一、人穿孔素C肽段的单克隆抗体和免疫血清的制备和鉴定（论文文献综述）
贾芳[1]（2021）在《布鲁氏菌S19 bvfA基因缺失株免疫保护性及其与睾丸支持细胞互作组学研究》文中进行了进一步梳理布鲁氏菌病（布病）作为一种全球性的人畜共患病,严重影响着流行地区居民的身体健康和经济发展,因此,布病的防控工作受到越来越多国家的重视。目前,免疫预防是控制布病的主要手段之一。由于现有的动物疫苗存在毒性残留和干扰常规血清学检测等缺点,制备高效、安全的毒力基因缺失活疫苗成为控制布病的新趋势。bvfA（Brucella virulence factor A）基因是布鲁氏菌（Brucella）特有的赋予其在宿主胞内建立复制生态位的毒力基因。但bvfA基因在布鲁氏菌中具体生物学功能尚未明确,特别是bvfA基因在布鲁氏菌感染靶细胞过程中的功能尚处于空白。方法:本研究利用开放性读码框预测软件确定编码BvfA蛋白的基因序列,利用PCR技术测定bvfA基因在临床布鲁氏菌分离株中的分布频率,利用基因同源重组和细菌接合转移原理构建B.abortus S19△bvfA菌株及其回补株,模拟细胞内环境条件检测B.abortus S19△bvfA菌株的应激能力;CCK-8法评估B.abortus S19△bvfA菌株在TM4睾丸支持细胞中的增殖能力,LDH法检测B.abortvs S19ΔbvfA菌株对TM4睾丸支持细胞的损伤性,用ELISA方法评价B.abortus S19△bvfA菌株的免疫原性和免疫反应性,用组织细菌计数法评估B.abortus S19△bvfA菌株对布鲁氏菌强毒株攻击的免疫保护性;HE组织切片染色展示B.abortus S19△bvfA菌株与其它布鲁氏菌对组织损伤的区别。用Illumina Hiseq测序和液相色谱-串联质谱技术在转录组、蛋白质组和代谢组水平上联合分析bfA基因在布鲁氏菌中的作用及其在布鲁氏菌感染宿主时的作用。结果:（1）获得了大小为336 bp的bvfA基因序列,将bvfA基因提交到Genbank中获得基因序列号（MN651999）;确定bvfA基因在临床布鲁氏菌分离株中100%保有。（2）B.abortus S19△bvfA菌株较它的亲本株和回补株生长速度慢;在热刺激、高盐、高渗、强酸和抗菌素条件下,B.abortus S19△bvfA菌株生长均受到抑制,仅在氧化压力下生长良好（p<0.05）。（3）在12 h、24 h和48 h时,B.abortus S19△bvfA菌株入侵TM4睾丸支持细胞富集到的菌落数分别是B.abortus S19菌株的90%、95%和96%;在12 h、24 h和48 h时,TM4睾丸支持细胞感染B.B abortus S19△bvfA菌株和B.abortus S19菌株后的死亡率分别是13.39%和7.14%,14.97%和12.40%,33.8%和31.2%。（4）免疫B.abortus S19△bvfA菌株和B.abortus S19菌株小鼠血清中抗体效价1～3周均呈上升趋势,4周趋于平稳,两者抗体水平无显着性差异（P>0.05）。血清中IFN-γ含量在1周～2周升高,IL-2在1周～4周升高,IL-4在2周～3周升高。B.abortvs S19△bvfA菌株和.abortusS19菌株免疫小鼠血清抗体与BvfA蛋白反应的抗体效价分别是2.16和4.21（2周）,2.16和4.52（3周）。免疫B.abortus S19△bvfA菌株小鼠脾载菌量是B.abortus S19菌株的86%（1周）、93%（2周）和84%（4周）。小鼠免疫B.abortus S19△bvfA菌株和B.abortus S19菌株后攻强毒株B.melitensis 16M,脾载菌量是未免疫攻强毒株B.tmeliensis 16M的0.03%和2.9%（1周）,0.75%和0.33%（2周）。小鼠免疫B.abortus S19△bvfA菌株和B.abortus S19菌株后攻强毒株B.abortus 2308,脾载菌量是未免疫攻强毒株B.abortus 2308的9.8%和6.5%（1周）,6.8%和6.8%（2周）。（5）转录组学和蛋白质组学技术关联分析显示,B.abortuAs S19△bvf菌株RNA聚合酶中的rpoA、rpoC和rpoB基因表达量下调;蛋白质组学和代谢组学技术关联分析显示,B.abortus S19△bvfA菌株和B.S19菌株蛋白质组和代谢组差异主要表现为ABC转运、嘌呤代谢和氨酰-tRNA生物合成。（6）转录组学和蛋白质组学技术关联分析显示,分别感染B.abortus S19△bvfA菌株和B.abortus S19菌株的TM4睾丸支持细胞之间的差异表现为逆行神经信号通路;蛋白质组学和代谢组学技术关联分析显示,感染B.abortus S19△bvfA菌株和B.abortus S19菌株的TM4睾丸支持细胞之间的差异表现为逆行神经信号通路,矿物质吸收和鞘脂信号通路。结论:（1）bvfA基因参与了 B.abortus S19菌株在宿主细胞中的增殖和对宿主细胞内环境的适应。B.abortu sS19△bvfA菌株在感染早期（12h）对TM4睾丸支持细胞的损伤强于其他布鲁氏菌。小鼠腹腔注射B.abortus S19△bvfA菌株1周即能引起免疫应答,且具有很好的免疫保护效果。B.S19△bvfA菌株对小鼠脾脏和睾丸的毒性及病理损伤均小于B.abortus S19菌株。（2）bvfA基因主要参与B.abortus S19菌株RNA聚合酶的转录、ABC转运、嘌呤代谢和氨酰-tRNA生物合成;bvfA基因能干扰宿主细胞的矿物质吸收、鞘脂信号通路和线粒体中NADH泛醌氧化还原酶复合体的功能。感染B.abortus S19△bvfA菌株的TM4睾丸支持细胞CatSper2表达量高度下调,推测CatSper通道可能是布鲁氏菌引起不育的主要靶点,P53表达量增加,推测bvfA基因能抑制TM4睾丸支持细胞的凋亡。
买为丽旦·衣明江[2]（2021）在《纳秒脉冲消融治疗肝细胞肝癌的免疫学效应及其作用机制研究》文中进行了进一步梳理目的:肝细胞肝癌（HCC）是目前严重危害人类生命健康的重大疾病,是全球最常见的恶性肿瘤之一。新型纳秒脉冲消融（ns PEF）在激活抗肿瘤免疫方面的特色优势逐渐成为肿瘤免疫治疗的研究热点,但其作用机制不明确。目前PD-1抗体治疗是公认的抗肿瘤免疫治疗方法。由此,本研究探讨ns PEF消融在肝细胞肝癌免疫激活效应中的作用机制,并与PD-1抗体治疗作对比,为ns PEF免疫疗法的临床应用提供理论基础。方法:（1）培养及传代用荧光素酶标记的Hepa1-6肝癌细胞株;通过C57BL/6J小鼠肝脏注射Hepa1-6肝癌细胞株建立肝癌移植瘤模型;将24只原位移植瘤模型小鼠分为三组:ns PEF组、PD-1抗体治疗组和对照组,对ns PEF组小鼠进行一次ns PEF消融处理,消融仪物理参数为:脉冲宽度300ns、电压20kv/cm、频率4Hz、脉冲1000次;对PD-1抗体治疗组小鼠腹腔注射PD-1抗体,间隔3天,共3次给药;治疗结束后处死小鼠,取血分离血清、制备肿瘤组织单细胞悬液,通过流式细胞术检测肿瘤组织中CD3+T、CD4+T、CD8+T、CD19+B、NK细胞比例;采用CBA技术检测外周血Th1（IL-2、IFN-γ、TNF-α）和Th2（IL-4、IL-5、IL-6、IL-10）类细胞因子浓度;通过统计学方法分析肿瘤局部免疫细胞比例和外周血细胞因子浓度的差异。（2）通过DIA定量蛋白质组学技术筛选ns PEF组和PD-1抗体治疗组差异表达的蛋白质;采用生物信息学方法鉴定出与免疫相关的重要差异蛋白。（3）通过基于多重免疫组化的PE Vectra全光谱采集技术,同时标记肿瘤局部T、B、NK细胞和差异蛋白,通过Inform定量分析软件计算各指标表达密度及差异蛋白与T、B、NK细胞特异性指标的共定位关系;通过统计学方法分析免疫细胞和差异蛋白表达密度在各组间的差异及相关性。结果:（1）ns PEF组和PD-1抗体治疗组CD3+T、CD4+T、B、NK细胞比例均明显高于对照组;ns PEF组CD4+/CD8+比值明显高于对照组,PD-1抗体治疗组CD8+T细胞比例明显高于对照组;ns PEF组Th1类细胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-α浓度均明显高于对照组,PD-1抗体治疗组IL-2浓度明显高于对照组;ns PEF组Th2类细胞因子IL-4、IL-5、IL-6、IL-10浓度均明显高于对照组,PD-1抗体治疗组IL-4、IL-5、IL-10浓度明显高于对照组。（2）DIA质谱分析筛选出ns PEF组和PD-1抗体治疗组差异表达蛋白分别共有181和763个,其中与免疫病理改变相关者分别为21和35个;结合文献报道和本研究研究方向,ns PEF组差异蛋白LXN、GRN、TGF-β1、ELNE选为进一步研究对象,其中TGF-β1、ELNE是ns PEF组和PD-1抗体治疗组共同差异蛋白。（3）LXN、GRN、TGF-β1、ELNE与T、B、NK细胞特异性指标均有不同程度的共定位,其中LXN在B细胞上的表达有显着性差异,并二者有显着相关性;GRN在NK细胞上的表达有显着性差异,并二者有显着相关性;TGF-β1在T细胞上的表达有显着性差异,并二者有显着相关性,ELNE在T细胞上的表达有显着性差异,并二者有显着相关性。结论:ns PEF消融可引起肿瘤微环境中免疫细胞的大量浸润,及外周血多种细胞因子的改变,表明ns PEF消融治疗具有调节抗肿瘤免疫、增强体液免疫以及免疫杀伤功能的作用;ns PEF消融可以引起肿瘤局部多种蛋白质的差异表达,其中与免疫微环境介导的肿瘤侵袭、转移相关蛋白主要有LXN、GRN、TGF-β1、ELNE,这些差异蛋白作为调节ns PEF消融免疫效应的重要因子,可能通过调控T、B、NK细胞激活抗肿瘤免疫;TGF-β1、ELNE是ns PEF组和PD-1抗体治疗组共同的差异表达蛋白,提示二者可能是肝癌免疫治疗过程中的重要调控因子。
王秋霞[3]（2020）在《基于多肽芯片技术的H5亚型禽流感病毒HA2蛋白抗原表位筛选及DIVA疫苗候选株的构建》文中认为H5亚型禽流感（Avian influenza,AI）在我国已流行多年,是导致禽类高发病率和高死亡率的主要禽病之一。由于免疫选择压的存在,H5亚型禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）的进化变得更为复杂,各分支之间的抗原差异较大,疫苗的升级周期也越来越短。DIVA（Differentiate infected from vaccinated animals）疫苗可用于区分自然感染和疫苗免疫的动物,使用后有利于H5亚型AIV的流行病学调查和净化检测。但是,常见的DIVA策略由于病毒重组、免疫原性不佳等原因鲜少能够投入实际运用。HA蛋白是位于AIV囊膜上的糖蛋白,能够诱导机体产生具有保护性的中和抗体。相较于HA1蛋白,HA2蛋白的保守性更佳,逐渐成为AIV通用型抗原表位研究中的主要靶蛋白。而多肽芯片凭借高通量、稳定性好和检测灵敏度高等特点,在临床检测、医药研发等领域都得到了较好应用。因此,基于多肽芯片技术的H5亚型AIV HA2蛋白抗原表位筛选有望为H5亚型AIV的DIVA疫苗设计提供新方向。1.基于多肽芯片技术的H5亚型禽流感病毒HA2蛋白抗原表位筛选以H5亚型AIV分离株A/Mallard/Huadong/S/2005为母本,合成了 18条针对HA2蛋白长度为20个氨基酸且互相重叠10个氨基酸的肽段,将其点样至改性硅胶膜（iPDMS）制成多肽芯片,首先确定多肽与免疫血清结合的反应条件,再测定多肽与不同亚型AIV高免血清之间的结合能力,初步筛选到一条能够与H1、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9和H10亚型AIV高免血清均能结合的多肽（14th肽,KELGNGCFEFYHKCDNECME）以及两条仅与H5亚型AIV免疫血清结合的特异性多肽（12th 肽,HDSNVKNLYDKVRLQLRDNA;17th 肽,QYSEEARLKREEISGVKLES）。2.基于HA2蛋白的禽流感病毒共同抗原表位的鉴定对14th肽的广谱性特征开展了进一步的鉴定。将14th肽进一步细切为4条长度为11个氨基酸且互相重叠8个氨基酸的短肽（14-1,KELGNGCFEFY;14-2,GNGCFEFYHKC;14-3,CFEFYHKCDNE;14-4,FYHKCDNECME）,测定其与不同亚型AIV免疫血清的结合能力。结果显示,14-4肽（485-FYHKCDNECME-495）具备与H1、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9和H10亚型AIV免疫血清广谱结合活性,而14-1、14-2和14-3肽仅与个别血清有阳性响应。进一步对14-4肽的关键氨基酸“YHKCD”设计了 16种缺失/突变模式,通过反向遗传技术拯救病毒,应用Western-blot分析重组病毒与14th肽偶联BSA的免疫血清反应。结果显示,成功拯救重组病毒S-Y-G、S-H-G、S-K-G和S-D-G,氨基酸（K或D）的突变会降低重组病毒HA2蛋白与肽免疫血清的结合能力。通过免疫表位数据库（Immune epitope database,IEDB）的表位分析显示,该肽段包含MHC-II限制性的T细胞表位,部分实验表明其能够影响IL-2和IFNg的释放。以上所有结果表明,该14-4肽含有多个亚型禽流感病毒的广谱性表位,具有开发为通用型AIV诊断靶标的潜能。3.基于H5亚型禽流感病毒HA2蛋白特异性抗原表位的DIVA疫苗候选株构建挑选了 6株来自不同谱系、效价稳定的H5亚型AIVCK/JS/ZJ0104/16（2.3.2.1e,ZJC）、CK/JS/DT0303/16（2.3.2.1e,DTC）、GS/JS/HJ0105/16（2.3.4.4c,HJG）、GS/JS/YZ1111/16（2.3.4.4d,YZG）、GS/GD/GD0531/17（2.3.4.4d,GDG）和CK/JS/YZ1111/16（2.3.4.4e,YZC）,制备高免血清进行交叉血凝抑制试验筛选疫苗候选株。同时,基于前期所筛选的H5亚型AIV特异性表位12th肽（HDSNVKNLYDKVRLQLRDNA）和 17th 肽（QYSEEARLKREEISGVKLES）,用H1和H3亚型AIV相应表位替换这两个表位构建重组病毒。结果显示DTC的高免血清对ZJ0104、DTC、HJG和GDG的HI效价均可达到7 log2以上,对YZG和YZC的HI效价分别为4 1og2和2 1og2。相较而言,DTC毒株的广谱性更好,可作为H5亚型AIV疫苗候选株。通过替换相应的表位成功拯救了 DTC-Lo-121、DTC-Lo-171、DTC-Lo-173、DTC-Lo-121171 和 DTC-Lo-121173。运用多肽芯片进一步评估发现,单表位替换株DTC-Lo-121免疫血清对12th肽和17th肽均有阳性响应,DTC-Lo-171和DTC-Lo-173的免疫血清则对12th肽和17th肽的响应均小于检测线,双表位替换株DTC-Lo-121171的免疫血清仅对17th肽失去响应,DTC-Lo-121173免疫血清仅与12th肽无响应。以上结果表明通过17th肽的替换,重组病毒DTC-Lo-171和DTC-Lo-173具有较好的DIVA特性,可作为H5亚型禽流感防控的DIVA疫苗候选株,为进一步开发H5亚型AIV DIVA疫苗奠定基础。
杨若恒[4]（2020）在《寨卡病毒重组亚单位疫苗在非人灵长类水平的评估及其保护机制研究》文中进行了进一步梳理寨卡病毒（Zika virus,ZIKV）是属于黄病毒科黄病毒属的虫媒病毒。该病毒在世界范围内广泛分布,且其感染会对人类健康造成威胁。ZIKV能通过虫媒传播,母婴传播和性传播等多种途径在人群中扩散,提示安全有效的ZIKV疫苗是预防该病毒的必要手段。截至2020年4月,世界范围内仍未有对ZIKV特效的药物和疫苗上市,在研发阶段的产品包括减活疫苗,灭活疫苗、与DNA、m RNA、以及蛋白等形式的亚单位疫苗等。病毒的性质和其他黄病毒属疫苗的研发工作为ZIKV疫苗设计提供了理论依据和宝贵经验。在登革病毒研究中,人们发现病毒感染和减活疫苗诱导的部分抗体有通过抗体依赖的增强作用增加病毒感染,加重感染症状的副作用。寨卡病毒和登革病毒有相同的病毒结构,相似的氨基酸序列,重叠的分布区域,且二者产生的抗体能相互增强另一种病毒的感染。以上现象提示一个优秀的ZIKV疫苗不仅需要有效地抑制该病毒本身,还应避免因抗体依赖的增强作用带来的风险。本团队致力于重组亚单位ZIKV疫苗的研究工作。该类疫苗不仅安全性高,而且还是研究免疫原优化策略的良好形式。在前期研究中,我们设计了包含ZIKV包膜蛋第三结构域的EDⅢ蛋白和包含包膜蛋白全部胞外域的E80蛋白。小鼠水平的评估结果显示,两种免疫原均能小鼠体内诱导中和抗体反应和抗原特异性的T细胞反应,并能在小鼠保护模型中有效抑制ZIKV的复制,减轻ZIKV感染造成的病症。在本课题中,我们进一步在非人灵长类动物模型中评估了EDⅢ和E80蛋白的免疫原性和保护性,并对其提供保护的机制进行了深入研究。免疫原性检测的结果显示,EDⅢ和E80在猴体内皆能诱导抗原特异性的抗体反应和T细胞反应,且两种免疫原诱导的抗体均能结合ZIKV病毒颗粒并在体外空斑减少中和试验中抑制ZIKV对细胞的感染。这些结果提示EDⅢ和E80免疫有在猴体内抑制ZIKV感染的潜能。基于此,我们通过攻毒实验及后续的病毒载量检测等实验评估了两种免疫原在体内的保护效价。而该实验结果的显示EDⅢ和E80在猴体内有截然不同的保护效果,即EDⅢ免疫猴体内的病毒载量并不低于PBS对照组猴,而E80免疫猴血液和组织中ZIKV的病毒载量均被有效抑制。为了探究造成上述结果的原因,我们全面比较了非保护性的EDⅢ蛋白和保护性的E80蛋白诱导的抗体反应的性质。我们通过对病毒血症数据的统计分析进一步验证了E80免疫抑制了ZIKV在猴体内的复制,而EDⅢ免疫增强了ZIKV造成的病毒血症的现象。在体外ADE实验中,我们发现EDⅢ和E80诱导的抗体在下降到一定浓度时均有造成ADE的可能。考虑到攻毒实验和免疫反应检测间有2周的间隔,我们比较了两个时间点各组猴抗原特异性抗体、病毒结合性抗体、抗体中和滴度的变化幅度。结果显示,虽然二者诱导的抗原特异性抗体的变化幅度相同,但EDⅢ诱导的病毒结合性抗体反应的可持续性低于E80蛋白诱导相应抗体,导致在攻毒实验开始时EDⅢ组猴血清对ZIKV的抑制能力显着低于E80猴血清,且处于和PBS对照组猴无显着性差别的水平。这些结果揭示了两种亚单位免疫原保护效价不同的主要原因,强调了疫苗诱导的中和抗体的数量、质量、可持续性的重要性。EDⅢ诱导抗体对抗原本身的强结合能力和对病毒颗粒的弱结合能力提示其诱导的免疫反应由不在病毒表面暴露的表位所主导。我们对抗体结合位点的进行了鉴定以确认该表位的位置。结果显示,EDⅢ诱导的抗体识别的表位覆盖了该蛋白的大部分区域,且大多不在病毒表面充分暴露。该结果表明EDⅢ蛋白的效价被其在病毒表面较低的暴露程度所限制。我们对E80免疫原诱导抗体识别的区域也进行了检测,其结果显示该蛋白诱导的抗体反应由EDI/II区域主导。在基于肽段的表位鉴定实验中,E80血清主要结合位于EDI/II区域中在病毒表面充分暴露的表位,而对EDⅢ区域仅有微量的结合且主要针对非中和抗体表位。这些结果提示E80蛋白中的EDI/II区域是在恒河猴体内诱导保护性免疫反应的关键组分。本课题还研究了EDⅢ和E80诱导的抗体与DENV交叉作用的能力。实验结果显示,仅有E80蛋白诱导的抗体能交叉结合DENV病毒颗粒,且相应抗体在体外实验中既能抑制DENV也有增强其感染的能力。该现象揭示了E80免疫原的潜在优势和风险,提示进一步优化E80免疫原以研发ZIKV/DENV广谱疫苗的可行性。综上,本研究显示E80是一个更有前景的疫苗候选者;提示疫苗诱导的病毒结合性抗体的数量,中和效价以及可持续性对疫苗的保护效价都至关重要;提示免疫原在病毒表面暴露的程度对疫苗设计有辅助性作用。这些结果对ZIKV疫苗研发,ZIKV疫苗评估指标的选择,以及亚单位疫苗的设计等多个层面都具有重要意义。
袁明翠[5]（2020）在《靶向OX40主动免疫的抗肿瘤免疫效应》文中指出[背 景]CD8+T细胞在细胞免疫中起重要作用,是抗肿瘤的主要效应细胞,可识别特定的肿瘤抗原,进而分泌IFN-γ、穿孔素、颗粒酶等调节及发挥杀伤肿瘤细胞的作用。而Tregs能通过干扰肿瘤细胞的抗原提呈、表达抑制性受体、分泌抑制性分子、借助代谢调控如耗竭IL-2等机制,来抑制抗肿瘤效应细胞作用,从而帮助肿瘤细胞实现免疫逃逸。效应细胞与免疫抑制细胞的相互作用,决定了肿瘤的发展方向。肿瘤浸润的效应T细胞常因受到肿瘤及免疫抑制细胞的抑制信号传递,增殖、功能及生存受到显着抑制,无法有效识别并杀伤肿瘤细胞。目前临床上使用的免疫检查点抑制剂抗体（包括CTLA-4、PD-L1、PD-1等）,通过调控肿瘤微环境中的抑制性分子网络,即实现“免疫正常化”,取得了良好的疗效,是肿瘤免疫治疗的重大突破。然而,其仍存在显着不足,如临床响应率有限、系统性免疫激活副作用等。研究表明,在PD-L1高表达的癌症患者中,许多患者表现出了治疗耐药性。因此,仍需要探索更有效的单一和联合免疫疗法以增强免疫治疗效果。OX40（也被称作CD134/TNFRSF4）是第二代免疫检查点的代表性靶点之一,广泛表达于炎症和肿瘤部位,通过传递协同刺激信号,OX40使得活化的效应T细胞增殖及存活,同时有助于记忆T细胞的生成。此外,OX40还可降低肿瘤中Treg细胞的活性,进而维持效应T细胞的功能。OX40激动性抗体对效应T细胞的刺激增强和对Treg细胞的抑制作用,有助于机体发挥抗肿瘤效应。[目 的]本研究旨在探讨抗OX40主动免疫对小鼠肿瘤生长、抗肿瘤免疫应答的影响,以及与肿瘤疫苗的协同作用,为肿瘤免疫治疗提供一种新的策略。[方 法]通过抗原肽数据库中氨基酸的出现频率预测潜在的OX40线性B细胞表位;经基因重组技术将抗原表位插入至乙肝核心抗原（Hepatitis B core antigen,HBcAg）的优势抗原表位区域,纯化获得的蛋白经电镜观察病毒样颗粒（virus-like particles,VLPs）形态;VLPs经小鼠背部皮下免疫,以预防性策略评VLPs疫苗对小鼠4T1乳腺癌原位模型及HPV相关TC-1肿瘤模型的干预作用,筛选出有效的疫苗,随后以治疗性策略评价该疫苗对不同小鼠肿瘤模型的主动免疫干预作用:首先皮下接种TC-1或黑色素瘤B16-F10细胞,当肿瘤生长至2-3mm直径时进行VLPs疫苗免疫,共3次。进一步,评价抗OX40主动免疫对治疗性HPV疫苗效力的影响:皮下接种的TC-1肿瘤生长至2-3mm直径时进行OX40 VLPs免疫,共3次,第二次VLPs免疫六天后每间隔四天给予治疗性HPV疫苗共3次。每隔两天测量并记录小鼠肿瘤的直径及小鼠存活情况。[结 果]经分析预测获得7个潜在的抗原表位（P1-P7）;SDS-PAGE显示,重组HBcAg-P1-P7蛋白在大肠杆菌中都获得了有效表达,电镜显示纯化的目的蛋白都以VLP形式存在。以VLP免疫小鼠有效激发了 OX40特异的抗体应答。预防性免疫干预研究显示,P6对4T1肿瘤生长和肺转移产生了显着抑制,而P3、P7未呈现显着作用,且P6疫苗能显着增强小鼠脾脏和肿瘤组织中CD8+、Th1细胞的比例,提示增强了机体效应细胞应答,同时,抑制了免疫抑制细胞Treg与MDSC以及Th2应答。P4和P5对TC-1肿瘤生长产生了抑制,而P1、P2未呈现抑制作用。治疗性免疫干预研究显示,HBcAg-P6 VLPs疫苗能显着抑制小鼠TC-1和B16-F10肿瘤生长并提高荷瘤小鼠生存率。而HBcAg-P6 VLPs疫苗与治疗性HPV肿瘤疫苗PLGA/E7的联合应用相比于单一免疫干预显示了更强大、持久的肿瘤生长抑制作用,延长了荷瘤小鼠生存期并且部分小鼠的肿瘤可以完全治愈。[结 论]本研究成功构建并纯化制备了呈递OX40抗原表位的重组VLPs,且在小鼠不同肿瘤模型里进行评估,展示了靶向OX40的免疫调控可显着抑制肿瘤生长、提高荷瘤小鼠生存率、增强免疫效应细胞应答;此外,联合肿瘤抗原特异治疗性疫苗,相比于单一免疫表现出更强大的抗肿瘤效应,为肿瘤免疫治疗提供了一种有应用潜能的策略。
胡广[6]（2019）在《交叉反应性CD8阳性T细胞在抗肿瘤和抗病毒中的作用》文中提出随着科学技术的进步以及免疫学领域的发展,人类的生活水平有了很大的改善。然而当前,人类健康仍然受到肿瘤以及诸如黄病毒等病原体的威胁。肿瘤是一种高死亡率的全球化的疾病。面对越来越高的发病率,现有的肿瘤治疗手段已经很难达到理想的效果。肿瘤免疫治疗被认为是治疗,甚至是治愈肿瘤的希望。近年来,这一领域快速发展,已经引发了全球性的关注。由于多数肿瘤抗原属于自身抗原,受中枢耐受等机制的影响,机体对肿瘤抗原的免疫反应水平较低。因此,诱导抗原交叉反应性CD8阳性T细胞的产生,或许是一种有效的治疗肿瘤的策略。本文第一部分对诱导产生抗原交叉反应性CD8阳性T细胞的免疫策略进行了探究,并DCs根据优化的免疫策略,对其应用于肿瘤治疗的情况进行了研究,并发现CCL3细胞因子具有增强疫苗免疫反应的作用。寨卡病毒作为一种“新兴”的黄病毒,因其感染与孕妇分娩的胎儿小头畸形症以及成人格林巴列综合征的发生有关,受到越来越多的关注。对登革病毒的研究表明,异源化的登革病毒感染产生的登革病毒抗原特异的交叉反应性CD8阳性T细胞介导对之后寨卡病毒感染的保护性作用。那么同样作为黄病毒的日本脑膜炎病毒,在免疫后,产生的交叉反应性CD8阳性T细胞是否同样能介导对寨卡病毒感染的保护性作用呢?在本论文中的第二部分,我们对此进行了研究,初步结果表明,日本脑膜炎病毒免疫产生的CD8阳性T细胞具有保护小鼠对抗之后寨卡病毒感染的趋势。仍然需要更多的研究进行证实这一结果。
刘晶[7]（2019）在《基于FnBPA和CD11c单链抗体的侵入型乳酸菌构建及其分子免疫机制研究》文中研究指明猪流感（Swine influenza,SI）是由猪流感病毒（Swine influenza virus,SIV）引起的一种急性、高度接触性呼吸道传染病,其特征为突发咳嗽、呼吸困难、发热及迅速转归。SIV是一种球状结构的单股负链RNA分节段的病毒。其中血凝素（Hemagglutinin,HA）是SIV重要的膜蛋白,可以刺激机体产生中和抗体。目前,流感疫苗主要有灭活疫苗、减毒疫苗、基因工程活疫苗等,以乳酸菌作为粘膜疫苗递送载体也有研究,但递送抗原效率有待加强。本研究以植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum,L.plantarum）NC8株作为宿主菌,构建两种侵入型L.plantarum表达载体:一种是表达金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的侵袭素,即纤连蛋白结合蛋白A（Fibronectin binding protein A,FnBPA）;另一种是表达针对CD11c的单链抗体（single-chain variable fragment against CD11c,scFv-CD11c,简称aCD11c）。使用两种新型侵入型乳酸菌递送载体,以SIV的HA作为保护性抗原,探索其分子免疫机制。首先,我们构建了一株表面展示FnBPA的侵入型L.plantarum NC8-pSIP409-FnBPA。使用该菌株感染猪小肠上皮细胞（IPEC-J2）后,发现其对细胞的粘附与侵袭率分别为1.41%和0.15%,大约是空载体组的2倍和5倍。同时,将上述菌株与小鼠骨髓源树突状细胞（Bone marrow-derived dendritic cells,BMDCs）共培养,使用流式细胞术（Flow cytometry,FCM）检测菌株对BMDCs活化并以荧光定量PCR检测相应mRNA的表达情况。结果表明菌株NC8-pSIP409-FnBPA显着增强了BMDCs表面CD40和CD80表达水平（P<0.001）,同时基因IL-6和MyD88 mRNA的表达水平也显着提高（P<0.001）。同样,使用上述菌株免疫BALB/c小鼠,评价其免疫调节特性。结果显示NC8-pSIP409-FnBPA显着刺激派尔氏淋巴集结（Payer’s patches,PPs）中DCs的活化（P<0.001）以及提高脾脏CD4+T细胞中IL-4+（1.72%,P=0.0037）和IL-17A+（2.07%,P=0.0079）细胞百分比;ELISA结果表明血清中IL-4（P=0.0012）和IL-17A（P<0.001）的含量也显着增加。同时与空载体相比,NC8-pSIP409-FnBPA显着增加了小鼠肠系膜淋巴结（Mesenteric lymph nodes,MLN）（P<0.001）和PP结（P<0.001）中B220+B细胞数量并提高了FnBPA特异性IgG（1.72倍）和分泌型IgA（sIgA）（2.41倍）抗体滴度。其次,我们又构建一株表面展示表达aCD11c的靶向DCs的L.plantarum（NC8-pSIP409-aCD11c）。使用该菌株刺激BMDCs,发现该菌株对BMDCs的粘附与侵袭率分别为36.17%和2.23%,为空载体组的1.56倍和2.42倍。进而将携带真核质粒pValac-GFP的NC8-pSIP409-aCD11c菌株与BMDCs共培养36h后,使用FCM检测BMDCs中GFP表达以确定菌株对pValac-GFP的递送效率,结果表明:该菌株能显着增强BMDCs中GFP表达（P=0.0110）。将上述携带pValac-GFP的菌株口服免疫小鼠,免疫后PP结和MLN中GFP的表达在不同时间点均有所升高。此外,NC8-pSIP409-aCD11c菌株也能有效促进MLN中DCs的分化、成熟以及增加CD4+T细胞中IL-4+和IL-17A+细胞的百分比,同时提高PP结中B220+IgA+B细胞的含量。再次,我们使用上述两种侵入型载体表达了SIV的HA抗原,构建了三株乳酸菌分别为NC8-pSIP409-pgsA’-HA（HA）、NC8-pSIP409-FnBPA-pgsA’-HA（FnBPA-HA）和NC8-pSIP409-aCD11c-pgsA’-HA（aCD11c-HA）。将上述菌株免疫BALB/c小鼠,结果发现,与空载体组相比,HA组、FnBPA-HA组和aCD11c-HA组均能促进脾脏中DCs的活化和成熟,脾脏和MLN CD8+T细胞中IFN-γ+和穿孔素的表达以及PP结中B220+IgA+B细胞的产生;同时ELISA结果表明:与空载体组相比,表达HA的三株菌株免疫后均能显着提高小鼠血清中特异性IgG（2.28倍）及粪便（2.37倍）和气管冲洗液中sIgA（2.39倍）的抗体滴度,且均能产生中和抗体;将BALB/c小鼠感染10×LD50的流感病毒A/PuertoRico/8/1934（H1N1）,在感染后第7天,与HA组和FnBPA-HA组相比,aCD11c-HA组显着提高MLN中CD8+T细胞中IFN-γ+（P<0.001）和穿孔素（P<0.001）的表达,具有一定的抗病毒作用;FnBPA-HA组和aCD11c-HA组对IV的保护率为60%,HA组为40%。最后,探讨了aCD11c-HA乳酸菌在抗H1N1亚型IV中的分子免疫机制。以aCD11c-HA乳酸菌刺激BMDCs 12 h后,使用FCM检测菌株对BMDCs分化的影响,结果表明aCD11c-HA菌株显着促进BMDCs的活化。ELISA检测上述细胞上清中细胞因子的表达,发现aCD11c-HA菌株促进IL-12P70、抑制IL-6的分泌;分选未免疫小鼠脾脏的CD4+和CD8+T细胞,与上述激活的BMDCs共培养48 h后,使用FCM和ELISA分别检测细胞内IFN-γ+和穿孔素的表达及细胞分泌上清中IFN-γ的含量,发现aCD11c-HA菌株增强了分选CD4+T细胞中IFN-γ+（4.33%）以及CD8+T细胞中IFN-γ+（7.68%）和穿孔素（17.50%）的表达,同时促进细胞因子IFN-γ的分泌。与上一致,体内检测了脾脏和MLN中HA特异性CD8+T细胞中IFN-γ+（P<0.001）和穿孔素（P<0.001）的表达,aCD11c-HA组显着升高;并且aCD11c-HA组能显着促进脾脏T细胞的增殖（P<0.001）。使用磁珠分选免疫后各组小鼠的脾脏CD8+T细胞尾静脉回输NOD/Lt-SCID小鼠,24 h后感染5×LD50的IV,结果显示aCD11c-HA组的CD8+T细胞与HA组相比能延长NOD/Lt-SCID小鼠寿命2天,具有一定的保护作用。本研究构建了基于FnBPA蛋白及scFv-CD11c的两种侵入型植物乳杆菌,分别共表达了SIV的HA蛋白,与单表达HA的菌株相比,上述菌株免疫BALB/c小鼠后能显着增加对IV的攻毒保护率,尤其以scFv-CD11c共表达组在增强机体免疫反应方面更佳。进而通过FCM、流式分选、过继回输NOD/Lt-SCID小鼠等手段证实了aCD11c-HA菌株可增强病毒特异性CD8+IFN-γ+T细胞及穿孔素表达,初步揭示了靶向DCs的侵入型乳酸菌载体疫苗引起机体免疫反应的分子机制,为开发新型乳酸菌载体疫苗奠定了基础。
李艳红[8]（2014）在《熊果酸抗肿瘤及作为小鼠肝癌细胞疫苗佐剂的作用研究》文中提出恶性肿瘤是严重危害人类健康的主要疾病之一。目前主要的治疗方法包括手术、化疗和放疗等，但其毒副作用大，疗效差。因此，寻找毒副作用小、安全、高效的肿瘤治疗方法是目前肿瘤研究的重要趋势。熊果酸（Ursolic acid，UA）是存在于天然植物中的一种五环三萜类化合物，具有多种生物学功效。近年来研究发现熊果酸具有抗肿瘤及增强机体免疫功能作用。目前，其具体的抗肿瘤作用机制并不明确。本文研究了熊果酸体外抗肿瘤作用机制，体内肿瘤免疫调节作用及作为佐剂的肿瘤免疫预防作用，为熊果酸在抗肿瘤领域深入的应用开发提供可靠的实验依据。论文主要研究内容及结论如下：1.熊果酸对宫颈癌细胞体外增殖抑制及诱导凋亡作用研究目的探讨熊果酸对体外培养宫颈癌细胞的增殖抑制及诱导凋亡的作用。方法MTT法测定熊果酸对HeLa细胞增殖的影响；流式细胞术分析熊果酸作用HeLa细胞后细胞周期的变化及细胞凋亡情况；Western blot检测熊果酸作用HeLa细胞后caspase-3，caspase-8，caspase-9，cytochrome c，Bcl-2，Bcl-xL，Bak，Bax蛋白表达。Real-time PCR检测了熊果酸对宫颈癌HeLa和Siha细胞中HPV E6和E7基因的表达。结果熊果酸抑制HeLa细胞增殖呈浓度依赖性，40μM熊果酸作用48h后细胞增殖抑制率高达91.80±3.26%，IC50值为9.54±3.51μM。流式细胞术测定结果显示熊果酸阻滞HeLa细胞周期在G0/G1期，40μM作用48h效果最显着。熊果酸诱导HeLa细胞凋亡呈浓度依赖性，40μM和60μM作用48h后，细胞早期凋亡率分别为74.30±5.26%和83.87±2.27%，显着高于对照组2.20±1.15%（P<0.01）。Western blot结果显示UA作用HeLa细胞引起caspase-3和caspase-9激活，可观察到剪切形式的caspase-3和caspase-9出现；细胞质中cytochrome c蛋白表达量增加；Bcl-2和Bcl-xL蛋白表达水平降低，Bax和Bak蛋白表达水平增加，均呈一定的时间依赖性。Procaspase-8蛋白表达量也降低，但未检测到剪切形式的caspase-8条带。Real-time PCR结果显示宫颈癌HeLa和SiHa细胞中HPV E6基因的表达量均显着降低（P<0.01），E7基因的表达未出现显着性改变。表明，熊果酸在体外对宫颈癌细胞有较好的增殖抑制活性，可以通过诱导细胞凋亡达到体外抗肿瘤作用，对其抗凋亡途径的研究表明UA可以通过线粒体途径诱导宫颈癌细胞凋亡。UA抗宫颈癌的靶点可能在于能够抑制HPV病毒E6基因的表达和促进细胞凋亡的发生。2.熊果酸诱导HeLa细胞凋亡中MAPK信号通路作用及细胞因子的变化目的熊果酸诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制并不清楚。本文探讨了MAPK信号通路在熊果酸诱导HeLa细胞凋亡中的作用及细胞凋亡中细胞因子变化。方法Western blot检测了不同浓度熊果酸作用HeLa细胞48h后MAPK信号通路中p38，p-p38，ERK，p-ERK，JNK，p-JNK蛋白的表达； ERK1/2抑制子U0126对ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达的影响和p38抑制子SB203580对p38，p-p38蛋白表达的影响；U0126和SB203580对细胞凋亡相关Bax、Bcl-2、caspase-3、cytochrome c蛋白表达的影响；Real-time PCR检测了熊果酸对DUSP基因表达的影响；ELISA检测熊果酸作用HeLa细胞培养液中IL-2、IL-4细胞因子含量。结果熊果酸降低p-ERK1/2和p-p38蛋白的表达，呈浓度依赖性，对p-JNK蛋白的表达无改变；ERK1/2抑制子U0126显着增强熊果酸诱导Bax/Bcl-2比率与熊果酸组比较（P<0.05），增强线粒体cytochrome c的释放和剪切的Caspase-3蛋白的表达；p38抑制子SB203580作用效果不明显。Real-time PCR结果显示熊果酸增强DUSP1,2,4,5,6,7,9,10基因的表达。ELISA结果显示熊果酸改变细胞培养液中细胞因子的分泌但无规律性。表明，ERK1/2信号通路参与熊果酸诱导的细胞凋亡，熊果酸可能通过增强DUSPs基因表达，抑制ERK1/2和p38磷酸化来诱导细胞凋亡，同时能够通过改变细胞因子的分泌调控细胞凋亡。3.熊果酸对小鼠肝癌H22移植瘤的抑制及免疫调节作用目的探讨熊果酸对H22荷瘤小鼠抗肿瘤作用及免疫功能的影响。方法体外细胞培养，MTT法检测熊果酸对H22细胞的增殖抑制率，流式细胞术检测细胞凋亡作用；建立H22荷瘤小鼠动物模型，根据小鼠体重，进行区组随机化分组，共分为模型组、环磷酰胺组（CTX，25mg/kg.d）、熊果酸高（40mg/kg.d）、中（20mg/kg.d）和低剂量（10mg/kg.d），腹腔注射连续给药15天后处死小鼠，计算抑瘤率、胸腺指数和脾指数，MTT法检测T、B淋巴细胞增殖能力，流式细胞术检测CD4+、CD8+T细胞亚群含量及比例，ELISA法检测白介素-2（IL-2）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白介素-4（IL-4）的表达量。结果体外熊果酸对H22细胞生长的增殖抑制呈浓度依赖性，最高抑制率达75.27±3.36%；诱导H22细胞凋亡呈时间依赖性，20μM作用48h后的凋亡率为36.4%±0.2，与对照0.9%±0.1比较，存在极显着性差异（P<0.01）。在体内，与模型组相比，高剂量的熊果酸可显着抑制肿瘤生长（P<0.01），降低荷瘤鼠异常增大的脾指数（P<0.05）；高剂量熊果酸可显着增强T、B淋巴细胞增殖能力（P<0.01），显着提高淋巴细胞亚群CD4+T细胞表达及CD4+/CD8+T细胞亚群比例（P<0.01），对CD8+T细胞表达作用不明显（P>0.05）；高剂量熊果酸促进血清IL-2、TNF-α表达（P<0.05），降低IL-4表达（P<0.01）。表明，熊果酸可抑制H22肿瘤细胞生长，在体内可以提高荷瘤小鼠的免疫能力，其抗肿瘤作用可能与其免疫调节作用相关。4.熊果酸增强小鼠肝癌细胞免疫原性的作用目的探讨熊果酸作为免疫佐剂对小鼠肝癌肿瘤疫苗免疫原性的增强作用。方法UA和H22细胞共培养，制备肝癌细胞疫苗，免疫小鼠后建立肝癌模型，观察肿瘤生长曲线，记录小鼠存活情况，MTT法测定脾淋巴细胞增殖能力，ELISA法测定血清IL-2、IL-4细胞因子含量，流式细胞术测定CD4+、CD8+T细胞亚群百分率，免疫荧光法测定血清中抗肿瘤特异性抗体的产生，ELISA法测定特异性抗体的水平，Western blot检测血清特异性抗体结合能力。结果免疫小鼠后，与模型组相比，荷瘤小鼠肿瘤的生长明显抑制（P<0.05），小鼠的生命延长率明显高于模型组（P<0.01）；与模型组相比，T淋巴细胞和B淋巴细胞增殖能力显着升高（P<0.01），CD4+/CD8+T细胞含量比例明显升高（P<0.01），血清中细胞因子IL-2、IL-4含量明显升高（P<0.01）。免疫鼠血清可检测到较高水平特异性抗体，抗体亚型IgG2a/IgG1比值明显升高（P<0.01）；Western blot出现四条大小约为95kDa、60kDa、50kDa和34kDa杂交条带。表明，UA作为佐剂能够提高小鼠H22肝癌细胞疫苗的免疫原性，增强小鼠抗肿瘤细胞免疫和体液免疫能力。综上所述，熊果酸能够通过线粒体内源性途径诱导宫颈癌细胞凋亡，ERK1/2信号通路在该过程中发挥重要作用。熊果酸能够提高H22荷瘤小鼠的免疫调节能力，激发小鼠对肿瘤生长的抑制作用。熊果酸能够促进H22肝癌细胞产生免疫原性，激发正常小鼠强烈且长效的抗肝癌免疫保护作用，熊果酸在保护性抗原制备中可能起到了免疫佐剂的作用。该研究为熊果酸作为抗肿瘤药物及肿瘤疫苗免疫佐剂的开发提供了良好的理论基础。
陈佳[9]（2012）在《饲喂不同来源肉类对大鼠免疫功能的影响》文中研究说明鸭肉、羊肉和狗肉是人们生活中常见的肉类来源。目前,国内外学者对鸭肉、羊肉和狗肉的肉质、营养成份以及食用品质等都进行了大量的研究,已基本明确了其营养组成种类和数量。除基本的营养功能外,中国传统医学认为以上三种肉类还有特殊的食用功效,如“鸭肉可补虚,除热,调和脏腑”；“羊肉可治虚劳寒冷,补中益气,镇静止惊”；“狗肉可安五脏,补绝伤,轻身益气”。根据中医药学上对食用肉特殊功效的记载,我们推测以上三种肉类可能是其本身含有或者经食用消化后产生了某些生理活性物质,对机体生理功能产生了影响,进而影响了免疫系统的调节作用,起到滋补、保健的作用,但是其作用机理还未见有科学的阐述。本论文研究了食用羊肉,鸭肉,狗肉对大鼠生长性能和免疫功能的影响,并运用现代免疫学技术和蛋白质分离与鉴定技术对上述三种肉类中含有的特殊免疫活性物质成分进行分离和鉴定。具体研究内容和结果如下：1.饲喂不同来源的肉类对大鼠生长性能及部分血液生化指标的影响120只体重为100-105g4周龄SD雄性大鼠,按体重相似随机分为8组,每组15只,单笼饲养。分别饲喂添加20%和30%肉粉的鸭肉、羊肉和狗肉饲粮,并以玉米豆粕型饲粮为对照。试验期4周。试验结果表明：在二种肉粉添加量饲喂下,羊肉、鸭肉、狗肉组大鼠平均日采食量均显着低于豆粕对照组（P<0.05）,各试验组大鼠组织器官指数差别不显着,但随着肉粉添加量的提高,各试验组大鼠平均日增重均显着提高（P<0.05）,血清中总蛋白含量略有升高,但试验组和对照组差异不显着,白蛋白,球蛋白含量差异均不显着（P>0.05）,而血清胆固醇、甘油三酯含量均显着高于对照组（P<0.05）,此外大鼠血清SOD活性极显着降低（P<0.01）,MDA水平极显着升高（P<0.01）2.饲喂不同来源的肉类对大鼠肠道粘膜免疫屏障的影响本实验进一步研究了饲喂鸭肉,羊肉和狗肉对大鼠肠道粘膜的通透性、粘膜sIgA水平及抗氧化酶活性的影响,以探索不同来源肉类对大鼠肠道免疫屏障功能的影响。结果表明：与对照组相比,在同样添加量下,鸭肉、羊肉和狗肉组大鼠小肠绒毛高度、隐窝深度、粘膜厚度,小肠粘膜SOD酶含量、及血清D-乳酸含量均显着提高（P<0.05）,血清DAO含量均极显着升高（P<0.01）；在20%肉粉添加量下,各试验组大鼠小肠粘膜MPO含量、肠道sIgA表达均显着低于对照组（P<0.05）,但在30%肉粉添加量下,各试验组大鼠小肠粘膜MPO含量和肠道sIgA表达与对照组差异均不显着（P>0.05）3.饲喂不同来源的肉类对大鼠细胞和体液免疫功能的影响本实验深入研究了食用鸭肉、羊肉和狗肉后,大鼠外周血T淋巴细胞亚群、细胞因子、免疫球蛋白和补体的变化情况,以探讨三种肉类对机体体液和细胞免疫的影响。结果显示,在20%肉粉添加量下,鸭肉组大鼠血清IL-2水平极显着高于对照组（P<0.01）,羊肉、狗肉组大鼠血清IL-6水平显着高于对照组和鸭肉组（P<0.05）,试验组血清IL-10水平均显着低于对照组（P<0.05）,而鸭肉组血清TNF-α水平也显着高于对照组（P<0.05）；狗肉组大鼠血清IgA水平极显着低于对照、鸭肉和羊肉组（P<0.01）,鸭肉组和羊肉组血清IgA水平显着低于对照组（P<0.05）,鸭肉组和羊肉组大鼠血清IgM水平显着高于对照组和狗肉组（P<0.05）,各试验组大鼠血清补体C3水平,显着低于对照组（P<0.05）,鸭肉组补体C4水平显着高于对照组（P<0.05）,狗肉组C4水平则显着低于对照组（P<0.05）,羊肉组和狗肉组大鼠外周血CD3+%极显着的低于对照组和鸭肉组（P<0.01）,鸭肉组CD4+%极显着高于对照组（P<0.01）,而羊肉组和狗肉组CD4+%则极显着的低于对照组（P<0.01）,羊肉组CD8+%极显着低于对照组、鸭肉组和狗肉组（P<0.01）,鸭肉组CD4+/CD8+值极显着高于其它试验组（P<0.01）,羊肉组极显着低于对照组（P<0.01）,狗肉组极显着低于羊肉组（P<0.01）。在30%添加量下,各试验组大鼠血清IL-2和IL-10水平差异不显着（P>0.05）,但试验组IL-6水平均极显着高于对照（P<0.01）,羊肉组血清TNF-α水平极显着高于对照组、鸭肉组和狗肉组（P<0.01）,狗肉组TNF-α水平极显着低于对照组（P<0.01）,对照组和羊肉组IFN-γ水平显着高于鸭肉和狗肉组（P>0.05）；羊肉组和鸭肉组血清IgM水平显着高于对照组（P<0.05）；羊肉组补体C3水平较对照组显着提高（P<0.05）鸭肉组和狗肉组较对照组显着降低（P<0.05）,各试验组与对照组补体C4水平差异不显着（P>0.05）,但均高于20%添加量组；羊肉组和狗肉组外周血CD3+%和CD4+%均极显着的低于对照组和鸭肉组（P<0.01）,鸭肉组和羊肉组CD8+%极显着低于对照组和狗肉组（P<0.01）,鸭肉组CD4+/CD8+极显着高于对照组、羊肉组和狗肉组,而羊肉组和狗肉组CD4+/CD8+则极显着低于对照组（P<0.01）4.对鸭肉、羊肉和狗肉中免疫活性物质的分离与鉴定通过前期研究,我们证实了食用鸭肉、羊肉和狗肉能够对大鼠机体免疫功能产生不同的影响,说明上述三种肉中有可能存在某种特殊的免疫活性物质。因此本研究利用免疫血清,采用电泳,免疫印迹分析、层析色谱技术对食用肉中生理活性物质进行分离、纯化和鉴定。结果从鸭肉中分离纯化出相对分子量为12.117KDa的蛋白,经鉴定为hsp60亚基；从羊肉中分离纯化出相对分子量为12.208KDa的蛋白,经鉴定为N-乙酰转移酶；从狗肉中分离纯化出的相对分子量为18.939KDa蛋白,经鉴定为肌酸激酶亚基。根据本研究结果可得出以下结论：在肉粉添加量分别为20%和30%条件下,食用鸭肉、羊肉和狗肉均能够促进大鼠生长及肠道粘膜发育,但会导致大鼠机体抗氧化能力降低,脂质过氧化,肠道粘膜局部免疫功能下降,对大鼠系统免疫功能造成了不同的影响。同时,从鸭肉,羊肉和狗肉中分离鉴定出三种具免疫活性蛋白,分别为：hsp60、N-乙酰转移酶和肌酸激酶亚基,这三种蛋白可能与以上三种肉类对机体免疫功能造成不同的影响有关。
苏倩倩[10]（2012）在《鸡白细胞介素18成熟蛋白的表达、纯化及其单克隆抗体的制备与特性鉴定》文中研究指明白细胞介素18能明显诱导Th1和NK细胞产生IFN-γ，还可诱导IL-2、GM-CSF及TNF-α等多种细胞因子的产生。IL-18不但具有抗病毒、抗肿瘤活性，也可作为加强和改善机体免疫应答的免疫佐剂，与病毒的保护性抗原基因共表达可加强和改善机体的免疫应答。在某些疾病中监测IL-18的水平可以动态观察和了解疾病的发展、转归以及机体的免疫反应规律，所以有必要利用抗IL-18单克隆抗体建立相应的检测方法。到目前为止，国内外已有人、小鼠、猴、猪、牛和羊等种属的IL-18商品化制剂及其相应的单克隆抗体（McAb）或多克隆抗体（PcAb）以及夹心ELISA试剂盒的商品化供应。但目前，国内尚未见鸡IL-18单抗制备方面的报道。本课题对鸡IL-18（ChIL-18）成熟蛋白的单克隆抗体进行了研究。将鸡IL-18的成熟蛋白基因经扩增后亚克隆入原核表达载体pET-28a（+）中，经PCR、双酶切和测序鉴定后，构建了重组质粒pET-28a-mChIL18。将该质粒转化入高效表达菌Rosetta（DE3）的感受态细胞中，利用IPTG诱导表达得到大小为23KDa的融合蛋白，并利用载体上所带有的His标签蛋白这一特点，采用Ni-NTA亲和层析法纯化重组蛋白ChIL-18，从而获得了纯度较高的蛋白，其含量最高可达7.8mg/mL，最低为1mg/mL。利用纯化的重组ChIL-18蛋白对BALB/c小鼠进行免疫，并建立了检测小鼠抗体水平和单抗鉴定的间接ELISA检测方法。经反复试验确定了间接ELISA测定小鼠抗体水平以及筛选阳性杂交瘤细胞株的最佳反应条件，最佳抗原包被质量浓度为4μg/mL，阴阳性血清稀释倍数为1:104，羊抗鼠IgG辣根过氧化物酶结合物最佳稀释倍数为1:4000，抗原抗体最佳结合时间是1.5h，血清与二抗最适反应时间是1h。融合前抗体效价达到1:106，满足融合时对小鼠抗体的要求。SP2/0骨髓瘤细胞与加强免疫后的小鼠脾细胞在PEG作用下进行融合，经间接ELISA方法检测融合细胞，经过3次亚克隆筛选出能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株，最终确定两株单抗2E6和1G9作为试验研究对象，并大量制备了单抗腹水。两株单抗亚型鉴定表明，均属于IgM亚型。1G9和2E6的腹水效价分别为1:5.12×105和1:3.2×104。ELISA叠加试验分析表明，1G9和2E6可分别结合到IL-18不同的抗原位点上，两者具有叠加性。Western blot鉴定结果表明，单抗2E6和1G9只能与重组ChIL-18蛋白发生特异性反应，不能与相同原核表达质粒及相同表达系统表达的新城疫NP蛋白、禽偏肺病毒G蛋白发生特异反应，从而排除单抗对His标签反应。IFA鉴定表明，重组真核质粒pcDNA3.1-mChIL18转染293T细胞，有目的蛋白表达，试验证实单抗可以特异性检测真核质粒在细胞上的表达，且产生特异性明显荧光。
二、人穿孔素C肽段的单克隆抗体和免疫血清的制备和鉴定（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人穿孔素C肽段的单克隆抗体和免疫血清的制备和鉴定（论文提纲范文）
（1）布鲁氏菌S19 bvfA基因缺失株免疫保护性及其与睾丸支持细胞互作组学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号与缩略语说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 布鲁氏菌病及其流行病学概况 |
| 1.1.1 布鲁氏菌病概述 |
| 1.1.2 布病流行病学特点 |
| 1.2 布鲁氏菌毒力因子研究进展 |
| 1.2.1 脂多糖 |
| 1.2.2 Ⅳ型分泌系统 |
| 1.2.3 BvrR/BvrS双组分调控系统 |
| 1.2.4 外膜蛋白 |
| 1.2.5 布鲁氏菌毒力因子在生殖疾病中的作用 |
| 1.2.6 布鲁氏菌毒力基因作为候选疫苗保护性抗原的研究 |
| 1.3 布鲁氏菌对宿主免疫反应的调节 |
| 1.3.1 布鲁氏菌与TLRs的识别 |
| 1.3.2 布鲁氏菌对先天免疫反应的调节 |
| 1.3.3 布鲁氏菌对适应性免疫反应的调节 |
| 1.3.4 布鲁氏菌OMPs的免疫反应 |
| 1.4 组学技术在布鲁氏菌疾病中的应用进展 |
| 1.4.1 转录组学 |
| 1.4.2 蛋白质组学 |
| 1.4.3 代谢组学 |
| 1.5 研究意义及技术路线 |
| 1.5.1 研究意义 |
| 1.5.5 技术路线 |
| 第二章 临床布鲁氏菌分离株bvfA基因的分布频率及B.abortus S19ΔbvfA菌株的构建 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株与质粒 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 临床布鲁氏菌分离株bvfA基因的检测 |
| 2.2.2 B.abortus S19△bvfA菌株的构建 |
| 2.2.3 B.abortus S19△bvfA/bvfA回补株的构建 |
| 2.2.4 GFP标记B.abortus S19及bvfA基因缺失株和回补株 |
| 2.2.5 bvfA基因的原核表达 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 毒力基因在临床布鲁氏菌分离株中的分布频率 |
| 2.3.2 B.abortus S19ΔbvfA菌株构建结果 |
| 2.3.3 B.abortus S19△bvfA/bvfA回补株构建结果 |
| 2.3.4 GFP标记B.abortus S19及bvfA基因缺失株和回补株结果 |
| 2.3.5 bvfA基因原核表达结果 |
| 2.4 讨论 |
| 小结 |
| 第三章 bvfA基因对B.abortus S19菌株及其宿主生物学特性的影响 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 菌株、细胞系和实验动物 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 B.abortus S19△bvfA菌株的生长曲线测定 |
| 3.2.2 B.abortus S19△bvfA菌株体外应激水平检测 |
| 3.2.3 B.abortus S19△bvfA菌株与TM4睾丸支持细胞的相互作用 |
| 3.2.4 统计学分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 bvfA基因缺失减弱了B.abortus S19△bvfA菌株体外增殖活性 |
| 3.3.2 bvfA基因缺失影响了布鲁氏菌的体外应激水平 |
| 3.3.3 B.abortus S19△bvfA菌株入侵和在TM4睾丸支持细胞内增殖能力减弱 |
| 3.3.4 布鲁氏菌没有影响TM4睾丸支持细胞的增殖活性 |
| 3.3.5 B.abortus S19△bvfA菌株对早期感染的TM4睾丸支持细胞杀伤力强 |
| 3.3.6 B.abortus S19△bvfA菌株对小鼠毒力降低 |
| 3.4 讨论 |
| 小结 |
| 第四章 B.abortus S19△bvfA菌株的免疫原性和免疫保护性 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 菌株与试验动物 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 菌株制备 |
| 4.2.2 制备血清 |
| 4.2.3 抗体水平检测 |
| 4.2.4 细胞因子水平检测 |
| 4.2.5 BvfA蛋白与B.abortus S19AbvfA菌株免疫小鼠血清反应性检测 |
| 4.2.6 B.abortus S19△bvfA菌株免疫保护性检测 |
| 4.2.7 B.abortus S19△bvfA菌株对小鼠脾脏和睾丸的毒性和病理损伤研究 |
| 4.2.8 统计学分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 B.abortus S19△bvfA菌株免疫小鼠血清抗体水平 |
| 4.3.2 B.abortus S19△bvfA菌株免疫小鼠血清细胞因子水平的变化 |
| 4.3.3 BvfA蛋白具有区分疫苗免疫和野生毒株感染的能力 |
| 4.3.4 B.abortus S19△bvfA菌株具有针对强毒株攻击的免疫保护作用 |
| 4.3.5 B.abortus S19△bvfA菌株对小鼠脾脏和睾丸的毒性较低 |
| 4.3.6 B.abortus S19AbvfA菌株对小鼠脾脏和睾丸的病理损伤减小 |
| 4.4 讨论 |
| 小结 |
| 第五章 组学分析bvfA基因在B.abortus S19中的作用 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 菌株和细胞系 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 细菌总RNA的提取 |
| 5.2.2 转录组测序 |
| 5.2.3 细菌总蛋白质的提取 |
| 5.2.4 Label free蛋白组学技术 |
| 5.2.5 细菌总代谢物的提取 |
| 5.2.6 LC-MS非靶代谢组学技术 |
| 5.2.7 统计分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 转录组质量评估结果 |
| 5.3.2 B.abortus S19△bvfA菌株和B.abortus S19菌株转录组轮廓分析 |
| 5.3.3 B.abortus S19△bvfA菌株和B.abortus S19菌株转录组学研究 |
| 5.3.4 布鲁氏菌菌体蛋白质的浓度与质量结果 |
| 5.3.5 B.abortus S19△bvfA菌体和B.abortus S19菌体总蛋白质组学研究 |
| 5.3.6 B.abortus S19△bvfA菌株和B.abortus S19菌株代谢组学研究 |
| 5.3.7 转录组学与蛋白质组学技术关联分析bvfA基因在B.abortus S19中的作用 |
| 5.3.8 蛋白质学与代谢组学技术关联分析bvfA基因在B.abortus S19中的作用 |
| 5.4 讨论 |
| 小结 |
| 第六章 组学通路下bvfA基因对B.abortus S19感染TM4睾丸支持细胞的影响 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 菌株和细胞系 |
| 6.1.2 主要试剂 |
| 6.1.3 主要仪器 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 细胞样本准备 |
| 6.2.2 转录组测序和转录组质量评估 |
| 6.2.3 蛋白质和代谢产物的提取 |
| 6.2.4 Label free蛋白组学技术和LC-MS非靶代谢组学技术 |
| 6.2.5 平行反应监测和Westen blot对蛋白表达量验证 |
| 6.2.6 统计分析和可视化 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 RNA质量分析 |
| 6.3.2 转录组学揭示bvfA基因在B.abortus S19菌株感染TM4睾丸支持细胞中的作用 |
| 6.3.3 蛋白质组学揭示bvfA基因在B.abortus S19菌株感染TM4睾丸支持细胞中的作用 |
| 6.3.4 代谢组学揭示bvfA基因在B.abortusS19菌株感染TM4睾丸支持细胞中的作用 |
| 6.3.5 转录组学与蛋白质组学关联分析感染B.abortus S19△bvfA菌株和B.abortus S19菌株TM4睾丸支持细胞差异表达基因功能 |
| 6.3.6 蛋白质组学与代谢组学关联分析感染B.abortus S19△bvfA菌株B.abortusS19菌株TM4睾丸支持细胞差异表达基因功能 |
| 6.3.7 感染B.abortus S19△bvfA菌株和B.abortus S19菌株的TM4睾丸支持细胞差异蛋白质验证 |
| 6.4 讨论 |
| 小结 |
| 第七章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 个人简介 |
（2）纳秒脉冲消融治疗肝细胞肝癌的免疫学效应及其作用机制研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 纳秒脉冲消融小鼠肝癌免疫学效应研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 试剂与仪器 |
| 1.3 研究方法 |
| 1.4 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 纳秒脉冲消融小鼠肝癌免疫相关差异表达蛋白的筛选 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 试剂与仪器 |
| 1.3 研究方法 |
| 1.4 统计分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 差异蛋白LXN、GRN、TGF-β1、ELNE与免疫细胞的相关性分析 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 试剂与仪器 |
| 1.3 研究方法 |
| 1.4 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 纳秒脉冲消融在肿瘤治疗中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 新疆医科大学博士研究生学位论文 导师评阅表 |
（3）基于多肽芯片技术的H5亚型禽流感病毒HA2蛋白抗原表位筛选及DIVA疫苗候选株的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 综述: 流感病毒HA蛋白抗原表位研究进展 |
| 1 流感病毒概述 |
| 2 血凝素的生物学特性 |
| 3 抗原表位 |
| 4 抗原表位研究方法 |
| 5 血凝素蛋白抗原表位的应用 |
| 6 目的与意义 |
| 参考文献 |
| 第一章 基于多肽芯片技术的H5亚型禽流感病毒HA2蛋白抗原表位筛选 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 基于HA2蛋白的禽流感病毒共同抗原表位的鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 基于H5亚型禽流感病毒HA2蛋白特异性抗原表位的DIVA疫苗候选株构建 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（4）寨卡病毒重组亚单位疫苗在非人灵长类水平的评估及其保护机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 寨卡病毒及其对人类社会的危害 |
| 1.1.1 寨卡病毒的发现 |
| 1.1.2 寨卡病毒的分布 |
| 1.1.3 寨卡病毒感染的临床症状 |
| 1.1.4 寨卡病毒的传播方式 |
| 1.2 寨卡病毒及相关基础研究 |
| 1.2.1 寨卡病毒的组成及结构 |
| 1.2.2 寨卡病毒的复制周期 |
| 1.2.3 寨卡病毒在人体内的感染路线 |
| 1.2.4 寨卡病毒和其它黄病毒的相关性 |
| 1.2.5 抗体依赖的增强作用 |
| 1.3 寨卡病毒疫苗的研究进展 |
| 1.3.1 寨卡病毒疫苗的种类和研发进度 |
| 1.3.2 寨卡病毒疫苗的限制和潜在风险 |
| 1.4 寨卡病毒重组亚单位疫苗的设计策略 |
| 1.4.1 重组亚单位寨卡病毒疫苗研究的必要性和优势 |
| 1.4.2 寨卡病毒结构蛋白重点区域的功能分析 |
| 1.4.3 登革病毒疫苗研发的经验 |
| 1.4.4 寨卡病毒EDⅢ和 E80 蛋白在小鼠水平的评估结果 |
| 1.5 本研究的设计思路及实验内容 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 动物伦理声明 |
| 2.2 细胞培养 |
| 2.3 病毒培养与滴定 |
| 2.4 EDⅢ和 E80 免疫原的制备 |
| 2.4.1 蛋白表达及纯化及鉴定 |
| 2.4.2 EDⅢ和 E80 蛋白抗原性的鉴定 |
| 2.4.3 以EDⅢ和 E80 蛋白为主要免疫原的疫苗制备 |
| 2.5 EDⅢ和 E80 蛋白在恒河猴体内的免疫 |
| 2.5.1 用于疫苗评估的恒河猴筛选 |
| 2.5.2 恒河猴免疫方法流程和样本采集 |
| 2.6 EDⅢ和 E80 蛋白在恒河猴体内的免疫原性检测 |
| 2.6.1 抗原特异性抗体水平的检测 |
| 2.6.2 抗体对ZIKV的结合能力的检测 |
| 2.6.3 抗体对病毒的中和能力的检测 |
| 2.6.4 疫苗诱导的T细胞反应的检测 |
| 2.7 EDⅢ和 E80 蛋白在恒河猴体内的保护性检测 |
| 2.7.1 恒河猴内ZIKV攻毒实验及信息样本采集 |
| 2.7.2 病毒血症及组织中病毒载量的检测 |
| 2.8 EDⅢ和 E80 蛋白在恒河猴水平不同保护效果的机制研究 |
| 2.8.1 疫苗诱导的抗体在体外增强ZIKV感染能力的检测 |
| 2.8.2基于酵母展示的表位定位实验 |
| 2.8.3基于肽段的表位鉴定实验 |
| 2.9 EDⅢ和 E80 免疫原诱导抗体对登革病毒的交叉反应检测 |
| 2.9.1 EDⅢ和 E80 免疫原诱导的抗体对登革病毒的结合能力检测 |
| 2.9.2 EDⅢ和 E80 免疫原诱导的抗体对登革病毒的中和能力检测 |
| 2.9.3 EDⅢ和 E80 免疫原诱导的抗体在体外增强登革病毒感染能力的检测 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 EDⅢ和 E80 免疫原有在恒河猴体内诱导中和性抗体反应的潜能 |
| 3.1.1 EDⅢ和 E80 蛋白有正确的大小且能被标签抗体识别 |
| 3.1.2 EDⅢ和 E80 蛋白包含中和抗体表位 |
| 3.1.3 EDⅢ和 E80 蛋白能高效地吸附于铝佐剂表面 |
| 3.2 EDⅢ和 E80 免疫原在恒河猴体内具有免疫原性 |
| 3.2.1 免疫前恒河猴体内不含有寨卡及其他相关病毒的抗体 |
| 3.2.2 EDⅢ和E80在恒河猴体内诱导了抗原特异性的抗体 |
| 3.2.3 EDⅢ和 E80 诱导的抗体有结合ZIKV的能力 |
| 3.2.4 EDⅢ和E80 诱导的抗体有中和ZIKV的能力 |
| 3.2.5 EDⅢ和 E80 在恒河猴体内诱导了抗原特异性的T细胞反应 |
| 3.3 EDⅢ和 E80 免疫原在恒河猴体内具有不同的保护效价 |
| 3.3.1 寨卡病毒感染对恒河猴体温体重无明显影响 |
| 3.3.2 E80 免疫能有效抑制ZIKV在恒河猴体引起的病毒血症 |
| 3.3.3 E80 免疫能有效降低恒河猴组织中的ZIKV载量 |
| 3.4 中和抗体可持续性的差异是EDⅢ和 E80 蛋白保护性差异的主要原因 |
| 3.4.1 EDⅢ和 E80 诱导的抗体在体外ADE实验中均能增强寨卡病毒感染 |
| 3.4.2 EDⅢ和 E80 诱导的中和性抗体反应的可持续性有显着性差异 |
| 3.5 EDⅢ和 E80 免疫原诱导抗体识别的表位在病毒表面暴露的程度不同 |
| 3.5.1 酵母展示实验验证了EDⅢ和 E80 诱导的抗体对病毒蛋白的结合能力 |
| 3.5.2 EDⅢ诱导的抗原特异性抗体识别多种不在病毒表面暴露的表位 |
| 3.5.3 E80 诱导的抗体主要识别多种在病毒表面暴露的EDⅠ/Ⅱ区域的表位 |
| 3.6 EDⅢ和 E80 蛋白诱导的抗体与登革病毒相互作用的能力不同 |
| 第4章 结论与讨论 |
| 4.1 课题结论及意义总结 |
| 4.2 本课题对寨卡病毒亚单位疫苗研发的意义 |
| 4.2.1 EDⅢ免疫原在不同个体体内的免疫原性及保护效价不同 |
| 4.2.2 E80 免疫原在多种动物模型体内诱导了保护性免疫反应 |
| 4.2.3 E80 免疫原作为寨卡病毒重组亚单位疫苗的优势及前景 |
| 4.3 本课题对寨卡病毒疫苗评估指标选择的提示 |
| 4.3.1 中和抗体滴度是评估寨卡病毒疫苗的重要指标 |
| 4.3.2 中和抗体的数量检测在寨卡病毒疫苗评估中是必要的 |
| 4.3.3 中和抗体反应的可持续性应为寨卡病毒疫苗评估的主要指标之一 |
| 4.3.4 其他潜在的寨卡病毒疫苗评估指标 |
| 4.4 本课题强调不同动物模型在的疫苗评估各阶段的作用 |
| 4.4.1 小鼠模型在疫苗评估中的限制 |
| 4.4.2 非人灵长类动物模型在疫苗评估中的优势 |
| 4.5 本课题对亚单位疫苗设计的提示 |
| 4.5.1 EDⅢ蛋白携带的中和抗体表位未能在猴体内主导免疫反应 |
| 4.5.2 EDⅢ蛋白在病毒表面不充分暴露,且携带中和抗体表位种类较少 |
| 4.5.3 EDⅢ中和抗体对应胚系基因的研究 |
| 4.5.4 EDⅠ/Ⅱ区域在病毒表面充分暴露,且携带较多的中和抗体表位 |
| 4.6 未来展望 |
| 4.6.1 鉴定E80 蛋白携带的中和/非中和性抗体表位有助于疫苗优化 |
| 4.6.2 E80 蛋白有潜力被优化为寨卡病毒/登革病毒广谱疫苗 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位论文期间发表的学术论文与研究成果 |
| 专业综述 |
| 参考文献 |
（5）靶向OX40主动免疫的抗肿瘤免疫效应（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 一、癌症免疫治疗是肿瘤治疗的重要手段 |
| 二、免疫检查点疗法是肿瘤免疫治疗中的重大进展 |
| 三、新一代检查点疗法靶分子OX40及其在抗肿瘤治疗中的作用 |
| 四、靶向OX40肿瘤免疫治疗的药物研究进展 |
| 五、课题研究目的、意义及思路 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 菌株、质粒及细胞株 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 主要实验试剂 |
| 1.4 主要化学试剂及耗材 |
| 1.5 主要仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 OX40重组病毒样颗粒的制备 |
| 2.1.1 小鼠OX40胞外段抗原表位预测 |
| 2.1.2 重组质粒的构建 |
| 2.1.3 重组质粒的诱导表达 |
| 2.1.4 重组蛋白的纯化 |
| 2.1.5 透射电子显微镜观察鉴定病毒样颗粒 |
| 2.2 4T1小鼠乳腺癌原位模型的建立 |
| 2.2.1 肿瘤细胞培养 |
| 2.2.2 小鼠4T1乳腺癌原位模型的建立 |
| 2.3 TC-1小鼠移植瘤模型的建立 |
| 2.3.1 肿瘤细胞培养 |
| 2.3.2 小鼠TC-1移植瘤模型的建立 |
| 2.4 小鼠B16-F10黑色素瘤皮下移植瘤模型的建立 |
| 2.4.1 肿瘤细胞培养 |
| 2.4.2 C57BL/6小鼠B16-F10黑色素瘤皮下移植瘤模型的建立 |
| 2.5 病毒样颗粒的免疫效果评价实验 |
| 2.5.1 小鼠免疫及抗体水平检测 |
| 2.5.2 P6抗血清细胞水平评价 |
| 2.5.3 预防性策略评价0X40 VLP疫苗对BALB/c小鼠4T1乳腺癌原位模型干预实验研究 |
| 2.5.4 预防性策略评价0X40 VLP疫苗对C57BL/6小鼠TC-1肿瘤模型干预实验研究 |
| 2.5.5 治疗性策略评价P6 VLP疫苗单独干预TC-1皮下移植瘤模型的相关实验 |
| 2.5.6 治疗性策略评价P6 VLP疫苗单独干预B16-F10黑色素瘤皮下移植瘤模型的相关实验 |
| 2.5.7 P6 VLP疫苗与HPV治疗性疫苗联合免疫对小鼠TC-1肿瘤模型的干预实验研究 |
| 2.5.8 肿瘤大小的测量 |
| 2.5.9 小鼠脾脏及肿瘤组织获取 |
| 2.5.10 小鼠脾脏淋巴细胞的体外分离 |
| 2.5.11 小鼠肿瘤组织淋巴细胞的体外分离 |
| 2.5.12 流式细胞术检测CTL、Treg、MDSC及Th细胞水平 |
| 2.6 统计学分析 |
| 结果 |
| 1 靶向小鼠0X40的病毒样颗粒疫苗构建与制备 |
| 1.1 以乙肝核心抗原病毒样颗粒为载体的0X40疫苗构建。 |
| 1.2 重组蛋白的诱导表达及纯化 |
| 1.2.1 HBcAg-0X40重组蛋白的诱导表达 |
| 1.2.2 超声破碎上清中重组蛋白的纯化 |
| 1.2.3 超声破碎沉淀中目的蛋白的纯化 |
| 1.3 病毒样颗粒的电镜观察 |
| 小结 |
| 2 靶向小鼠0X40病毒样颗粒疫苗的小鼠免疫 |
| 2.1 小鼠血清0X40特异性抗体应答分析 |
| 2.2 P6抗血清促淋巴细胞作用在细胞水平的评价 |
| 小结 |
| 3 靶向OX40预防性免疫对小鼠肿瘤模型的干预研究 |
| 3.1 呈递OX40抗原表位的病毒样颗粒对小鼠4T1乳腺肿瘤的预防性免疫干预 |
| 3.1.1 靶向OX40的预防性免疫干预对小鼠4T1肿瘤生长的影响 |
| 3.1.2 靶向OX40的预防性免疫干预对小鼠4T1肿瘤肺转移的影响 |
| 3.1.3 靶向OX40的预防性免疫干预对小鼠脾脏组织CD8+细胞和IFN-γ~+细胞水平的影响 |
| 3.1.4 靶向OX40的预防性免疫干预对小鼠脾脏组织Th1效应淋巴细胞水平的影响 |
| 3.1.5 靶向OX40的预防性免疫干预对小鼠脾脏组织Tregs细胞水平的影响 |
| 3.1.6 靶向OX40的预防性免疫干预对小鼠脾脏组织Th2细胞水平的影响 |
| 3.1.7 靶向OX40的预防性免疫干预对小鼠脾脏组织MDSCs细胞水平的影响 |
| 3.1.8 靶向OX40的预防性免疫干预对小鼠肿瘤组织CD8~+细胞水平的影响 |
| 3.2 呈递OX40抗原表位的病毒样颗粒疫苗对小鼠HPV相关TC-1肿瘤的预防性免疫干预 |
| 小结 |
| 4 靶向OX40治疗性免疫对小鼠不同肿瘤模型的干预研究 |
| 5 靶向OX40治疗性主动免疫干预对治疗性HPV疫苗发挥作用的影响 |
| 小结 |
| 讨论 |
| 1. OX40病毒样颗粒疫苗免疫的效果评价 |
| 2. HPV治疗性疫苗协同作用及纳米颗粒递送系统的应用对抗肿瘤免疫应答的影响 |
| 3. OX40应用于多肿瘤模型的评价 |
| 4. 研究存在的问题及展望 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ 主要溶液的配制 |
| 附录Ⅱ 鼠源0X40序列 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（6）交叉反应性CD8阳性T细胞在抗肿瘤和抗病毒中的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一部分 交叉反应性CD8阳性T细胞在抗肿瘤中的应用 |
| 1.引言 |
| 2.材料和方法 |
| 2.1 GP100、TRP2 相关序列及合成情况 |
| 2.2 试剂及常用溶液 |
| 2.3 实验动物 |
| 2.4 DCS的培养及小鼠免疫方法 |
| 2.5 LPS与 CPG作为联合佐剂免疫小鼠 |
| 2.6 脾脏细胞的体外刺激实验 |
| 2.7 流式细胞分析法检测 |
| 2.8 数据分析与整理 |
| 3.实验结果与讨论 |
| 3.1 DCS荷载GP100 相关多肽进行小鼠免疫后的免疫反应 |
| 3.2 DCS在不同温度下,与多肽进行孵育免疫小鼠后,小鼠的免疫应答情况 |
| 3.3 DCS-PEP免疫小鼠一次与两次的免疫反应的比较 |
| 3.4 LPS与CPG作为联合佐剂与N4 多肽混合后免疫小鼠 |
| 3.5 炎症性细胞因子增强DCS-PEP疫苗的研究 |
| 3.6 DCS-PEP疫苗与联合佐剂疫苗结合后增强小鼠免疫反应的情况 |
| 3.7 DCS-PEP疫苗与联合佐剂疫苗结合后用于治疗小鼠黑色素瘤的研究 |
| 3.8 TRP2 多肽结合DCS疫苗与联合佐剂用于小鼠肿瘤治疗情况 |
| 4.讨论和展望 |
| 5.参考文献 |
| 第二部分 交叉反应性CD8阳性T细胞在抗病毒中的研究 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 小鼠及伦理 |
| 2.2 多肽合成 |
| 2.3 病毒、细胞以及试剂 |
| 2.4 小鼠感染实验 |
| 2.5 脾脏细胞的体外刺激实验 |
| 2.6 细胞染色以及流式细胞术检测细胞因子的产生情况 |
| 2.7 酶联免疫斑点实验 |
| 2.8 过继性转移细胞转移实验 |
| 2.9 数据分析与整理 |
| 3.实验结果及讨论 |
| 3.1 HLA限制性的JEV以及ZIKV表位预测情况 |
| 3.2 通过IFNg的ELISPOT实验筛选免疫优势的多肽表位 |
| 3.3 通过细胞内因子的染色实验进一步验证筛选的免疫优势表位 |
| 3.4 JEV免疫对ZIKV感染的影响 |
| 3.5 JEV免疫能否介导对之后ZIKV感染的保护性作用呢? |
| 4.讨论和展望 |
| 5.参考文献 |
| 第三部分专业综述 黄病毒科病毒交叉免疫应答对寨卡病毒感染的影响 |
| 1.前言 |
| 2.黄病毒交叉反应性抗体对寨卡病毒感染的影响 |
| 3.黄病毒交叉反应性T细胞对寨卡病毒感染的影响 |
| 4.讨论与展望 |
| 5.参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（7）基于FnBPA和CD11c单链抗体的侵入型乳酸菌构建及其分子免疫机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 猪流感的研究进展 |
| 1.1 猪流感的流行现状 |
| 1.2 猪流感病毒的结构特点 |
| 1.3 猪流感病毒疫苗的研究进展 |
| 第二章 侵入型乳酸菌载体的研究进展 |
| 2.1 乳酸菌作为口服递送载体的研究进展 |
| 2.2 基于Fn BPA的侵入型乳酸菌的研究进展 |
| 2.3 DCs靶向型疫苗的研究进展 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 基于FnBPA的侵入型乳酸菌的构建及免疫调节作用 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 表达CD11c单链抗体的侵入型乳酸菌的构建及免疫调节作用 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 两类侵入型乳酸菌递送SIV HA蛋白的免疫保护效果评价 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 表达CD11c单链抗体侵入型乳酸菌的分子免疫机制研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 英文缩写词表 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（8）熊果酸抗肿瘤及作为小鼠肝癌细胞疫苗佐剂的作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 主要符号表 |
| 绪论 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 UA 抗肿瘤作用研究 |
| 2 肿瘤及肿瘤的治疗 |
| 3 疫苗佐剂的研究 |
| 第二章 UA 对宫颈癌细胞体外增殖抑制及诱导凋亡作用研究 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 第三章 UA 诱导 HELA 细胞凋亡中 MAPK 信号通路作用及细胞因子变化 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 第四章 UA 对小鼠肝癌 H22 移植瘤抑制及免疫调节作用研究 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 第五章 UA 增强小鼠肝癌细胞疫苗免疫原性的作用 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介及科研成果 |
| 导师评阅表 |
（9）饲喂不同来源肉类对大鼠免疫功能的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 上篇 文献综述 |
| 1 鸭肉、羊肉与狗肉的营养特性概述 |
| 1.1 鸭肉的营养特性及功效 |
| 1.2 羊肉的营养特性及功效 |
| 1.3 狗肉的营养特性及功效 |
| 2 免疫系统、粘膜免疫与细胞因子网络 |
| 2.1 免疫系统的概念 |
| 2.2 肠道粘膜免疫 |
| 2.2.1 肠道粘膜免疫系统的构成与功能 |
| 2.2.2 肠道粘膜系统的免疫反应过程 |
| 2.2.3 肠道粘膜系统的效应因子 |
| 2.3 细胞因子网络 |
| 2.3.1 细胞因子 |
| 2.3.2 细胞因子网络 |
| 2.4 免疫球蛋白与补体 |
| 2.4.1 免疫球蛋白 |
| 2.4.2 补体系统 |
| 3 食物营养与免疫系统 |
| 4 本研究的目的及意义 |
| 参考文献 |
| 下篇 研究报告 |
| 第一章 饲喂不同来源肉类对大鼠生长性能及部分血液生化指标的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 试验原料 |
| 1.1.2 主要仪器和设备 |
| 1.2 试验设计 |
| 1.3 样品采集 |
| 1.4 指标测定 |
| 1.4.1 生产指标 |
| 1.4.2 血液生化指标 |
| 1.4.3 血液抗氧化指标的测定 |
| 1.5 数据统计与分析 |
| 2 结果分析 |
| 2.1 词喂不同来源肉类对大鼠生长性能的影响 |
| 2.1.1 大鼠生长状态观察 |
| 2.1.2 饲喂不同来源肉类对大鼠日增重和采食量及料重比的影响 |
| 2.1.3 饲喂不同来源肉类对大鼠组织器官指数的影响 |
| 2.2 饲喂不同来源肉类对大鼠血清部分理化指标的影响 |
| 2.3 饲喂不同来源肉类对大鼠血清抗氧化能力的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第二章 饲喂不同来源的肉类对大鼠肠道粘膜免疫屏障的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 试验材料 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器和设备 |
| 1.2 试验设计 |
| 1.3 样品采集 |
| 1.4 指标测定 |
| 1.4.1 小肠组织形态学观察 |
| 1.4.2 样本蛋白含量的测定 |
| 1.4.3 肠粘膜MPO、SOD酶的活性 |
| 1.4.4 小肠粘膜通透性的检测 |
| 1.4.5 放免法测定肠道sIgA的表达 |
| 1.5 数据分析与统计方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 饲喂不同来源肉类对大鼠肠道发育的影响 |
| 2.2 饲喂不同来源肉类对大鼠对肠道通透性的影响 |
| 2.3 饲喂不同来源肉类对大鼠小肠粘膜MPO、SOD酶活性的影响 |
| 2.4 饲喂不同来源肉类对大鼠肠道sIgA的表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 饲喂不同来源肉类对大鼠细胞和体液免疫功能的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 试验材料 |
| 1.1.2 主要试剂及配制 |
| 1.1.3 主要仪器和设备 |
| 1.2 试验设计 |
| 1.3 样品采集 |
| 1.4 指标测定 |
| 1.4.1 双抗夹心(ABC)-ELISA |
| 1.4.2 流式细胞术 |
| 1.5 数据统计与分析 |
| 2 结果分析 |
| 2.1 细胞因子水平 |
| 2.1.1 大鼠血清IL-2、IL-6、IL-10水平的变化 |
| 2.1.2 大鼠血清干扰素、肿瘤坏死因子水平的变化 |
| 2.2 体液免疫指标变化 |
| 2.2.1 大鼠血清Ig-A、Ig-M水平的变化 |
| 2.2.2 大鼠血清补体C3、C4水平的变化 |
| 2.3 大鼠外周血T淋巴细胞亚群的变化 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 食用肉中免疫活性物质的分离与鉴定 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 主要试剂和溶液 |
| 1.2.1 试剂 |
| 1.2.2 主要缓冲液的配制 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 1.4 试验方法 |
| 1.4.1 粗提液的制备 |
| 1.4.2 免疫血清的制备 |
| 1.4.3 SDS-PAGE电泳 |
| 1.4.4 免疫印迹(Western-blot) |
| 1.4.5 活性蛋白的分离与纯化 |
| 1.4.6 蛋白的浓缩 |
| 1.4.7 质谱分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 鸭肉粗提液中免疫活性物质的分离与鉴定 |
| 2.1.1 鸭肉粗提液蛋白的分离 |
| 2.1.2 免疫印迹结果 |
| 2.1.3 特异性蛋白的纯化 |
| 2.1.4 离子交换层析色谱结果(D-52) |
| 2.1.5 质谱分析结果 |
| 2.2 羊肉免疫活性物质分离、鉴定结果 |
| 2.2.1 粗提液蛋白的分离 |
| 2.2.2 免疫印迹 |
| 2.2.3 离子交换层析色谱结果(D-52) |
| 2.2.4 凝股层析色谱结果（G-75) |
| 2.2.5 质谱分析结果 |
| 2.3 狗肉免疫活性物质的分离与鉴定结果 |
| 2.3.1 狗肉粗提液蛋白的分离 |
| 2.3.2 免疫印迹 |
| 2.3.3 离子交换层析色谱结果 |
| 2.3.4 凝胶层析色谱结果 |
| 2.3.5 质谱分析结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 鸭肉中免疫活性物质的鉴定 |
| 3.2 羊肉中免疫活性物质的鉴定 |
| 3.3 狗肉中免疫活性物质的鉴定 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 创新说明及工作展望 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表论文情况 |
| 附录 |
（10）鸡白细胞介素18成熟蛋白的表达、纯化及其单克隆抗体的制备与特性鉴定（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 细胞因子概述 |
| 1.2 白细胞介素 18 的研究进展 |
| 1.2.1 IL-18 基因结构及组织分布 |
| 1.2.2 IL-18 的表达 |
| 1.2.3 IL-18 的受体与信号转导 |
| 1.2.4 IL-18 与机体防御 |
| 1.3 鸡白细胞介素 18 的研究进展 |
| 1.3.1 鸡白细胞介素 18 的分子生物学特性 |
| 1.3.2 鸡白细胞介素 18 与临床疾病 |
| 1.3.3 ChIL-18 的应用前景 |
| 1.4 单克隆抗体 |
| 1.4.1 单抗技术的基本原理 |
| 1.4.2 单克隆抗体的特点 |
| 1.4.3 单克隆抗体技术的应用 |
| 1.5 动物细胞因子单克隆抗体及应用 |
| 1.6 本课题研究的内容、目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 所用试剂及耗材 |
| 2.1.3 质粒、细胞及受体菌培养基 |
| 2.1.4 主要试剂的配制 |
| 2.1.5 主要仪器及设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 鸡 IL-18 成熟蛋白基因原核表达载体的构建 |
| 2.2.2 重组质粒 pET-28a-mChIL-18 的鉴定 |
| 2.2.3 重组质粒 pET-28a-mChIL-18 的诱导表达 |
| 2.2.4 Western blot 检测 |
| 2.2.5 重组蛋白 rChIL-18 的大量表达及纯化 |
| 2.2.6 重组蛋白 rChIL-18 对 BALB/c 小鼠的免疫 |
| 2.2.7 mChIL-18 抗体间接 ELISA 检测方法的建立 |
| 2.2.8 细胞融合 |
| 2.2.9 杂交瘤细胞的克隆化及冻存 |
| 2.2.10 单克隆抗体腹水的制备 |
| 2.2.11 单克隆抗体特性的鉴定 |
| 2.2.12 Western-blot 的鉴定 |
| 2.2.13 特异性试验 |
| 2.2.14 间接免疫荧光鉴定 |
| 2.2.15 ELISA 叠加试验初步检测单抗的抗原识别位点 |
| 3 结果 |
| 3.1 重组质粒的 PCR、双酶切及测序鉴定 |
| 3.3 重组质粒 pET-28a-mChIL18 在 E.coli Rosetta(DE3)中的表达及纯化 |
| 3.3.1 诱导表达 |
| 3.3.2 诱导条件的优化 |
| 3.3.3 重组蛋白的 western-blot 分析 |
| 3.3.4 重组蛋白的大量表达及纯化 |
| 3.4 间接 ELISA 方法最佳反应条件的确定 |
| 3.4.1 抗原包被浓度与血清最佳稀释度的选择 |
| 3.4.2 包被液的选择 |
| 3.4.3 包被温度的优化 |
| 3.4.4 封闭液的选择 |
| 3.4.5 最佳封闭时间的选择 |
| 3.4.6 血清最佳反应时间的确定 |
| 3.4.7 酶标二抗稀释度的选择 |
| 3.4.8 酶标二抗最佳作用时间的选择 |
| 3.4.9 最佳反应时间 |
| 3.4.10 阴性阳性血清判定标准的确定 |
| 3.4.11 ELISA 重复性试验 |
| 3.4.12 血清样品的检测 |
| 3.5 细胞融合及杂交瘤细胞的筛选 |
| 3.6 杂交瘤细胞分泌抗体的稳定性鉴定 |
| 3.7 单抗特性的鉴定 |
| 3.7.1 Ig 亚类的鉴定 |
| 3.7.2 杂交瘤细胞的特异性鉴定 |
| 3.7.3 Western-blot 分析 |
| 3.7.4 杂交瘤细胞株的获得 |
| 3.7.5 McAb 的亚类及腹水效价检测结果 |
| 3.7.6 间接免疫荧光鉴定 |
| 3.7.7 单克隆抗体的位点分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 鸡白细胞介素 18 成熟蛋白的表达与纯化 |
| 4.2 mChIL-18 抗体间接 ELISA 方法的建立及应用 |
| 4.3 单克隆抗体的制备与鉴定 |
| 4.3.1 小鼠免疫 |
| 4.3.2 细胞融合 |
| 4.3.3 阳性克隆的筛选及单抗特性检测 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
四、人穿孔素C肽段的单克隆抗体和免疫血清的制备和鉴定（论文参考文献）
- [1]布鲁氏菌S19 bvfA基因缺失株免疫保护性及其与睾丸支持细胞互作组学研究[D]. 贾芳. 宁夏大学, 2021(02)
- [2]纳秒脉冲消融治疗肝细胞肝癌的免疫学效应及其作用机制研究[D]. 买为丽旦·衣明江. 新疆医科大学, 2021(08)
- [3]基于多肽芯片技术的H5亚型禽流感病毒HA2蛋白抗原表位筛选及DIVA疫苗候选株的构建[D]. 王秋霞. 扬州大学, 2020
- [4]寨卡病毒重组亚单位疫苗在非人灵长类水平的评估及其保护机制研究[D]. 杨若恒. 中国科学院大学(中国科学院上海巴斯德研究所), 2020(08)
- [5]靶向OX40主动免疫的抗肿瘤免疫效应[D]. 袁明翠. 昆明医科大学, 2020
- [6]交叉反应性CD8阳性T细胞在抗肿瘤和抗病毒中的作用[D]. 胡广. 中国科学院大学(中国科学院上海巴斯德研究所), 2019(07)
- [7]基于FnBPA和CD11c单链抗体的侵入型乳酸菌构建及其分子免疫机制研究[D]. 刘晶. 吉林农业大学, 2019
- [8]熊果酸抗肿瘤及作为小鼠肝癌细胞疫苗佐剂的作用研究[D]. 李艳红. 石河子大学, 2014(03)
- [9]饲喂不同来源肉类对大鼠免疫功能的影响[D]. 陈佳. 南京农业大学, 2012(12)
- [10]鸡白细胞介素18成熟蛋白的表达、纯化及其单克隆抗体的制备与特性鉴定[D]. 苏倩倩. 山东农业大学, 2012(02)