：1共培养体系中,直到细胞生长汇合达到40%,乳腺癌细胞生长缓慢,HMSC-bm细胞包绕MDA-MB-231细胞生长,且生长速度较单独培养快,当细胞汇合达到超过60%后,两种细胞生长速度均加快并相互融合,HMSC-bm细胞失去正常形态且与MDA-MB-231细胞无法区分。HBL-100细胞在与HMSC-bm细胞的共培养体系中不生存。（2）在MDA-MB-231细胞和HMSC-bm细胞的1：1共培养体系中,分别待其细胞汇合达到20%、40%和60%分离MDA-MB-231细胞,测定NK1R-FL和NK1R-Tr基因和蛋白表达：在各汇合点,NK1R-FL均不表达；在20%、40%汇合点,NK1R-Tr低表达；在60%汇合点,NK1R-Tr表达开始升高。在各汇合点PPT基因和SP的分泌表达、NK2R基因和蛋白表达变化均不显着。第四部分：（1）应用RNA干扰技术和脂质体转染技术并经G418筛选构建了SDF-1α和TGF-β1基因稳定抑制的MDA-MB-231-SDF-1αⅠ细胞株和MDA-MB-231-TGF-βⅡ细胞株,用Real-time PCR法和ELISA法鉴定表明对SDF-1α和TGF-β1的表达抑制率分别达到99%和81%。（2） Real-time PCR法和ELISA法检测结果显示：SDF-1α基因和蛋白在HMSC-bm细胞显着高表达,HBL-100-NK1R-Tr细胞SDF-1α的表达显着低于HBL-100细胞（P<0.05）；将MDA-MB-231-SDF-1αⅠ细胞与HMSC-bm细胞等量共培养,以空载体转染的MDA-MB-231-KB和未转染的细胞为对照,MDA-MB-231-SDF-1αⅠ细胞在共培养的早期（24h,48h）生长速度加快。在MDA-MB-231-SDF-1αⅠ细胞与HMSC-bm细胞的共培养体系中加入人重组的SDF-1α因子后,明显促进了共培养体系中HMSC-bm细胞的生长,抑制了MDA-MB-231-SDF-1αⅠ细胞的生长。在MDA-MB-231-SDF-1αⅠ细胞与HMSC-bm细胞的共培养体系中加入SDF-1α的中和抗体后,MDA-MB-231-SDF-1αⅠ细胞的生长进一步加快。相较于未转染和空载体转染的MDA-MB-231细胞,MDA-MB-231-SDF-1αⅠ细胞的NKIR-Tr表达升高；MDA-MB-231-SDF-1αⅠ与HMSC-bm共培养24小时分离后,NKIR-Tr表达降低；在MDA-MB-231-SDF-1αⅠ与HMSC-bm共培养24小时后的体系中加入人重组SDF-1α因子作用24小时再分离后,NKIR-Tr表达进一步降低；在MDA-MB-231-SDF-1αⅠ与HMSC-bm共培养24小时后的体系中加入SDF-1α中和抗体作用8小时并分离后,NK1R-Tr表达升高;各处理因素下NK1R-FL均未见表达。（3） Real-time PCR法和ELISA法检测结果显示：MDA-MB-231、HMSC-bm、 HBL-100-NK1R-Tr和HBL-100各组细胞的TGF-β1表达水平均较高,HBL-100-NK1R-Tr细胞的TGF-β1表达水平较HBL-100细胞显着升高（P<0.05）。将MDA-MB-231-TGF-β1细胞与HMSC-bm细胞等量共培养,以空载体转染的MDA-MB-231-KB和未转染的细胞为对照,MDA-MB-231-TGF-β1Ⅰ细胞在共培养的早期（24h,48h）生长速度明显加快,HMSC-bm细胞的生长速度减慢;在MDA-MB-231-TGF-β1Ⅰ细胞与HMSC-bm细胞的共培养体系中加入人重组的TGF-β1因子后,共培养体系中HMSC-bm细胞和MDA-MB-231-TGF-β1Ⅰ细胞的生长均受到了抑制;在MDA-MB-231-TGF-β1Ⅰ细胞与HMSC-bm细胞的共培养体系中加入TGF-β1的中和抗体后,MDA-MB-231-TGF-β1Ⅰ细胞的生长进一步加快。应用Real-time PCR的mRNA表达结果和Western blots的蛋白表达结果均显示：相较于未转染和空载体转染的MDA-MB-231细胞,MDA-MB-231-TGF-β1Ⅰ细胞的NKIR-Tr表达降低；MDA-MB-231-TGF-β1Ⅰ与HMSC-bm共培养24小时分离后,NK1R-Tr表达进一步降低；在MDA-MB-231-TGF-β1Ⅰ与HMSC-bm共培养24小时后的体系中加入人TGF-β1重组因子,继续培养24小时分离后,NK1R-Tr表达升高；在MDA-MB-231-TGF-β1Ⅰ与HMSC-bm共培养24小时后的体系中加入TGF-β1中和抗体继续培养8小时分离后,NK1R-Tr表达降低;各处理因素下NK1R-FL均未见表达。结论：（1）乳腺癌组织与细胞系研究结果均表明：随着乳腺癌的发生、发展和浸润转移,NK1R-FL的表达逐渐降低,而NK1R-Tr的表达则逐渐升高,NK1R-FL的表达下调及NK1R-Tr表达的上调可能成为预示乳腺癌浸润转移的一个重要指标。（2）体外和裸鼠体内研究结果均表明：NK1R-FL乳腺癌细胞的生长、增殖、粘附、侵袭和迁移起抑制作用,而NK1R-Tr对乳腺癌细胞的生物学作用则与之相反,提示NK1R-Tr可能具备膜受体型的癌基因性质；乳腺癌细胞NK1R-Tr表达的增加,使其对NK1R和NK2R的受体拮抗剂的敏感度降低,NK1R-FL的表达则增加了对NKlR和NK2R的受体拮抗剂的敏感度,结果提示NK1R-Tr受体的细胞内缺失段是NK1R信号传导和脱敏的关键区域,并因此影响了NK1R受体的自分泌调节及与NK2R受体的反馈调节。（3） MDA-MB-231细胞和HMSC-bm的共培养结果表明,以HMSC-bm细胞为代表的骨髓基质微环境抑制了进入骨髓的乳腺癌细胞的生长,乳腺癌细胞NKIR-Tr表达的下调可能是维持乳腺癌细胞在骨髓基质微环境中呈静息状态的一个重要因素。（4）乳腺癌细胞SDF-1α因子表达的上调与NKIR-Tr的高表达呈负相关,HMSC-bm细胞SDF-1α分泌表达可能是乳腺癌细胞在骨髓基质微环境中维持静息状态和NKIR-Tr低表达的原因之一；乳腺癌细胞TGF-β1的表达与NK1R-Tr的表达呈正相关,乳腺癌细胞TGF-β1基因被抑制后,NKIR-Tr表达虽然降低,但乳腺癌细胞迅速长入骨髓基质,这预示着骨髓基质微环境中的TGF-β1也是乳腺癌细胞在骨髓基质微环境中维持静息状态的重要因素,但其作用机制可能是通过NKIR-Tr之外的其它因素。
祝海宝[6]（2009）在《OGP对奶牛成骨细胞、骨髓基质干细胞的作用及其微囊化研究》文中进行了进一步梳理成骨生长肽（Osteogenic growth peptide,OGP）是一种高效促成骨及造血刺激因子。普遍存在于哺乳动物的血液中,对促进骨形成、松质骨密度及骨折的愈合具有重要的意义。有研究发现,OGP通过自分泌及旁分泌途径,促进人及啮齿目动物的成骨细胞及骨髓基质干细胞分化、碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,ALP）活性及基质矿化。本试验从以下五个方面探讨了OGP对奶牛骨髓基质干细胞及成骨细胞作用及调控机制,并对OGP转基因细胞微囊生物学特性进行研究。1.奶牛骨钙素抗体制备以奶牛骨组织提取的RNA为模板,利用RT-PCR技术扩增出奶牛骨钙素（Bonecalcium protein,BGP）全长cDNA,然后将扩增产物重组到PMD-18T载体中,测定了全基因的核苷酸序列。序列分析表明,奶牛骨钙素全长cDNA为303bp,编码100个氨基酸,与GenBank中的X53699的序列完全相同。通过重叠延伸PCR技术连接单链DNA片段人工定点同义突变,将奶牛骨钙素成熟蛋白基因中的大肠杆菌稀有密码子同义突变成大肠杆菌常用密码子并亚克隆到PET-32a表达载体,转化到宿主菌BL21（DE3）,经IPTG诱导后,成功表达出奶牛骨钙素融合蛋白,并成功制备奶牛骨钙素多抗血清,为后续试验提供了抗体。2.OGP对奶牛骨髓基质干细胞增殖、分化及矿化的影响及其调控机制研究本试验研究了OGP对奶牛体外培养的骨髓基质干细胞增殖及分化特性的作用。结果发现,成骨生长肽能促进奶牛骨髓基质干细胞的增殖,并能促进奶牛骨髓基质干细胞ALP活性及矿化的形成,另外能刺激BGP mRNA的表达。OGP能刺激奶牛骨髓基质干细胞内皮一氧化氮合成酶（Endothelial nitric oxide synthases,eNOS）的表达,当eNOS表达受到抑制时,OGP对奶牛骨髓基质干细胞的促分化活性受到抑制。由此认为,OGP能刺激奶牛骨髓基质干细胞的增殖及向成骨细胞分化,并且是通过eNOS介导。3.OGP对奶牛成骨细胞增殖、分化及矿化的影响及其调控机制研究本试验研究了外源性OGP对体外培养的奶牛成骨细胞增殖、分化及矿化的影响。组织块移行法分离奶牛成骨细胞,通过形态观察及碱性磷酸酶活性鉴定。MTT法检测不同浓度OGP对成骨细胞生长的作用。细胞质碱性磷酸酶活性及骨钙素水平分别通过比色法检测及放射免疫法测定。硒素红染色观察矿化结节。结果显示,成骨生长肽能明显促进奶牛成骨细胞的增殖,最大效应浓度为10-9M;并且能促进成骨细胞ALP活性、骨钙素及矿化结节的形成;当抑制osterix基因表达,成骨生长肽促进奶牛成骨细胞ALP活性及骨钙素分泌相应受到抑制。由此揭示,OGP对奶牛成骨细胞增殖及分化具有促进,并且是通过上调osterix介导。4.体内氧自由基对移植细胞微囊活性的影响为了揭示细胞微囊移植过程中宿主体内氧自由基的动态变化特征。将细胞微囊、空微囊以及生理盐水在移植小鼠体内后1、4、7天,检测血清自由基,MDA及SOD水平。过氧化氢及MDA水平在空微囊移植后瞬时升高,后又降低到正常水平,但是细胞微囊移植组,移植后持续升高。NO及SOD水平在空微囊及细胞微囊移植组均升高,但是生理盐水注射组无明显变化。细胞微囊在移植7天后回收,通过AO/EB染色发现,细胞具有良好的活性。由此认为,NO是微囊特异性的刺激形成因子,氧自由基在微囊移植早期迅速升高,但是由于体内抗氧化物酶升高从而能有效清除。5.OGP转基因细胞微囊体内及体外增殖及分泌特性研究为OGP转基因细胞微囊在体内及体外的增殖及分泌特征。本试验检测了OGP转基因细胞微囊在体外培养条件下的增殖及OGP分泌活性,并将微囊细胞移植入骨质疏松疾病模型体内,检测微囊内细胞增殖及OGP分泌活性,并对骨质疏松疾病模型体内氧自由基及抗氧化物酶的活性进行了检测。结果显示,OGP转基因细胞微囊在体外培养条件下具有良好的增殖及分泌活性,而在骨质疏松疾病模型体内细胞大量死亡,宿主动物血清OGP含量无明显变化。骨质疏松模型血清氧自由基含量明显升高,抗氧化物酶活性降低,当注射抗氧化剂后,能明显降低血清自由基含量。由此认为,OGP转基因细胞微囊具备治疗移植的潜力,在骨质疏松疾病模型体内移植失败,主要原因是,骨质疏松模型体内氧自由基含量高,导致微囊内细胞坏死或凋亡。
戴江华[7]（2007）在《体内灌注诱导骨髓基质干细胞构建组织工程骨的实验研究》文中提出由创伤、感染、肿瘤、烧伤等引起的大块骨缺损是临床治疗的棘手问题,采用传统的自体骨或同种异体骨移植及生物材料填充,由于存在种种弊端,治疗效果均不理想,严重限制了其临床应用。组织工程技术的兴起为解决这一难题带来了希望,成为当前的研究热点。然而,大块组织工程骨血管化以及生长因子持续稳定的释放等关键性技术难题至今未找到理想的解决办法。显然,采用常规的思路对大块骨缺损进行修复遇到了巨大的挑战。为了找到一条可供临床用来修复大块骨缺损的组织工程之路,本研究力图探索出一条基于整体论和还原论相结合的骨组织工程研究的创新之路,并率先建立近同构模型——体内灌注诱导成骨微环境系统。基于这种认识,我们开展了以下一系列研究:第6章:山羊骨髓基质干细胞的体外培养目的:将来源于山羊的骨髓基质干细胞（bone marrow stromal cells,BMSC）,在特定的条件下定向诱导分化为成骨细胞,观察其生物学特性,探讨其作为骨组织工程种子细胞的可行性和应用价值。方法:抽取健康山羊骨髓采用全骨髓法进行培养扩增,传代后改用含地塞米松（10-8mol/L）,β-甘油磷酸钠（10mmo1/L）和维生C （50mg/L ）的条件培养基促使其向成骨细胞定向诱导分化。在相差显微镜、HE染色、光镜下观察细胞形态,并测定培养细胞的生长曲线（MTT法）,流式细胞术进行细胞表面特征鉴定,Gomori钙钻法进行ALP染色、Von Kossa法进行钙结节染色,同时测定细胞内ALP含量变化。结果:原代和传代培养的细胞具有活跃的增殖能力。诱导培养2-3周后,细胞生长良好,生化指标稳定,光镜下表现出与典型的成骨细胞相似的形态特征。流式细胞术证明BMSC细胞膜抗原CD29, CD44, CD105表达阳性,而CD14, CD34和HLA-DR表达阴性,ALP及钙结节染色等均为强阳性;ALP活性明显增强（P<0.01）。结论:山羊BMSC取材安全方便,在特定条件诱导下,可定向诱导分化为具有典型形态学特点和功能的成骨细胞,山羊BMSC可作为理想的骨组织工程种子细胞来源。第7章:rhBMP-2及rhbFGF对山羊骨髓基质干细胞增殖的效应目的:检测rhBMP-2和rhbFGF单独及联合作用对山羊骨髓基质干细胞（BMSC）增殖的效应。方法:采用MTT法检测单独及联合施加rhBMP-2和rhbFGF后,BMSC在第1, 3, 5, 7及10天增殖的状况,并进行统计学分析。结果:rhBMP-2和rhbFGF均能显着地促进BMSC的增殖,并呈剂量依赖性。两种生长因子联合作用的效应高于单独作用的效应。结论: rhBMP-2和rhbFGF具有协同促进山羊BMSC增殖的效应。第8章:rhBMP-2及rhbFGF对山羊骨髓基质干细胞分化的效应目的:检测rhBMP-2和rhbFGF单独及联合作用对山羊BMSC的分化效应。方法:采用碱性磷酸酶（ALP）检测试剂盒及考马斯亮兰测定法检测单独及联合施加rhBMP-2和rhbFGF后,BMSC在第2,5,7及10天时的ALP活性及蛋白质含量水平以反映对细胞分化作用的影响,并进行统计学分析。结果:rhBMP-2能在较长时间内明显促进细胞ALP活性及蛋白质含量,而rhbFGF则起到抑制作用,且均呈剂量依赖性。rhBMP-2单独作用与两种生长因子联合作用的效应相近,均高于rhbFGF单独作用的效应。结论:rhBMP-2和rhbFGF联合应用与rhBMP-2单独使用均能够显着地促进山羊BMSC的分化效应。第9章:增强型绿色荧光蛋白基因质粒转染骨髓基质干细胞目的:探讨以脂质体介导法转染的增强型绿色荧光蛋白质粒作为骨组织工程种子细胞示踪剂的可行性。方法:选取12月龄中国青山羊2只作为BMSC供体。将已转染pEGFP-N2的大肠杆菌109菌种,进行质粒提取并经AvaⅡ酶切鉴定。脂质体（lipofectamine 2000）介导转染羊BMSC细胞。分别于转染24h、6月后计算荧光的转染效率。以未标记的同期细胞作对照。结果:质粒经酶切后电泳,可见三条带,分别为445bp,1938bp,2354bp,确定所提质粒为pEGFP-N2。转染24h后绿色荧光表达率35%;经G418筛选,转染6个月后绿色荧光表达率75%,同时对照组未观察到绿色荧光。结论:脂质体介导法转染的pEGFP-N2标记BMSC,是一种理想的标记方法。第10章:增强型绿色荧光蛋白基因质粒标记技术示踪组织工程化骨形成目的:探讨以脂质体介导法转染的增强型绿色荧光蛋白质粒作为骨组织工程种子细胞示踪组织工程化骨形成的可行性。方法:将标记与未标记细胞经成骨诱导分化后,检测碱性磷酸酶（ALP）活性和四环素钙结节染色,以未标记的同期细胞作对照。将标记细胞接种于珊瑚支架,形成BMSC-珊瑚复合物,分别于体外培养4d、7d、14d后进行电镜扫描观察。将体外培养7d的BMSC-珊瑚复合物移植于裸鼠皮下,8周后取出,荧光显微镜下进行示踪观察,HE染色观察组织结构。以未标记的BMSC-珊瑚复合物、单纯珊瑚作对照。结果:与对照组相比,标记细胞碱性磷酸酶活性差异无统计学意义（P> 0. 05）,均具有钙结节形成能力。标记细胞与珊瑚材料贴附生长良好,并分泌胶原纤维及钙盐结晶样基质。组织学示新生骨样组织围绕材料孔隙生成;新生组织细胞内有绿色荧光清晰表达,同时对照组未观察到绿色荧光。结论:脂质体介导法转染的pEGFP-N2标记BMSC,可用于裸鼠体内示踪,是一种理想的组织工程化骨组织的示踪方法。第11章:山羊胫骨大节段骨缺损模型的制备目的:为骨组织工程的研究提供理想的动物模型。方法:取9只青山羊随机分3组,制备单侧胫骨25mm的骨膜与骨缺损,重建钢板内固定,术后放射学检查、组织学方法评价骨缺损自行修复情况。结果:术后所有动物骨缺损处x线片Lane评分均为0分,组织学显示无骨组织长人。结论:山羊胫骨适于制备骨缺损和重建钢板内固定模型,其25mm大段骨缺损模型是研究组织工程骨较为理想的动物模型。第12章:近同构模型修复山羊胫骨大段骨缺损的初步研究目的:探索骨组织工程近同构模型修复羊胫骨干骨缺损的可行性。方法:体外扩增自体骨髓基质干细胞,与珊瑚支架材料复合,植入山羊胫骨缺损处,同时通过便携式微量泵联合皮下植入式给药装置,建立近同构模型—可调控的体内灌注诱导成骨微环境系统,定时注入DMEM培养液、细胞因子rhbFGF和rhBMP-2。结果:术后8W观察结果:术后8W组织切片HE染色观察到近同构模型组骨组织形成;对照组仅见纤维组织长入。x线观察,术后8W近同构模型组织工程骨周围形成骨痂,并与胫骨缺损端融合;对照组术后8W时支架材料部分降解、吸收。结论:近同构模型构建的组织工程化人工骨具有修复大动物（羊）负重骨（胫骨）的节段性缺损的可行性。
杨春露[8]（2007）在《珍珠层人工骨骨诱导作用及相关机制实验研究》文中进行了进一步梳理研究背景：近年来，珍珠层（nacre）作为一种新型骨生物替代材料受到了更多的关注。珍珠层来源于海洋中软体动物双壳类珍珠贝科或蚌科动物的贝壳内层，其组成成分主要为文石型碳酸钙，并含有少量有机质和微量金属元素。我们前期研究表明：珍珠层人工骨能够促进兔桡骨长节段骨缺损的修复；在犬腰椎横突间骨融合及兔颅骨缺损的修复实验中均观察到明显的成骨作用。珍珠层人工骨具有低免疫原性、良好的生物相容性、可降解性、骨传导性和较好的成骨作用。珍珠层作为生物骨替代材料，与其他无机生物材料相比，其优势在于含有具有诱导成骨作用的功能成分。基于此，本研究从珍珠层中提取水溶性物质，通过细胞学及体内动物实验，探讨其对骨髓基质细胞（bone marrow derived stromal cells，BMSCs）向成骨细胞方向分化的作用及相关机制，并研究珍珠层水溶性提取物（water soluble matrix of nacre powder，WSM）与血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor BB，PDGF-BB）协同作用下的骨诱导作用，旨在探讨珍珠层人工骨骨诱导作用及相关机制。同时开展珍珠层人工骨与人骨髓基质细胞的相容性研究，为进一步临床应用研究奠定基础。目的：1．探讨WSM诱导人BMSCs成骨性分化的作用及机制，以及PDGF-BB在此过程中的协同作用。2．建立成骨细胞—骨髓基质细胞复合培养体系，探讨共育体系中两种细胞的生物学特性及WSM对于复合培养体系生物学行为的影响。3．观察WSM诱导的大鼠骨髓基质细胞与珍珠层人工骨复合后在大鼠肌袋内的异位成骨作用，进一步明确珍珠层人工骨的骨诱导作用。4．研究珍珠层人工骨与人骨髓基质细胞的生物相容性。方法：1．体外分离培养人骨髓基质细胞（hBMSCs），利用形态学、测定细胞生长曲线、HE染色、Giemsa染色及流式细胞术等方法对hBMSCs进行鉴定。2．低温状态下提取珍珠层粉（马氏珍珠贝）中的水溶性物质（WSM），利用真空冷冻干燥技术将其浓缩。不同浓度作用于hBMSCs，检测碱性磷酸酶活性，制定剂量-效应曲线，确定最佳作用浓度。3．WSM及PDGF-BB作用于体外培养的第3代的hBMSCs，以地塞米松诱导培养基为阳性对照，利用流式细胞术检测WSM对hBMSCs细胞周期的影响。诱导后的不同时间点，分别采用Gormori法碱性磷酸酶（AKP）染色、茜素红钙化结节染色等方法评价WSM、PDGF-BB诱导hBMSCs成骨性分化的效能；同时采用One-step RT-PCR方法检测hBMSCs诱导前后骨形成蛋白（BMP-2）、转化生长因子（TGF-β1）、核心结核因子（Cbfa-1）等生长因子表达差异。4．原代分离hBMSCs和人成骨细胞（OBs），将2种细胞置于Transwell共育环境中共同培养，建立hBMSCs-OBs共育体系。分别采用MTT、丫啶橙染色、AKP活性检测等方法初步评价共育体系中两种细胞增殖、凋亡及功能改变情况。WSM作用于共育体系，不同时间点利用One-step RT-PCR方法检测共育体系中hBMSCs细胞BMP-2、AKP、TGF-β1、Cbfa-1、Osteonection、Osteocalcin、Osteopontin等成骨标志基因表达情况，判断WSM对共育体系中hBMSCs成骨性分化的诱导作用。5．分离培养SD大鼠骨髓基质细胞（rBMSCs），将rBMSCs种植于珍珠层人工骨材料上，利用WSM体外诱导培养7天后，植入3月龄SD大鼠背部肌袋内，分别以复合未诱导rBMSCs、单纯珍珠层人工骨材料作对照。于植入后1d、4、8和12周时行X线摄片，观察WSM诱导的rBMSCs-人工骨材料复合物在大鼠体内异位成骨情况。在4、8和12周取材，经大体观察、组织学和免疫组织化学染色方法检测异位成骨情况。6．将hBMSCs与珍珠层人工骨材料及WSM共同培养，用倒置显微镜、考马斯亮蓝染色法、四唑盐（MTT）比色法、扫描电镜等方法，研究珍珠层人工骨与hBMSCs生物相容性。结果：1．hBMSCs细胞刚贴壁时呈三角形、圆形、纺缍形或多角形等不规则形状。传代后形成单层时呈典型的漩涡式生长。生长曲线呈“S”形。hBMSCs表达CD29、CD44、和CD105为阳性，而CD45、CD34表达为阴性。2．WSM初提液经真空冷冻干燥方法浓缩至30mg／ml，不同浓度作用于hBMSCs。结果表明100μg／ml以下的WSM对hBMSCs的AKP活性影响不大，当达到150μg／ml时作用效果最显着，之后再增加浓度作用无明显增加，因此确定150μg／ml的WSM为本研究的实验浓度。3．hBMSCs诱导后第3d及第7d，WSM组、PDGF-BB+WSM及诱导培养基组的AKP染色均为阳性，第7d时更为明显；而空白对照组及PDGF-BB组则仅见极少数的AKP染色弱阳性细胞，未见典型的AKP阳性细胞。hBMSCs诱导后第18天，诱导培养基组茜素红染色可见典型同心圆状的红色钙化结节；WSM组形成不成熟的钙化结节，较为典型；PDGF-BB+WSM组形成的钙化结节数量较多，体积小；空白对照组及PDGF-BB组未见明显钙化结节形成。4．骨髓基质细胞-成骨细胞共育体系能够促进OBs的增殖与AKP的活性，同时抑制BMSCs的凋亡，促进BMSCs的趋化聚集。培养第7天，共育体系能够提高hBMSCs的BMP-2、AKP、Cbfa-1、TGF-β1基因的表达（P＜0.05）；WSM能够使共育体系中hBMSCs的BMP-2、AKP表达进一步提高（P＜0.05）；而WSM对Cbfa-1、TGF-β1、Collage-1、Osteonectin等基因表达无影响（P＞0.05）。5．复合WSM诱导后rBMSCs的人工骨植入大鼠肌袋内发生异位成骨：8周时有类骨质形成，12周时材料中出现较为成熟的板层样骨组织，其中可见小梁骨；复合rBMSCs的对照组12周仅有少量不规则小梁骨形成；单纯材料组仅见纤维结缔组织及肌肉组织长入材料，未见成骨发生。X线检查，组内比较，WSM+rBMSCs+人工骨组12周时材料的X线阻射密度值与4周时相比有统计学差异（P＜0.05），其余两组各时间点无差异。组间比较，WSM+rBMSCs+人工骨组12周时阻射密度值高于其他两组，余未见差异（P＞0.05）。6．MTT法显示随培养时间的延长，珍珠层人工骨材料对hBMSCs生长与增殖无影响（各时间点P＞0.05）。扫描电镜显示hBMSCs可在珍珠层人工骨材料表面良好生长，增殖并分泌基质，WSM能够促进hBMSCs总蛋白表达。结论：1．WSM能够诱导体外培养的hBMSCs的成骨性分化，PDGF-BB在此过程中具有协同效应，而PDGF-BB单独作用时无骨诱导作用。2．BMSCs-OBs共育体系能够促进OBs的增殖及碱性磷酸酶的表达，降低hBMSCs的凋亡，促进hBMSCs的趋化聚集，提高hBMSCs的BMP-2、TGF-β1等因子的表达。3．WSM能够促进BMSCs-OBs共育体系内OBs分化，提高hBMSCs的BMP-2、AKP等基因表达。WSM对OBs的成熟及BMSCs的成骨性分化具有双重促进作用。4．WSM诱导后的rBMSCs与珍珠层人工骨复合后，在SD大鼠背部肌袋内可异位成骨，WSM具有诱导rBMSCs成骨性分化的作用。5．珍珠层人工骨与hBMSCs具有良好的生物相容性。
石永江,刘宏亮,姚忠祥[9]（2006）在《骨髓基质细胞生物学特性及其在脊髓损伤修复中的应用》文中认为目的:近来发现骨髓基质细胞具有强大的增殖能力和多向分化潜能,在特定诱导条件下可分化为神经细胞,提示骨髓基质细胞移植为修复脊髓损伤带来了希望。为此就骨髓基质细胞生物学特性及其在脊髓损伤修复中的应用予以综述。资料来源:应用计算机检索PUBMED2000-01/2004-12期间的相关文章,检索词为“MSCs,SCI”,并限定文章语言种类为English。同时计算机检索万方数据库2000-01/2004-12期间的相关文章,检索词为“骨髓基质细胞,脊髓损伤”,并限定文章语言种类为中文。资料选择:对资料进行初审,并查看每篇文献后的引文。纳入标准:文章所述内容应涉及骨髓基质细胞的生物学特征、定向分化、鉴定以及骨髓基质细胞治疗脊髓损伤的研究现状或作用机制等内容。排除标准:重复研究或Meta分析类文章。资料提炼:共收集到38篇相关文献,26篇文献符合纳入标准,排除的12篇文献为内容陈旧或重复。符合纳入标准的26篇文献中,13篇涉及骨髓基质细胞的生物学特征,3篇涉及骨髓基质细胞定向分化为神经细胞的诱导,1篇涉及骨髓基质细胞的鉴定,3篇涉及骨髓基质细胞移植治疗脊髓损伤的研究现状,6篇涉及骨髓基质细胞移植修复脊髓损伤的作用机制。资料综合:骨髓基质细胞具有强大的增殖能力和多向分化潜能,用于细胞移植和基因治疗有许多优势,被视为多种组织细胞移植的替代来源和基因治疗的有效运载工具。骨髓基质细胞在特定的诱导条件下,可以分化为神经细胞。研究提示,取材方便、易于扩增、易于诱导分化的骨髓基质细胞可作为脊髓损伤细胞治疗的一个备选来源,为修复脊髓损伤带来了希望。结论:具有自我更新能力及多向分化潜能的骨髓基质细胞,随着转基因治疗和联合细胞移植的深入研究,将为脊髓损伤的修复带来更加广阔的前景。
张洪涛[10]（2006）在《PRP诱导人BMSc体内成骨及免疫配型不相合人BMSc混合培养实验研究》文中研究说明由创伤、感染、肿瘤等疾病引起的骨缺损是骨科临床的常见病，骨缺损治疗的难题主要是移植骨的来源问题。组织工程的兴起和发展为骨缺损的修复开辟了一条新的途径。骨组织工程技术以体外构建、体内重组的模式给这一领域提供了崭新的治疗技术手段，成为目前修复骨缺损的较为理想的方法。 随着研究的深入，骨组织工程已逐步由动物实验扩展到临床实验阶段。临床应用不同于动物实验，首先需要考虑治疗的安全性，因此组织工程种子细胞的选择，材料的选择以及种子细胞的体外培养过程等问题都是需要谨慎注意的。富血小板血浆是经过特殊方法提取的血小板含量丰富的血浆，相较普通血清含有更丰富的细胞因子。研究表明细胞因子是骨髓基质干细胞增值、分化的必须。本研究以自体骨髓基质干细胞作为种子细胞，尝试采用自体富血小板血浆替代普通血清——尽量排除异类抗原物质的引入且利于促进细胞的增值、分化的培养方法，诱导培养人骨髓基质干细胞，并将诱导培养的骨髓基质干细胞与临床应用相对成熟具有临床应用许可的北京意华健公司的YHJ500珊瑚羟基磷灰石材料复合植入裸鼠体内。探讨了自体富血小板血浆对诱导培养人骨髓基质干细胞生物学特性的影响及以自体富血小板血浆诱导培养的人骨髓基质干细胞与珊瑚羟基磷灰石材料的生物相容性及在体内的成骨效用。 由于自体骨髓基质干细胞培养、扩增需很长时间且针对年龄较大或存在其他疾患的个体又无法完成自体的骨髓基质干细胞的培养与扩增，因此建立人骨髓基质干细胞库是组织工程在临床推广应用的必须。研究证实异体骨髓基质干细
二、骨髓基质细胞的生物学特性及应用研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、骨髓基质细胞的生物学特性及应用研究（论文提纲范文）
（1）1.当归多糖逆转5-FU介导骨髓基质细胞成骨/成脂分化失衡的作用及机制研究 2.人参皂苷Rg1通过FOXO1转录因子预防D-半乳糖诱导的小鼠脂肪性肝病（论文提纲范文）
| 论文一:当归多糖逆转5-FU介导骨髓基质细胞成骨/成脂分化失衡的作用及机制研究 |
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 当归多糖减轻5-氟尿嘧啶对骨髓基质细胞成骨分化潜能的抑制作用 |
| 前言 |
| 实验材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 当归多糖逆转5-FU介导骨髓基质细胞成骨/成脂分化失衡的作用及机制研究 |
| 前言 |
| 实验材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 论文二:人参皂苷Rg1 通过FOXO1 转录因子预防D-半乳糖诱导的小鼠脂肪性肝病 |
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 实验材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间撰写发表论文 |
（2）新型多孔钽金属的制备及在股骨头坏死治疗中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 研究背景及意义 |
| 1.2 国内外相关工作研究进展 |
| 1.2.1 多孔钽金属在骨科中的应用 |
| 1.2.2 多孔钽金属材料的制备 |
| 1.2.3 股骨头坏死发病机制与病因 |
| 1.2.4 股骨头坏死的分期 |
| 1.2.5 股骨头坏死的治疗 |
| 1.3 本文主要研究思路 |
| 1.3.1 选题依据 |
| 1.3.2 研究内容 |
| 1.3.3 主要研究内容技术路线图 |
| 2 新型多孔钽金属材料的制备与表征 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与设备 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验设备 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.4 性能检测 |
| 2.4.1 不同H_2流量下样品表面显微分析 |
| 2.4.2 扫描电镜显微分析 |
| 2.4.3 超景深三维数字显微系统表征 |
| 2.4.4 SEM测量涂层厚度及EDX能谱分析表征 |
| 2.4.5 X射线衍射(XRD)分析表征 |
| 2.4.6 力学性能分析 |
| 2.4.7 涂层与基体结合力测定 |
| 2.5 结果 |
| 2.5.1 不同H2流量下样品表面显微形貌 |
| 2.5.2 多孔钽生物形貌观察 |
| 2.5.3 超景深三维数字显微系统观测 |
| 2.5.4 SEM测量涂层厚度及EDX能谱分析 |
| 2.5.5 X射线衍射(XRD)分析 |
| 2.5.6 多孔钽金属材料的力学性能 |
| 2.5.7 涂层与基体结合力 |
| 2.6 讨论 |
| 2.7 小结 |
| 3 新型多孔钽金属材料初步生物相容性评价 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与仪器 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 主要实验仪器和试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 多孔钽材料制备及消毒 |
| 3.3.2 实验动物分组及模型制备 |
| 3.3.3 兔BMSCs培养及鉴定 |
| 3.3.4 BMSCs与多孔钽支架材料共培养及分组 |
| 3.3.5 MTT法检测各组细胞生长及增殖情况 |
| 3.3.6 扫描电镜观察兔BMSCs在新型多孔钽生长增殖情况 |
| 3.3.7 多孔钽支架材料体内组织相容性观察 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 多孔钽支架材料的观察 |
| 3.4.2 骨髓基质干细胞的形态特征观察及鉴定 |
| 3.4.3 BMSCs与多孔钽材料支架共培养后形态特征观察 |
| 3.4.4 MTT法检测多孔钽支架材料对BMSCs生长、增殖的影响 |
| 3.4.5 通过电镜扫描观察BMSCs在多孔钽支架材料上粘附生长情况 |
| 3.4.6 体内相容性观察 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 4 新型多孔钽金属复合骨髓基质干细胞修复骨坏死的实验研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与仪器 |
| 4.2.1 实验动物 |
| 4.2.2 主要试剂与仪器 |
| 4.3 体外实验 |
| 4.3.1 兔成骨细胞的定向诱导与鉴定 |
| 4.3.2 BMSCs与支架材料共培养及分组 |
| 4.3.3 MTT法检测各组细胞生长及增殖情况 |
| 4.3.4 BMSCs的绿色荧光蛋白(GFP)染色 |
| 4.3.5 成骨细胞基因PCR检测 |
| 4.4 体内试验 |
| 4.4.1 实验动物分组及对照设计 |
| 4.4.2 麻醉方法 |
| 4.4.3 激素性骨坏死动物模型的建立 |
| 4.4.4 植入手术方式 |
| 4.4.5 取材与硬组织切片 |
| 4.4.6 免疫组织化学分析 |
| 4.4.7 硬组织切片 |
| 4.4.8 推出实验 |
| 4.5 统计学处理 |
| 4.6 实验结果 |
| 4.6.1 成骨细胞的形态特征观察 |
| 4.6.2 成骨细胞的鉴定 |
| 4.6.3 MTT法检测各组骨髓基质干细胞生长增殖情况 |
| 4.6.4 骨髓基质干细胞绿色荧光蛋白(GFP)染色 |
| 4.6.5 PCR检测成骨基因 |
| 4.6.6 激素性兔股骨髁坏死模型的评估 |
| 4.6.7 手术过程及术后观察 |
| 4.6.8 免疫组织化学染色 |
| 4.6.9 硬组织切片 |
| 4.6.10 推出实验 |
| 4.7 讨论 |
| 4.8 小结 |
| 5 新型多孔钽金属棒复合骨髓基质干细胞联合带血管蒂髂骨瓣转移治疗股骨头坏死的临床研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 研究对象 |
| 5.3 评估工具 |
| 5.3.1 双髋关节正位X线片 |
| 5.3.2 髋关节Harris评分 |
| 5.3.3 视觉模拟评分VAS量表 |
| 5.3.4 三维步态测量与分析 |
| 5.4 方法 |
| 5.4.1 新型多孔钽金属棒的设计 |
| 5.4.2 骨髓基质干细胞提取与培养 |
| 5.4.3 手术技术 |
| 5.4.4 术后处理和随访 |
| 5.4.5 双髋关节正位X线片 |
| 5.4.6 髋关节Harris评分 |
| 5.4.7 视觉模拟评分VAS量表的计分方法 |
| 5.4.8 统计学分析 |
| 5.5 结果 |
| 5.6 典型病例 |
| 5.7 讨论 |
| 5.8 小结 |
| 6 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间科研项目及科研成果 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（3）NF-κB信号通路在慢性淋巴细胞白血病中的作用和机制探讨（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 经典性和非经典性NF-κB活性在慢性淋巴细胞白血病中的作用 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 实验结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 第二部分 非经典途径NF-κB分子活性影响CLL细胞对蛋白酶体抑制剂的敏感性 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 实验结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 第三部分 与NF-κB活性相关分子NOTCH1基因突变的HRM检测方法的建立及其意义 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 实验结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 第四部分 与NF-κB活性相关的MYD88基因突变的HRM检测方法的建立及其意义 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 实验结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词表 |
| 攻读博士期间发表的文章、获得的基金及奖励 |
| 致谢 |
（4）骨髓基质干细胞的生物学特性及对胶质瘤的趋向效应的实验研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 第一部分 骨髓基质干细胞生物学特性 |
| 第二部分 脑胶质细胞 的治疗策略 |
| 实验一 骨髓基质干细胞的生物学特性实验研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验二 骨髓基质干细胞向胶质 细胞的趋向效应 研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（5）神经激肽受体-1与乳腺癌侵袭转移的相关性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、NK1R-FL和NK1R-Tr在乳腺癌中的表达 |
| 1. 乳腺癌组织NK1R-FL和NK1R-Tr的表达 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 2. 乳腺癌细胞系NK1R-FL、NK1R-Tr、PPT和NK2R的mRNA表达 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 3. 乳腺癌细胞系NK1R-FL、NK1R-Tr、SP和NK2R的蛋白表达 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 二、NK1R-FL和NK1R-Tr对乳腺癌细胞生物学行为影响的研究 |
| 1. MDA-MB-231细胞NK1R-FL和HBL-100细胞NK1R-Tr过表达稳定株的建立 |
| 1.1 对象与方法 |
| 1.2 结果 |
| 2. NK1R-FL过表达对MDA-MB-231细胞和NK1R-Tr过表达对HBL-100细胞生物学行为影响的研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 3. NK1R-FL、NK1R-Tr和NK2R的反馈调节研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 4. NK1R-Tr和NK1R-FL对乳腺癌转移影响的裸鼠体内研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 三.骨髓间充质干细胞对乳腺癌细胞生长及NK1R表达的影响 |
| 1. 骨髓间充质干细胞对乳腺癌细胞生长及NK1R-FL、NK1R-Tr、PPT和NK2R mRNA表达的影响 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 2. 骨髓间充质干细胞对乳腺癌细胞NK1R-FL、NK1R-Tr、SP和NK2R蛋白表达的影响 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 四、SDF-1α、TGF-β1与NK1R分子间的相互作用及对乳腺癌细胞在骨髓基质中生存的影响 |
| 1. SiRNA抑制人乳腺癌细胞SDF-1α、TGF-β1稳定表达株的建立 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 2. SDF-1α对乳腺癌细胞NK1R-FL和NK1R-Tr表达及在骨髓基质中生存的影响 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 3. TGF-β1对乳腺癌细胞NK1R-FL和NK1R-Tr表达及在骨髓基质中生存的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 讨论 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
（6）OGP对奶牛成骨细胞、骨髓基质干细胞的作用及其微囊化研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 成骨生长肽研究进展 |
| 1.1 成骨生长肽的发现简史 |
| 1.2 OGP的一级结构与活性成分 |
| 1.3 成骨生长肽的生物学活性 |
| 1.4 成骨生长肽与碱性磷酸酶(ALP) |
| 1.5 成骨生长肽与血清骨钙素(BGP) |
| 1.6 成骨生长肽与Ⅰ型胶原MRNA、BGP MRNA表达 |
| 1.7 成骨生长肽的功能 |
| 1.7.1 成骨活性 |
| 1.7.2 OGP的促进骨折愈合作用 |
| 1.7.3 有丝分裂原活性 |
| 1.8 成骨生长肽的临床应用前景 |
| 1.8.1 成骨生长肽与骨质疏松 |
| 1.8.2 成骨生长肽在骨创伤中的应用 |
| 1.8.3 成骨生长肽在矫形外科手术中的应用 |
| 第二章 成骨细胞及骨髓基质干细胞研究进展 |
| 2.1 骨髓基质干细胞 |
| 2.1.1 骨髓基质干细胞的表面标记 |
| 2.1.2 骨髓基质干细胞生物学特性 |
| 2.1.3 骨髓基质干细胞分离培养 |
| 2.1.4 骨髓基质干细胞向成骨方向分化 |
| 2.1.4.1 地塞米松 |
| 2.1.4.2 雌激素 |
| 2.1.4.3 1,25(OH)_2 D_3 |
| 2.1.4.4 甲状旁腺激素(PTH) |
| 2.1.4.5 骨形态发生蛋白(BMP) |
| 2.1.4.6 碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) |
| 2.1.4.7 转化生长因子 |
| 2.1.4.8 胰岛素养生长因子 |
| 2.1.4.9 瘦素 |
| 2.1.4.10 成骨生长肽 |
| 2.2 成骨细胞 |
| 2.2.1 成骨细胞的来源 |
| 2.2.2 成骨细胞功能 |
| 2.2.3 成骨细胞分化标志物 |
| 2.2.3.1 碱性磷酸酶(alkaline phosphatase;简称ALP) |
| 2.2.3.2 骨桥蛋白(osteopontin;简称OPN) |
| 2.2.3.3 骨钙蛋白(BGP) |
| 2.2.4 成骨细胞分化调控途径 |
| 2.2.4.1 Ihh信号传导与成骨分化 |
| 2.2.4.2 TGF-β/BMPs信号传导与成骨分化 |
| 2.2.4.3 MAPK信号传导途径与成骨分化 |
| 2.2.4.4 Wnt/β-catenin信号传导途径与成骨细胞分化 |
| 2.2.4.5 FGFs信号传导与成骨分化 |
| 第三章 细胞微囊技术研究进展 |
| 3.1 微囊材料 |
| 3.2 目前医学领域应用较为广泛微囊种类 |
| 3.2.1 海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠 |
| 3.2.2 海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠 |
| 3.3 微囊发生器的研制 |
| 3.4 影响微囊性能的主要因素 |
| 3.5 功能细胞微囊技术在治疗领域的应用 |
| 3.5.1 微囊化胰岛移植治疗糖尿病 |
| 3.5.2 微囊化肝细胞治疗肝脏疾病 |
| 3.5.3 微囊化细胞治疗中枢神经系统疾病 |
| 3.5.4 微囊化细胞治疗甲状旁腺功能低下症 |
| 3.5.5 微囊化细胞在骨科领域的应用 |
| 3.5.6 微囊化细胞在其他医学领域的应用 |
| 3.6 微囊化细胞技术在基因治疗领域的应用 |
| 3.6.1 血友病基因治疗 |
| 3.6.2 帕金森病基因治疗 |
| 3.6.3 肿瘤基因治疗 |
| 3.7 细胞微囊移植存在的问题 |
| 第二部分 试验研究 |
| 第四章 奶牛骨钙素基因的克隆与原核表达 |
| 4.1 研究背景 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 试验动物 |
| 4.2.2 主要试验材料 |
| 4.2.3 主要仪器设备 |
| 4.2.4 奶牛骨钙素基因克隆及同义突变 |
| 4.2.4.1 总RNA的提取 |
| 4.2.4.2 RT-PCR扩增奶牛BGP基因 |
| 4.2.4.3 成熟蛋白基因的定点同义突变 |
| 4.2.4.4 目的序列与载体的连接 |
| 4.2.4.5 感受态菌的制备 |
| 4.2.4.6 重组质粒的转化 |
| 4.2.4.7 重组质粒的小量制备(碱裂解法) |
| 4.2.4.8 重组质粒双酶切鉴定 |
| 4.2.4.10 重组质粒的序列测定 |
| 4.2.5 表达载体构建 |
| 4.2.6 连接产物的转化 |
| 4.2.7 重组质粒的PCR鉴定 |
| 4.2.8 重组表达菌的诱导 |
| 4.2.9 表达蛋白检测 |
| 4.2.9.1 SDS-PAGE样品的制备 |
| 4.2.9.2 聚丙烯酰胺凝胶电流(SDS-PAGE) |
| 4.2.10 多克隆抗体的制备 |
| 4.2.11 免疫印记(Western-blot)分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 cDNA的扩增与克隆 |
| 4.3.2 骨钙素蛋白基因同义定点突变 |
| 4.3.3 重组质粒序列的测定 |
| 4.3.4 表达产物SDS-PAGE电泳 |
| 4.3.5 Western-blot方法检测多克隆抗体 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 成骨生长肽对奶牛骨髓基质干细胞促成骨分化研究 |
| 5.1 研究背景 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 试验动物 |
| 5.2.2 主要试验试剂及配制 |
| 5.2.3 主要试验仪器和设备 |
| 5.2.4 骨髓基质干细胞的培养 |
| 5.2.4.1 原代培养 |
| 5.2.4.2 传代培养 |
| 5.2.5 骨髓基质干细胞体外培养生物学特性观察 |
| 5.2.5.1 细胞形态观察 |
| 5.2.5.2 矿化结节染色 |
| 5.2.5.3 骨钙素mRNA表达 |
| 5.2.6 骨髓基质干细胞增值的检测 |
| 5.2.7 成骨生长肽对ALP及骨钙素活性的影响 |
| 5.2.8 成骨生长肽对矿化结节的影响 |
| 5.2.9 Western-blot检测eNOS |
| 5.2.9.1 SDS-PAGE样品的制备 |
| 5.2.9.2 聚丙烯酰胺凝胶电流(SDS-PAGE) |
| 5.2.9.3 免疫印记(Western-blot)分析 |
| 5.2.10 L-NAME阻断OGP促进骨髓基质干细胞分化 |
| 5.2.11 数据处理 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 细胞形态观察及生物学特性 |
| 5.3.2 OGP对奶牛骨髓机制干细胞的增殖影响 |
| 5.3.3 OGP调节奶牛骨髓基质干细胞分化与矿化 |
| 5.3.4 OGP对eNOS表达的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 OGP对奶牛成骨细胞的作用研究 |
| 6.1 研究背景 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 试验动物: |
| 6.2.2 主要试验试剂及配制 |
| 6.2.3 主要试验仪器和设备 |
| 6.2.4 奶牛成骨细胞培养 |
| 6.2.5 成骨细胞鉴定 |
| 6.2.6 细胞增殖的检测 |
| 6.2.7 细胞内ALP活性检测 |
| 6.2.8 细胞钙化结节的测定 |
| 6.2.9 成骨细胞骨钙素测定 |
| 6.2.10 shRNA表达载体构建 |
| 6.2.11 Osterix-RNAi阻断OGP促进奶牛成骨细胞分化 |
| 6.2.12 数据处理 |
| 6.3 实验结果 |
| 6.3.1 成骨细胞鉴定 |
| 6.3.2 OGP对成骨细胞增殖活性的影响 |
| 6.3.3 OGP对细胞上清液中ALP活性的影响 |
| 6.3.4 OGP对奶牛成骨细胞骨钙素及矿化的影响 |
| 6.3.5 OGP对osterix表达的影响 |
| 6.3.6 Osterix-RNAi阻断OGP诱导的成骨细胞分化 |
| 6.4 讨论 |
| 第七章 氧自由基对微囊化细胞体内移植增殖的影响 |
| 7.1 研究背景 |
| 7.2 材料与方法 |
| 7.2.1 试验动物 |
| 7.2.2 试验材料 |
| 7.2.3 试验仪器设备 |
| 7.2.4 细胞培养 |
| 7.2.5 微囊化细胞制备 |
| 7.2.6 细胞微囊移植 |
| 7.2.7 血清指标的测定 |
| 7.2.8 AO/EB染色 |
| 7.2.9 数据处理 |
| 7.3 实验结果 |
| 7.3.1 微囊细胞体内增殖 |
| 7.3.2 血清氧自由基及抗氧化物酶测定 |
| 7.3.3 微囊化细胞移植体内活性观察 |
| 7.4 讨论 |
| 第八章 OGP转基因细胞微囊体内及体外增殖及分泌特性研究 |
| 8.1 研究背景 |
| 8.2 材料与方法 |
| 8.2.1 试验动物 |
| 8.2.2 主要试验试剂 |
| 8.2.3 试验仪器设备 |
| 8.2.4 OGP基因稳定转染 |
| 8.2.5 细胞微囊制备 |
| 8.2.6 细胞微囊培养 |
| 8.2.7 骨质疏松模型建立 |
| 8.2.8 细胞微囊移植 |
| 8.2.9 微囊细胞增殖检测 |
| 8.2.10 AO/EB染色 |
| 8.2.11 OGP检测 |
| 8.2.12 测量骨密度及收集血样 |
| 8.2.13 指标测定 |
| 8.2.14 数据处理 |
| 8.3 实验结果 |
| 8.3.1 OGP转基因细胞稳定表达筛选 |
| 8.3.2 OGP转基因细胞微囊体外增殖及分泌 |
| 8.3.3 OGP转基因细胞微囊在骨质疏松模型体内增殖分泌 |
| 8.3.4 醋酸泼尼松龙对骨密度及血清碱性磷酸酶的影响 |
| 8.3.5 醋酸泼尼松龙对血清氧自由基及SOD活性的影响 |
| 8.4 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
（7）体内灌注诱导骨髓基质干细胞构建组织工程骨的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 文献综述 |
| 第1章 引言 |
| 第2章 骨髓基质干细胞在骨组织工程学中的应用进展 |
| 2.1 骨髓基质干细胞来源与获取 |
| 2.2 骨髓基质干细胞接种数量与密度 |
| 2.3 骨髓基质干细胞生物学特性 |
| 2.4 骨髓基质干细胞与支架材料 |
| 2.5 骨髓基质干细胞与生长因子 |
| 第3章 骨组织工程血管化的研究进展 |
| 3.1 血管再生的机制 |
| 3.2 组织工程骨血管化的策略 |
| 3.3 问题与展望 |
| 第4章 生长因子促进成骨作用的研究与应用进展 |
| 4.1 骨形态形成蛋白 |
| 4.2 碱性成纤维细胞生长因子 |
| 4.3 转化生长因子-β |
| 4.4 联合应用 |
| 4.5 临床试验 |
| 4.6 问题与展望 |
| 第二部分 课题创新性专题论述 |
| 第5章 骨组织工程研究的方法论检讨及其思路创新 |
| 5.1 基于分析主义的骨组织工程研究进程 |
| 5.2 分析主义研究路径面临的困境 |
| 5.3 整体论思维与骨组织工程研究的路径选择 |
| 5.4 结语 |
| 第三部分 实验研究 |
| 第6章 山羊骨髓基质干细胞体外培养 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.2 结果 |
| 6.3 讨论 |
| 第7章 rhBMP-2 和rhbFGF 对山羊骨髓基质干细胞的增殖效应 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.2 结果 |
| 7.3 讨论 |
| 第8章 rhBMP-2 和rhbFGF 对山羊骨髓基质干细胞的分化效应 |
| 8.1 材料与方法 |
| 8.2 结果 |
| 8.3 讨论 |
| 第9章 增强型绿色荧光蛋白基因质粒转染骨髓基质干细胞 |
| 9.1 材料与方法 |
| 9.2 结果 |
| 9.3 讨论 |
| 第10章 增强型绿色荧光蛋白基因质粒标记技术示踪组织工程化骨形成 |
| 10.1 材料与方法 |
| 10.2 结果 |
| 10.3 讨论 |
| 第11章 山羊胫骨大节段骨缺损动物模型的制备 |
| 11.1 材料与方法 |
| 11.2 结果 |
| 11.3 讨论 |
| 第12章 近同构模型修复山羊胫骨大段骨缺损的初步研究 |
| 12.1 材料与方法 |
| 12.2 结果 |
| 12.3 讨论 |
| 第13章 总结与展望 |
| 13.1 结论 |
| 13.2 本论文创新之处 |
| 13.3 进一步工作的方向 |
| 致 谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
（8）珍珠层人工骨骨诱导作用及相关机制实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 珍珠层水溶性提取物诱导人骨髓基质细胞成骨性分化的作用 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 珍珠层水溶性提取物对骨髓基质细胞-成骨细胞复合培养体系的生物学作用 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 珍珠层水溶性提取物诱导 SD大鼠骨髓基质细胞体内异位成骨作用 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第四章 珍珠层人工骨与人骨髓基质细胞的生物相容性 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 在读期间撰写论文 |
| 在读期间参编着作 |
| 中英文对照缩略词表 |
| 统计学合格证明、实验动物合格证明 |
| 致谢 |
（10）PRP诱导人BMSc体内成骨及免疫配型不相合人BMSc混合培养实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一章 PRP对诱导培养的人骨髓基质干细胞成骨活性的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 PRP诱导人骨髓基质干细胞与珊瑚羟基磷灰石的生物相容性 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 PRP诱导培养人骨髓基质干细胞体内异位成骨实验研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 免疫配型不相合人骨髓基质干细胞体外混合培养研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 附录 缩略词表 |
| 成果 |
| 致谢 |
| 原创性声明及版权使用授权说明 |
四、骨髓基质细胞的生物学特性及应用研究（论文参考文献）
- [1]1.当归多糖逆转5-FU介导骨髓基质细胞成骨/成脂分化失衡的作用及机制研究 2.人参皂苷Rg1通过FOXO1转录因子预防D-半乳糖诱导的小鼠脂肪性肝病[D]. 齐嵘嘉. 重庆医科大学, 2020(12)
- [2]新型多孔钽金属的制备及在股骨头坏死治疗中的应用[D]. 谢辉. 大连理工大学, 2019(01)
- [3]NF-κB信号通路在慢性淋巴细胞白血病中的作用和机制探讨[D]. 蒋敏. 苏州大学, 2019(04)
- [4]骨髓基质干细胞的生物学特性及对胶质瘤的趋向效应的实验研究[D]. 刘阳. 第四军医大学, 2011(03)
- [5]神经激肽受体-1与乳腺癌侵袭转移的相关性研究[D]. 周云丽. 天津医科大学, 2010(03)
- [6]OGP对奶牛成骨细胞、骨髓基质干细胞的作用及其微囊化研究[D]. 祝海宝. 华中农业大学, 2009(07)
- [7]体内灌注诱导骨髓基质干细胞构建组织工程骨的实验研究[D]. 戴江华. 南昌大学, 2007(03)
- [8]珍珠层人工骨骨诱导作用及相关机制实验研究[D]. 杨春露. 第一军医大学, 2007(02)
- [9]骨髓基质细胞生物学特性及其在脊髓损伤修复中的应用[J]. 石永江,刘宏亮,姚忠祥. 中国临床康复, 2006(41)
- [10]PRP诱导人BMSc体内成骨及免疫配型不相合人BMSc混合培养实验研究[D]. 张洪涛. 第一军医大学, 2006(12)