一、抗独特型抗体对小鼠心肌移植耐受的诱导作用（论文文献综述）
秦璨[1]（2020）在《丹参提取物对川崎病模型小鼠心肌组织的作用及机制研究》文中指出目的:探讨活血化瘀药物丹参脂溶性有效成分丹参酮ⅡA、水溶性有效成分丹酚酸B联合应用对川崎病冠状动脉损伤模型小鼠心肌组织的作用,并探讨其相关作用机理,为中医药对川崎病冠状动脉损伤所致心肌损伤的治疗提供新思路。材料与方法:将72只BALB/C小鼠随机分为6组,分别为空白对照组、模型组、阳性药组、丹参酮ⅡA+丹酚酸B组（1:1）、丹参酮ⅡA+丹酚酸B组（1:5）、丹参酮ⅡA+丹酚酸B组（5:1）。除空白对照组外,其余各组分别在第1、3、5、7、9、11天以腹腔注射2.5g/kg牛血清白蛋白的方法进行造模,同时予空白对照组生理盐水2.5g/kg腹腔注射,观察小鼠活动、食欲、反应等变化。造模结束后空白对照组及模型组予生理盐水灌胃10天,予阳性药组按前3天455mg/（kg·d）、后7天45.5mg/（kg·d）的剂量进行灌胃,应用中药的组别按40mg/（kg·d）的剂量灌胃10天。末次给药24h后,对小鼠进行取材,眼球取血进行ELISA检测,取心肌组织及冠状动脉进行HE染色并且制作切片,明确病理变化。结果:1.小鼠行为学:丹参酮ⅡA联合丹酚酸B在治疗10天后,小鼠活动度恢复正常,进食饮水增加,生活质量提升。2.小鼠心肌组织形态学改变:丹参酮ⅡA联合丹酚酸B能够改变KD-CAL小鼠的心肌组织的断裂情况,与模型组相比,丹参酮ⅡA+丹酚酸B（1:5）组的心肌组织基本无异常,结构排列有序、紧密。3.药物有效性相关指标检测:（1）小鼠血清CK活性:与模型组相比,阳性药组、丹参酮ⅡA联合丹酚酸B三个组均明显下降（P<0.05）;与阳性药组相比,丹参酮ⅡA+丹酚酸B组（1:5）明显下降（P<0.05）。（2）小鼠血清CK-MB活性:与模型组相比,阳性药组、丹参酮ⅡA+丹酚酸B组（1:1）、丹参酮ⅡA+丹酚酸B组（1:5）明显下降（P<0.05）。（3）小鼠血清LDH活性:与模型组相比,阳性药组、丹参酮ⅡA联合丹酚酸B三个组明显下降（P<0.05）。（4）小鼠血清α-HBDH活性:与模型组相比,阳性药组、丹参酮ⅡA联合丹酚酸B三个组明显下降（P<0.05）。（5）小鼠血清AST活性:与模型组相比,阳性药组、丹参酮ⅡA+丹酚酸B组（1:1）、丹参酮ⅡA+丹酚酸B组（1:5）明显下降（P<0.05）;与阳性药组相比,丹参酮ⅡA+丹酚酸B组（1:5）明显下降（P<0.05）。4.药物作用机制相关指标检测:（1）小鼠血清TNF-α水平:与模型组相比,阳性药组、丹参酮ⅡA+丹酚酸B组（1:5）水平较低,（P<0.05）;与阳性药组相比,丹参酮ⅡA联合丹酚酸三个组差异无统计学意义（P>0.05）。（2）小鼠血清IL-6水平:与模型组相比,阳性药组、丹参酮ⅡA+丹酚酸B组（1:5）、丹参酮ⅡA+丹酚酸B组（5:1）水平较低（P<0.05）;与阳性药组相比,丹参酮ⅡA+丹酚酸B组（1:1）、丹参酮ⅡA+丹酚酸B组（5:1）水平较高（P<0.05）。（3）小鼠血清IL-1β水平:与模型组相比,阳性药组、丹参酮ⅡA+丹酚酸B组（1:5）、丹参酮ⅡA+丹酚酸B组（5:1）水平较低（P<0.05）;与阳性药组相比,丹参酮ⅡA+丹酚酸B组（1:1）、丹参酮ⅡA+丹酚酸B组（5:1）水平较高（P<0.05）。结论:1.丹参脂溶性有效成分丹参酮ⅡA、水溶性有效成分丹酚酸B联合应用能够抑制川崎病冠状动脉损伤模型小鼠心肌组织的改变,减少其心肌的坏死。2.丹参酮ⅡA联合丹酚酸B配比为1:5时抑制心肌组织损伤效果最为显着。3.丹参酮ⅡA联合丹酚酸B治疗KD-CAL导致心肌组织受损的机制可能与炎症相关细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β有关。
鲁颖晔[2]（2014）在《益气补肾中药对自然流产模型小鼠脾脏Treg细胞中foxp3mRNA表达及蜕膜组织STAT5mRNA等表达的实验研究》文中提出目的观察益气补肾中药对自然流产模型小鼠脾脏Treg细胞、蜕膜组织中foxp3mRNA表达的影响及对蜕膜组织中STAT5mRNA、NF-KBmRNA表达的影响。方法将雌性CBA/J与雄性DBA/2或BALB/c小鼠以2:1合笼交配,造自然流产模型和正常妊娠模型。将CBA/J孕鼠分为6组:阴性对照组（NS组）、阳性对照组（CSA组）、中药高剂量组（48g/kg）、中药中剂量组（24g/kg）、中药低剂量组（12g/kg）、正常模型组。将孕鼠于妊娠第9天处死,取新鲜脾脏用于提取Treg细胞;将孕鼠于妊娠第9天或第14天处死,取蜕膜组织-80℃冻存。磁珠分选的方法分离和纯化脾脏Treg细胞,采用流式细胞术鉴定分选前后Treg细胞的纯度,运用RT-PCR分析Treg细胞中foxp3mRNA的表达情况。运用RT-PCR分析蜕膜组织中foxp3mRNA、STAT5mRNA、NF-κBmRNA的表达情况。结果各种干预对孕鼠脾脏Treg细胞中foxp3mRNA的表达:孕9天时,与阴性对照组相比,中药高剂量组Treg细胞中foxp3mRNA的表达增高,差异有统计学意义（P<0.05）。从数值看,各实验组组间有明显趋势,但无统计学差异（P>0.05）;各种干预对孕鼠母胎界面组织中foxp3mRNA、STAT5mRNA,NF-κBmRNA的表达情况:RT-PCR测定法经益气补肾中药干预后的孕鼠母胎界面组织中foxp3mRNA、STAT5mRNA,NF-KBmRNA的表达,与阴性对照组比较,中药高、中剂量组foxp3mRNA、STAT5mRNA表达上调（P<0.05）,NF-KBmRNA表达下调（P<0.05）。结论 益气补肾实验方可能通过上调自然流产模型小鼠脾脏Treg细胞中foxp3mRNA及蜕膜组织中foxp3mRNA、STAT5mRNA的表达,使妊娠时所需的免疫耐受状态得以维持;同时,益气补肾中药可能通过下调蜕膜组织中NF-KBmRNA的表达,使母胎界面组织中的转录因子表达有利于妊娠的方向发展。
薛洋[3]（2013）在《Her-2/neu抗独特型单克隆抗体的制备和初步研究》文中认为本研究拟研制Her-2/neu抗独特型单克隆抗体，为下一步深入研究Her-2/neu阳性乳腺癌抗独特型抗体疫苗奠定基础。在许多恶性肿瘤中都有Her-2/neu的大量增殖或高表达并且提示着较差的预后。因此Her-2/neu作为一种肿瘤相关抗原是肿瘤免疫治疗的一个有效的靶点。Her-2/neu的抗独特型抗体可以模拟Her-2/neu的特异性表位，使其可以代替作为肿瘤相关抗原的Her-2/neu刺激机体产生相应的免疫作用。因此Her-2/neu抗独特型抗体疫苗可以作为一种Her-2/neu阳性肿瘤免疫治疗的新手段。在我们的实验中，我们用赫赛汀免疫Balb/c小鼠，通过杂交瘤技术获得Her-2/neu抗独特型单克隆抗体。共得到三株能分泌Her-2/neu抗独特性单克隆抗体的细胞株，分别命名为：1F5、2D1、2C4。亚类检测显示：1F5为IgG3、2D1为IgG2b、2C4为IgG1。mAb2未浓缩腹水效价分别是：1F5为1:1.02-2.04104、2D1为1:3.2-6.4103、2C4为1:160-320。根据腹水效价，我们采用1F5和2D1的细胞株进行后续试验。通过竞争性抑制ELISA试验，我们发现1F5和2D1可以竞争Her-2/neu同抗Her-2/neu兔多克隆抗体的结合。我们用1F5和2D1免疫兔获得含有抗Her-2/neu抗独特型抗体的血清，并且证实Ab3可以和Her-2/neu特异性的结合。这些结果可以证明1F5和2D1是可以替代Her-2/neu的β型Her-2/neu抗独特型单克隆抗体。根据血清中Ab3的滴度选择1F5诱生的Ab3做后续试验。通过MTT实验可以发现不同浓度的pAb3可以抑制Her-2/neu表达阳性肿瘤细胞系（SK-BR-3）在体外的生长，并且实验组的抑制率同对照组相比有统计学意义（P＜0.001）。综上所述，我们利用现有条件首先在国内筛选制备出了Her-2/neu抗独特型单克隆抗体，并对其中一株的肿瘤疫苗性进行了进一步的研究，为乳腺癌的免疫治疗提供可能的新的疫苗的候选。Her-2/neu抗独特型抗体的研究国内目前未见报道。
邱涛[4]（2013）在《沉默RelB的树突状细胞诱导移植免疫耐受》文中提出研究背景实体器官移植是治疗终末期器官衰竭最有效的治疗方式,随着免疫抑制剂的发展,肾移植的5年存活率已得到显着改善,肝脏移植的远期疗效也取得长足进步。但现行的免疫抑制剂仍存在众多副作用,包括促使感染性疾病的发生,以及诱发移植后糖尿病,高血压,高血脂等,这些因素都影响患者生存质量,同时阻碍了受者、移植物的长期存活,而诱导免疫耐受是器官移植后最理想的一种存在方式。诱导对移植物的特异性耐受后可以减少抗排斥药的使用,避免各种毒副作用,延长受者,移植物的长期存活。目前树突状细胞（DC）是一类最具有潜力的运用于诱导免疫耐受的细胞,最初DC被认为是体内最强的抗原提呈细胞,诱导免疫应答,称之为反应性DC,新近又发现DC也可以诱导T细胞低反应性,这种DC被称作为调节性DC,但体内DC数量较少,且以反应性DC为主,如何体内外诱导耐受性DC的扩增,分化成为移植免疫耐受研究的热点。上世纪90年代以后利用细胞因子体外扩增DC的技术逐步成熟,从而为利用DC进行输注治疗提供了基础。研究目的采用小干扰RNA技术,体外制备RelB shRNA慢病毒,同时体外培养扩增小鼠骨髓来源的树突状细胞（BMDC）, RelBshRNA慢病毒转染DC诱导耐受性树突状细胞的产生,对转染后的耐受性DC的表型,凋亡,分泌细胞因子,以及耐受性DC诱导T细胞反应性研究,以及诱导T细胞低反应性的机制研究。利用RelB shRNA制备耐受性树突状细胞移植前输注预防心脏移植排斥反应。研究方法1、RelBshRNA转染DC后DC生物学形态,功能的改变利用慢病毒载体系统构建RelB shRNA慢病毒载体,制备纯化慢病毒颗粒。实验分组：未成熟组（imDC组）,将获得的BMDC持续培养,避免LPS等外源性刺激；成熟DC组（mDC组）,将获得的BMDC进行培养,在第7天用LPS刺激成熟；干扰载体对照组（LucR siRNA DC组）,将获得的BMDC进行培养,于第5天感染干扰对照载体LucR-siRNA慢病毒,至第7天经LPS刺激成熟；RelB shRNA转染DC组（RelB shRNA DC组）,将获得的BMDC继续培养,于第5天感染Re1BshRNA’慢病毒颗粒,至第7天,经LPS刺激成熟。慢病毒感染DC的MOI为50,在MOI为50时,经荧光显微镜和流式细胞仪检测感染阳性率达到92%以上。LPS刺激成熟的浓度为50ng/ml。RT-PCR和Western-blot检测转染后DC中RelB的表达；利用流式细胞仪检测DC凋亡率以及DC表型分子MHC-2, CD80, CD86, CD83的表达；ELISA检测转染后的DC分泌的细胞因子IL-10, IL-12, TGF-β1; ELISA检测转染后的DC胞核NF-KB各亚基的DNA结合活性。2、RelB shRNA转染DC后诱导T细胞低反应性研究利用RelB shRNA慢病毒转染DC获得耐受性树突状细胞。RelB shRNA-DC同同种抗原特异性T细胞（BABL/C来源）进行混合淋巴细胞反应（第1次MLR）,将第1次MLR获得的T细胞同相同特异性抗原以及第三方抗原来源（C3H来源）的DC进行第2次MLR, MTT法检测两次MLR后T细胞增殖能力,ELISA检测第1次MLR后分泌的细胞因子IL-2,IFN-γ,IL-10和IL-4水平；流式细胞仪检测反应后T细胞凋亡率以及T细胞分化为CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的比率。3、RelB shRNA-DC移植前输注预防心脏移植急性排斥反应建立小鼠腹部心脏移植模型,实验分为4组,每组10只小鼠,未输注组：受体BABL/c小鼠心脏移植前后无任何特殊处理；不成熟组：受体BABL/c小、鼠心脏移植前7d经尾静脉输注培养7d但未作其他处理的DC（体外不成熟DC）；空载体组：受体BABL/c小鼠心脏移植前7d经尾静脉输注供体C57BL/6小鼠来源的空载体转染DC; RelB shRNA组：受体BABL/c小鼠心脏移植前7d经尾静脉输注供体C57BL/6小鼠来源的RelB shRNA转染DC。观察移植后小鼠心脏存活时间；移植后7天各组各取2只小鼠,切除移植物,行HE染色检测排斥反应程度。结果1、相比于imDC组,mDC组,LucR siRNA DC组,RelB shRNA DC组低表达RelB mRNA和RelB蛋白；RelB shRNA DC组的凋亡率同其余三组无差异；MB shRNA可下调DC表型分子MHC-2, CD80, CD86, CD83的表达；转染后的DC低表达IL-12,高表达IL-10, TGF-β1表达无差异；RelB shRNA抑制了核内RelB的DNA结合活性,但不影响p50、p52、RelA （p65）、c-Rel的DNA结合活性。2、mDC组和LucR siRNA DC组有较强的刺激同种T细胞增殖能力,imDC组和RelB shRNA DC组DC刺激同种T细胞增殖能力明显减弱；RelB shRNA转染DC能诱导同种T细胞抗原特异性低反应性,但对第三方抗原无特异性地反应性。MLR后T细胞分泌低水平的IL-2,IFN-γ,分泌高水平的IL-10和IL-4；RelB shRNA-DC诱导T细胞凋亡率增加；诱导T细胞向CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞分化增加。3、小鼠心脏移植模型中,预先输注供体来源的RelB shRNA-DC可延长移植物存活时间,降低排斥反应发生程度。结论1、利用RelB shRNA慢病毒体外转染树突状细胞使MHC-2, CD80, CD86, CD83呈低表达,分泌抑制性细胞因子,而不影响DC存活以及其它功能。2、RelBshRNA慢病毒转染DC获得的耐受性DC诱导T细胞特异性低反应性,主要机制是诱导T细胞凋亡,诱导T细胞向调节性T细胞分化,分泌的细胞因子由Thl型向Th2型转变。3、在心脏移植模型中,移植前输注RelB shRNA-DC可预防移植物急性排斥反应,降低排斥反应程度,延长小鼠存活期。
刘子泉[5]（2011）在《人源S100A1和S100B全基因合成、表达、单抗制备及其活性分析》文中研究指明S100A1和S100B蛋白是低分子量钙结合蛋白,均属于S100蛋白家族。S100蛋白家族分子具有广泛的生物学活性。其主要功能是作为钙结合蛋白参与多种细胞内的活性调节,通过钙离子信号转导、影响激素分泌、抑制微管蛋白的组装及抑制蛋白激酶C介导的磷酸化等途径,在细胞增殖与分化、肌肉收缩、基因表达与分泌、以及细胞凋亡中发挥重要作用。研究表明,S100基因或蛋白在很多疾病中表达异常,如阿希海默病、银屑病、胆囊纤维化、肌萎缩性（脊髓）侧索硬化、心肌病和癌症等,而且与疾病的分期和预后密切相关。目前,S100蛋白家族在肿瘤发生发展中的作用尚不明确。但已有研究提示,S100蛋白家族通过调节信号通路影响肿瘤发生发展。S100蛋白家族成员在多种肿瘤组织中高表达,其抗体在肿瘤的诊断和治疗中具有很重要的潜在作用和意义。S100A1和S100B蛋白是最早被发现的S100蛋白家族成员。S100A1蛋白的表达有高度的组织特异性和细胞特异性,在骨骼肌中很少表达,而在健康心肌细胞中则大量表达。心力衰竭时S100A1表达下降,增加S100A1的表达能改善心肌细胞内Ca2+转运的动态平衡,抑制心肌细胞凋亡,改善心肌能量供应,影响心脏重构,从而改善心肌收缩、舒张功能,抑制和逆转心力衰竭的进展。S100A1可与其它S100家族成员如S100A4共同作用,影响肿瘤的浸润、侵袭和转移。此外,它还参与细胞糖代谢,与细胞骨架动力学组成相关,通过与G蛋白作用调控cAMP的信号传导途径,参与细胞增殖相关的钙信号传导过程。S100B是S100家族中存在于脑内最主要和最具有活性的成员,约96%存在于脑内,主要由星形胶质细胞合成。S100B蛋白有广泛的生物学活性,在生理情况下发挥重要的生理功能,但含量过高可能具有直接神经毒性作用,或者同糖基化终末产物的受体（receptor for advanced glycation endproducts,RAGE）相互作用而导致神经细胞凋亡。S100B能调节细胞的可塑性,有助于星形胶质细胞的钙处理能力,参与信息传递,调节细胞代谢,有胶质源性的营养作用。此外, S100B能促进胰岛细胞、垂体瘤细胞分泌胰岛素和催乳素,参与炎症反应。神经胶质细胞旁分泌和自分泌S100B蛋白,可作用于神经元和神经胶质细胞,促进神经的生长和损伤的修复。S100A1和S100B蛋白与很多疾病的发生发展有密切联系,在胞内和胞外均能发挥其生物学作用。由于S100A1和S100B蛋白功能的多样性,研究人员把S100A1和S100B蛋白作为某些疾病诊断的标志物以及潜在药物靶标进行探索,并已取得了阶段性研究成果。目前,对S100A1和S100B蛋白的功能研究比较全面,但开展S100A1和S100B蛋白作用机制方面的研究很少,S100A1和S100B蛋白在细胞内外发挥作用的信号转导途径是什么?是否存在特异性受体?其在肿瘤发生发展中的作用及机制如何?需要进一步研究确定。但S100A1和S100B蛋白及其单克隆抗体多为进口产品,价格高,购买困难,无论从经济上还是效率上都限制了对该蛋白和抗体的研究和利用,不利于大规模地开展蛋白相关功能及其机制的研究。因此,我们拟构建人源S100A1和S100B蛋白表达载体,制备高纯度国产人源S100A1和S100B蛋白及其单克隆抗体。制备获得的重组蛋白,可用于肿瘤组织的临床检测及分子靶标作用的基础研究,以揭示其作用机制。制备其单克隆抗体可用于人源S100A1和人源S100B蛋白表达水平的检测、疾病诊断、治疗及预后判断,这为以后深入研究该蛋白特性及其在相关疾病中的作用机制奠定了基础,具有重要的现实意义。主要研究结果如下:第一部分:人源S100A1和S100B全基因合成和优化、表达、纯化与鉴定实验一人源S100A1全基因合成和优化、表达、纯化与鉴定方法:1.优化人源S100A1基因序列,设计合成人源S100A1序列引物,在两端引物分别引入EcoR I和BamH I酶切位点,分段合成法PCR全基因合成人源S100A1全基因。2.回收纯化PCR产物, TA克隆至载体pMD18-T ,构建克隆载体pMD18-S100A1,并将其转化到E. coli DH5α中,PCR筛选阳性转化子,小量提取质粒,经酶切鉴定后送invitrogen公司测序。3.用EcoR I和BamH I双酶切测序正确的pMD18-S100A1,与经同样酶切的pBV220质粒用T4 DNA连接酶连接,构建表达质粒pBV220 -S100A1,并将其转化到表达宿主E.coli DH5α中,PCR筛选阳性转化子。4.将阳性单菌接种于含氨苄西林的LB培养基中,热激诱导表达人源S100A1蛋白。5. SDS-PAGE和Western Blotting分析鉴定重组蛋白。6.采用离子交换层析法纯化人源S100A1蛋白。7.脱盐并冻干人源S100A1蛋白。结果:1.全基因合成了人源S100A1基因,成功构建重组表达质粒pBV220-S100A1,经酶切鉴定和DNA序列测序分析表明,该质粒含有人源S100A1基因的编码序列全长,开放阅读框架正确。2.重组表达质粒pBV220-S100A1转化入表达宿主,诱导表达产物经纯化、SDS-PAGE和Western Blotting分析,表明表达蛋白为人源S100A1蛋白。结论:1.成功构建含有人源S100A1编码序列原核表达载体pBV220-S100A1。2.经热激诱导表达、离子交换层析纯化获得纯度达95%的重组S100A1蛋白。实验二人源S100B全基因合成和优化、表达、纯化与鉴定方法:1.优化人源S100B基因序列,设计合成人源S100B序列引物,在两端引物分别引入Nde I和XhoⅠ的酶切位点,分段合成法PCR合成人源S100B基因。2.回收纯化PCR产物,TA克隆至载体pMD18-T,构建克隆载体pMD18-S100B,并将其转化到E. coli DH5α中,PCR筛选阳性转化子,小量提取质粒,经酶切鉴定后送invitrogen公司测序。3.用Nde I和XhoⅠ双酶切测序正确的pMD18-S100B,与经同样酶切的pET32a质粒用T4 DNA连接酶连接,构建表达质粒pET32a-S100B,并将其转化到表达宿主E.coli BL21（DE3）中,PCR筛选阳性转化子。4.将阳性单菌接种于含氨苄西林的LB培养基中,IPTG诱导表达人源S100B蛋白。5. SDS-PAGE和Western Blotting分析鉴定重组蛋白。6.采用离子交换层析法纯化人源S100B蛋白。7.脱盐并冻干人源S100B蛋白。结果:1.全基因合成人源S100B基因,成功构建重组表达质粒pET32a-S100B,经酶切鉴定和DNA序列测序分析表明,该质粒含有人源S100B基因的编码序列全长,开放阅读框架正确。2.重组表达质粒pET32a-S100B转化入表达宿主,诱导表达产物经纯化、SDS-PAGE和Western Blotting分析,表明表达蛋白为人源S100B蛋白。结论:1.成功构建含有人源S100B编码序列原核表达载体pET32a-S100B。2.经IPTG诱导表达、离子交换层析纯化获得纯度≥95%的重组S100B蛋白。第二部分:人源S100A1和S100B蛋白促进Hela细胞侵袭迁移研究方法:利用人工基底膜和基质胶,模拟在体的基质膜屏障,根据肿瘤细胞穿过基质膜的数量间接反映它的侵袭能力,而肿瘤细胞穿过不含基质胶滤膜的数量间接反映它的迁移能力。铺有基质胶的滤膜放在上下室之间,铺有基质胶面朝向上室,在下室中加趋化剂,对照组上室加入100uL重悬的Hela细胞和100uL基础培养基,实验组上室加入100uL重悬的Hela细胞和100uL重组蛋白,具有侵袭能力的细胞在趋化剂诱导下开始穿膜运动。穿过滤膜的细胞多数粘附在滤膜下表面,可用棉签将上表面的细胞拭去,然后经固定、染色,观察统计穿过基质胶的细胞数量。结果:1.人源S100A1蛋白显着提高Hela细胞迁移能力（与对照组相比,P<0.05）,但对其侵袭能力无显着影响。2.人源S100B蛋白可使Hela细胞的侵袭能力提高2.8倍,迁移能力提高3.5倍。结论:1.纯化获得的重组人源S100A1蛋白具有生物活性,可提高肿瘤细胞的迁移能力。但对其侵袭能力影响较小。2.纯化获得的重组人源S100B蛋白具有生物活性,可提高肿瘤细胞的侵袭和迁移能力。第三部分:抗人S100A1和S100B蛋白单克隆抗体的制备、纯化与鉴定实验一抗人S100A1蛋白单克隆抗体的制备、纯化与鉴定方法:1.将纯化的重组人源S100A1蛋白和免疫佐剂共同制备成免疫原,免疫小鼠。2.用传统的细胞融合法,将免疫成功的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合得到杂交瘤细胞。3. ELISA检测杂交瘤细胞上清液中抗人S100A1抗体的效价,筛选阳性细胞株。4.有限稀释法对阳性细胞株进行亚克隆,得到能够分泌目标抗体的单细胞株。5.冻存阳性细胞株,三个月后复苏细胞,检测其抗体分泌的稳定性。6.体内接种杂交瘤单细胞株,制备腹水型单克隆抗体,用Protein G HP层析纯化蛋白,得到人源S100A1单克隆抗体。7. Western Blotting及ELSIA法鉴定抗体特异性。8. ELSIA法测定抗体的亲和常数。结果:1.获得了4株能稳定分泌抗人S100A1单克隆抗体细胞株。2. 4株细胞抗体亲和常数均较高,结合抗原的能力均较强,与其他抗原无交叉反应,特异性好。结论:1.建立了能稳定分泌抗人S100A1单克隆抗体的杂交瘤细胞株。2.制备出抗人S100A1单克隆抗体,并进行了相关性质鉴定。实验二抗人S100B蛋白单克隆抗体制备、纯化与鉴定方法:1.将纯化的重组人源S100B蛋白和免疫佐剂共同制备成免疫原,免疫小鼠。2.用传统的细胞融合法,将免疫成功的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合得到杂交瘤细胞。3. ELISA检测杂交瘤细胞上清液中人源S100B抗体的效价,筛选阳性细胞株。4.有限稀释法对阳性细胞株进行亚克隆,获得能分泌目标抗体的单细胞株。5.冻存阳性细胞株,三个月后复苏细胞,检测其抗体分泌的稳定性。6.体内接种杂交瘤单细胞株,制备腹水型单克隆抗体,用Protein G HP纯化蛋白,获得人源S100B单克隆抗体。7. Western Blotting及ELSIA法鉴定抗体特异性。8. ELSIA法测定抗体的亲和常数。结果:1.获得了3株能稳定分泌抗人S100B单克隆抗体的细胞株。2. 3株细胞抗体亲和常数均较高,结合抗原的能力均较强,与其它抗原无交叉反应,特异性好。结论:1.建立了能稳定分泌抗人S100B单克隆抗体的杂交瘤细胞株。2.制备出抗人S100B单克隆抗体,并进行了相关特性鉴定。第四部分:抗人S100A1和S100B单克隆抗体活性分析方法:1.外源性给予抗人S100A1单克隆抗体,观察其对人黑色素瘤细胞A375增殖、凋亡及P53蛋白表达的影响。2.以商业化的抗人S100A1单克隆抗体为对照,利用制备的抗人S100A1单克隆抗体Western Blotting法检测人黑色素瘤细胞A375中S100A1蛋白的表达。3.外源性给予抗人S100B单克隆抗体,观察其对人黑色素瘤细胞A375增殖、凋亡及P53蛋白表达的影响。4.商业化的抗人S100B单克隆抗体为对照,利用制备的抗人S100B单克隆抗体Western Blotting法检测人黑色素瘤细胞A375中S100B蛋白的表达。结果:1.外源性给予抗人S100A1单克隆抗体,细胞增殖速度减慢,细胞凋亡增加,胞浆内S100A1蛋白表达降低,P53蛋白表达增多。2. Western Blotting检测显示,S100A1蛋白在人黑色素瘤细胞A375中弱表达,且与商业化的进口单抗相比,检测效果无明显差异。3.外源性给予抗人S100B单克隆抗体,细胞增殖速度减慢,细胞凋亡增加,胞浆内S100B蛋白表达降低,P53蛋白表达增多。4. Western Blotting检测显示,S100B蛋白在人黑色素瘤细胞A375中有表达,但与商业化的进口单抗相比,检测效果无明显差异。结论:1.制备的抗人S100A1和S100B单克隆抗体既可以用于肿瘤细胞的Western Blotting检测,又可发挥抑制肿瘤细胞的增殖,起到靶向治疗作用,为相关疾病的诊断和治疗提供了新的筛查手段。2.抗人S100A1和S100B单克隆抗体对癌细胞的靶向治疗作用,其机制可能是通过与S100A1和S100B蛋白结合,使胞浆内S100A1和S100B蛋白表达减少,增加了野生型P53蛋白表达,从而促细胞凋亡,达到抑制肿瘤细胞增殖的作用。
李曼君[6]（2011）在《西咪替丁对日本血吸虫DNA疫苗免疫保护作用的影响及其机制研究》文中研究指明日本血吸虫病是一种广泛流行并严重影响人畜健康的寄生虫病。我国目前对血吸虫病的防治重点在于灭螺及人畜同步化疗。但是由于吡喹酮仅对侵入皮肤3 h的童虫和成虫有效,且目前在很多国家已经出现对吡喹酮敏感性降低的报道。因此,安全有效的疫苗对血吸虫病的防治具有重要的作用。日本血吸虫疫苗的研究经历了死疫苗、减毒活疫苗、基因工程疫苗和核酸疫苗等过程。其中核酸疫苗中最常用的是DNA疫苗,因其具有制备简单、保存及运输方便和能诱导广泛和持久的体液免疫和细胞免疫的优点而备受研究者青睐。目前血吸虫DNA疫苗在血吸虫研究中占据着主导地位。但是截至目前为止,单价DNA疫苗的免疫保护效果并不令人满意,WHO推荐的40%或以上的保护力仍然没有达到。究其原因在于,血吸虫作为一种多细胞生物,基因组非常复杂,且在与宿主长期进化的过程中产生了多种免疫逃避机制。新近证实,调节性T细胞（Tregs）与寄生虫逃避宿主免疫攻击关系非常密切。在很多感染性疾病中,尤其是寄生虫感染时Tregs的水平显着升高,从而成为了寄生虫一个逃生的“窗口”帮助其逃避宿主的免疫攻击。在疟疾感染的小鼠模型中,消耗Tregs有利于机体清除病原体并降低小鼠出现致死性感染的可能。因此探究血吸虫感染中Tregs的变化,并针对该变化采取相应的治疗方案必将有助于血吸虫疫苗的研究。西咪替丁（CIM）作为H2受体阻滞剂在临床上一直用于治疗胃酸引起的胃肠功能紊乱并有确定的疗效。除此之外,CIM在临床上还广泛的用于治疗疱疹病毒,HIV病毒等感染性疾病引起的免疫功能下降,以及阻抑肿瘤的发生及生长。研究表明,其作用机制主要在于抑制抑制性T细胞的功能从而发挥免疫增强作用。有报道称,直接将CIM和毗喹酮合用可显着提高吡喹酮的杀虫效果。同时也有很多将CIM作为一种免疫调节剂来增强疫苗的免疫原性的报道。因此,本研究选用CIM和日本血吸虫26KD谷胱甘肽S-转移酶（Sj26）DNA疫苗合用,一方面观察CIM和日本血吸虫pEGFP-Sj26GST DNA疫苗联合使用的免疫保护作用；另一方面观察CIM和日本血吸虫pEGFP-Sj26GST DNA疫苗联合使用后宿主体内Tregs的变化,并探讨其免疫机制。本课题分为以下三个部分：一、西咪替丁对日本血吸虫感染小鼠免疫应答的影响研究目的：探讨不同剂量的C1M对血吸虫感染小鼠免疫应答的影响。方法：32只6-8周龄的BALB/c雌性小鼠随机分成3组,即50 mg/kg CIM组（CIM50）、25 mg/kg CIM组（CIM25）及感染对照组（Control）。CIM50组采用50mg/kg的CIM皮下注射三次,每次间隔两周；CIM25组采用25 mg/kg的CIM皮下注射三次,每次间隔两周,即第1、14、28天分别用药一次；Control为单纯感染组。第42天时各组小鼠攻击感染日本血吸虫尾蚴40条/鼠。感染后第6周杀鼠取脾淋巴细胞计数,检测脾淋巴细胞中CD4+CD25+FoxP3+Tregs百分比及IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-5水平。结果：和感染对照组相比,使用25mg/kg CIM组调节性T细胞的比例显着降低（P<0.01）且小鼠脾细胞培养上清中IL-2、IFN-γ的水平均较对照组升高（P<0.05）,而IL-4、IL-5的水平虽较对照组升高,但无显着性差异（P>0.05）。而和感染对照组相比,使用50mg/kg CIM组在调节性T细胞的比例及小鼠脾细胞培养上清中细胞因子的水平上均与对照组无显着性差异（P>0.05）。结论：CIM可作为免疫调节剂,增强小鼠的免疫功能,从而提高小鼠对血吸虫感染的免疫保护作用,但是该作用与剂量有关。二、西咪替丁和日本血吸虫pEGFP-Sj26GST DNA疫苗联合使用的免疫保护作用研究目的：观察CIM对pEGFP-Sj26GST DNA疫苗免疫保护作用的影响。方法：从本室保存的DH5a大肠杆菌体内提取已构建好的pEGFP-Sj26GST重组质粒,进行鉴定。50只BALB/c小鼠随机分为5组,即感染对照组、CIM单用组、pEGFP-N3空载体对照组、pEGFP-Sj26GST DNA疫苗组及CIM和pEGFP-Sj26GST DNA疫苗合用组。其中疫苗组每只小鼠在第1、14及28天时分别经股四头肌注射100μgpEGFP-Sj26GST DNA疫苗或pEGFP-N3空载体,CIM组每只小鼠从首次免疫前两天开始每天皮下注射25 mg/kg的CIM直至感染前。末次免疫后2周,各组小鼠均经腹部皮肤感染日本血吸虫尾蚴40条/鼠。感染后第6周杀鼠冲虫,计数每只小鼠的虫荷及肝内虫卵数。计算减虫率和肝组织中每条雌虫的减卵率。取出小鼠肝组织用福尔马林固定,脱水、石蜡切片、HE染色,检测各组小鼠肝组织内虫卵肉芽肿的变化。结果：将大量提取出的pEGFP-Sj26GST重组质粒及pEGFP-N3空载体质粒在核酸分析仪上检测发现浓度达到3mg/ml且纯度较高。动物保护性试验结果显示,CIM和pEGFP-Sj26GST DNA疫苗联合使用后减虫率高达79%,显着高于pEGFP-Sj26GST疫苗单独使用组（27%）及其他各组。肝脏内虫卵计数发现其肝减卵率与pEGFP-Sj26GSTDNA疫苗单用组相比,联合使用CIM和pEGFP-Sj26GST DNA疫苗也有显着的降低（22.48%vs 68.35%）。小鼠肝组织HE染色显示,和感染对照组相比,CIM和PEGFP-Sj26GST DNA疫苗合用组的虫卵肉芽肿数目（16.25±2.87 vs 4.5±1.76）显着减少。显微镜下可见,感染对照组的肝肉芽肿体积较大,而pEGFP-Sj26GST疫苗组及与CIM合用组的肝肉芽肿体积则明显缩小。结论：CIM可作为佐剂增强血吸虫pEGFP-Sj26GST DNA疫苗的免疫保护效果。且CIM和疫苗合用可以显着减少血吸虫感染宿主肝内虫卵肉芽肿的数目。三、西咪替丁增强日本血吸虫pEGFP-Sj26GST DNA疫苗的免疫保护作用的机制研究目的：观察CIM对宿主体内CD4+CD25+Tregs及相关细胞因子的影响,探讨CIM增强pEGFP-Sj26GST DNA疫苗免疫保护作用的机制。方法：80只雌性BALB/c小鼠随机分成五组,即感染对照组、CIM组、pEGFP-N3空载体对照组、pEGFP-Sj26GST DNA疫苗组及CIM和pEGFP-Sj26GST DNA疫苗合用组。其中疫苗组每只小鼠在第1、14及28天时分别经股四头肌注射100μgpEGFP-Sj26GST DNA疫苗或pEGFP-N3空载体,即每只小鼠免疫三次,每次间隔2周。CIM组每只小鼠从首次免疫前两天开始每天皮下注射25mg/kg的CIM直至感染前。各组取6只小鼠在末次免疫后一周剖杀,取眼眶血,静置后离心取上清,检测其血清中特异性GST抗体的含量。将剩余的50只小鼠在末次免疫后2周均经腹部皮肤感染日本血吸虫尾蚴40条/鼠。感染后第6周,剖杀小鼠,无菌取脾,制备单个脾细胞悬液,流式细胞仪检测脾淋巴细胞中CD4+CD25+Tregs百分比。将无菌取出的脾细胞悬液在体外用丝裂原ConA刺激后培养48小时,MTT法检测在体外各组脾细胞对丝裂原的增值比率。体外培养72小时离心收集各组脾细胞上清,夹心ELISA法分别检测脾细胞上清中Th1细胞因子γ-干扰素（IFN-γ）、白细胞介素-2（IL-2）和Th2细胞因子白细胞介素-4（IL-4）、白细胞介素-5（IL-5）和白细胞介素-10（IL-10）等细胞因子含量。结果：1)使用pEGFP-Sj26GST DNA疫苗后小鼠血清中特异性的抗Sj26GST抗体的水平明显高于空载体组及单用CIM组（p<0.05）,且将pEGFP-Sj26GST DNA疫苗和CIM合用后小鼠血清中特异性的抗Sj26GST抗体的水平亦显着高于单独使用pEGFP-Sj26GST DNA疫苗组（p<0.05）。2)和感染对照组相比,单用pEGFP-Sj26GST DNA疫苗可以降低其脾淋巴细胞中CD4+CD25+Foxp3+T细胞的比例（p<0.05）,而将CIM和pEGFP-Sj26GST DNA疫苗合用则可以显着降低其脾淋巴细胞中CD4+CD25+Foxp3+ T细胞的比例（p<0.01）。3)和感染对照组相比,单用CIM后脾淋巴细胞对ConA的增殖反应明显提高,而合用CIM及pEGFP-Sj26GST DNA疫苗后,脾淋巴细胞对ConA的增殖反应则较单独使用pEGFP-Sj26GST DNA疫苗组亦有显着提高（p<0.05）。4)CIM和pEGFP-Sj26GST DNA疫苗合用组小鼠脾细胞培养上清中IL-12、IFN-γ的水平均较感染对照组高（P<0.05）,IL-10的含量较对照组降低（P<0.05）,而IL-4、IL-5的水平虽较对照组升高,但无显着性差异（P>0.05）。结论：1)提取出的pEGFP-Sj26GST DNA疫苗具有较强的免疫原性,将CIM与疫苗合用后能诱导机体产生更高水平的特异性抗体。2)CIM和疫苗合用可以降低血吸虫感染宿主脾淋巴细胞中CD4+CD25+ Tregs的百分比。3)CIM可以辅助DNA疫苗在体外增强T淋巴细胞对丝裂原的反应,增强T细胞的功能。4)CIM和疫苗合用可以增强机体的Thl型免疫反应,提高疫苗的保护性免疫效果。课题的特色和创新点：1)证明了CIM可作为一种免疫调节剂增强机体的Thl型免疫应答。2)首次将CIM与日本血吸虫的DNA疫苗合用,并证实能有效提高抗日本血吸虫感染的免疫保护作用。3)证明CIM增强疫苗保护作用的机制与其下调宿主CD4+CD25+Tregs的水平有关。
杨福贵[7]（2011）在《CTLA4Ig、ICOSIg联合雷帕霉素对心脏移植排斥的影响》文中认为第一部分小鼠耳后心脏一直模型的建立目的:建立一种改良的小鼠心脏移植模型,以进行心脏移植免疫排斥的研究。方法:受体小鼠麻醉、耳廓消毒,于耳廓背侧中线下1/3处做3～4 mm横切口,沿皮下用眼科颞向耳尖方向钝性分离,形成一个约2 mm×5 mm狭长皮下孔道,末端稍扩大成囊袋状,充以乳酸林格氏液;24h之内的新生乳鼠剑突下取心,置于0～4℃无菌乳酸林格氏液中搏动1至2次;心脏置入受体准备好的皮下囊袋中,心脏离体时间2分钟以内。结果:初期同系小鼠心脏移植存活率达80%,同种异体移植存活率达63.6%,熟练操作后同种异体移植存活率达98.1%。结论:该改良型小鼠耳后心脏移植模型稳定且易于观察,实验结果证明已成功建立起小鼠耳后心脏移植模型。第二部分CTLA4Ig联合雷帕霉素对小鼠心脏移植排斥的影响目的:观察雷帕霉素联合CTLA4 Ig对小鼠心脏移植存活时间的影响。方法建立小鼠耳后心脏移植模型,随机分为四组:A组对照组不给药,B组移植后0,2,4d腹腔注射CTLA4 Ig 150ug/kg,C组移植后当天开始连续14天灌胃给予雷帕霉素1mg/kg,D组移植后0,2,4d腹腔注射CTLA4 Ig 150ug/kg,连续14天灌胃给予雷帕霉素1mg/kg;观察各组移植心脏存活时间,移植后第八天取材送检,HE染色观察心肌浸润情况。结果:小剂量CTLA4和雷帕霉素联合用药较对照组、单独用药组心脏移植存活时间虽短暂延长,但差异不具有显着性;联合用药组淋巴细胞浸润较其他组明显减少。结论:小剂量CTLA4Ig和雷帕霉素联合用药在未能有效延长移植心脏存活时间的情况下已初步表现出抑制心脏移植免疫排斥的协同作用。第三部分CTLA4Ig、ICOSIg联合雷帕霉素对心脏移植排斥的影响目的:观察CTLA4Ig、ICOSIg联合雷帕霉素对小鼠心脏移植排斥的影响。方法:建立小鼠耳后心脏移植模型,随机分为四组:A组对照组不给药,B移植后0,2,4d腹腔注射CTLA4Ig 250ug/kg,1,3,5d腹腔注射ICOSIg 100ug/kg,C组移植后0～14d腹腔注射雷帕霉素0.5mg/kg,D组移植后0,2,4d腹腔注射CTLA4Ig 250ug/kg,1,3,5d腹腔注射ICOSIg 100ug/kg, 0～14d腹腔注射雷帕霉素0.5mg/kg;观察各组小鼠移植心脏存活时间;移植后第八天取材送检HE染色,观察心肌淋巴细胞浸润情况;免疫组化指标检测心肌bcl-2,bax表达。结果:1. A组存活时间为13.1天,B组存活时间13.7天,C组存活时间19.4天,D组存活时间22天。D组较其他组有显着差异;2. D组心肌淋巴细胞浸润较其他组明显减轻;3. D组bcl-2表达较其他组明显增多,bax表达较其他组明显减少,提示心肌细胞凋亡较其他组明显减轻。结论:CTLA4Ig、ICOSIg联合雷帕霉素三者协同作用能较其他组明显抑制急性排斥反应,改善移植心脏存活状况。
薄智勇[8]（2010）在《伊维菌素抗独特型和抗异型抗体的制备及鉴定》文中进行了进一步梳理伊维菌素属于大环内脂类抗生素,由于其具有优良的驱虫特性而广泛应用于畜牧养殖中。虽然伊维菌素的作用剂量较小,但是作为脂溶性药物,它在动物体内的残效时间较长,因此WHO将其列为高毒化合物,所以伊维菌素药物在动物组织中残留不容忽视。目前较常用的检测IVM的方法主要有色谱技术,如：高效液相色谱检测法（HPLC）、气相色谱（GS）；免疫学分析方法,如：酶联免疫吸附法（ELISA）、胶体金免疫测定法（CGIA）等。但是色谱技术存在着方法复杂、耗时长、花费大、技术要求高等原因而不适合大批量样品的筛选等问题,而免疫学检测方法可以解决这些问题,其中的ELISA法就是一种准确、可靠、快速、特异的检测方法,适合于大样品的快速筛选。常规的ELISA方法对IVM检测主要依赖于竞争ELISA法,尽管非竞争ELISA法相对于竞争法有更高的检测灵敏度,但是由于IVM分子量太小,阻碍其与两种抗体同时结合,所以这类检测方法不适合半抗原的测定。近年来,为解决这个问题,人们做了很多尝试,其中抗独特型和抗异型抗体为非竞争法应用于半抗原检测上提供了支持。为获取针对伊维菌素（IVM）的抗独特型抗体或抗异型抗体,制备针对IVM的兔多克隆抗体和鼠单克隆抗体,经纯化获得IVM兔多抗血清纯化抗体（PAb1）和鼠单抗腹水纯化抗体（MAb1）,将PAb1、MAb1分别加入含10μg／mL IVM的20%甲醇-PBS中,4℃反应24h,制备两种抗原抗体复合物,做为免疫原,分别免疫BALB／c小鼠,经对比发现,以PAb1与IVM反应制备的复合物为免疫原的免疫效果较好。选取适宜小鼠融合,通过对杂交瘤细胞的筛选,获得3株能稳定分泌抗IVM独特型抗体（Ab2）的细胞株,命名为Ab2-1、Ab2-2、Ab2-3。研究了Ab2的性质,结果表明,Ab2仅与针对IVM的抗体反应,且亲和性良好（K=5.04×1010L／mol）,与其它抗体交叉反应率较小,其具有很好的特异性。以IVM-OVA为包被原,MAb1为反应抗体,Ab2为竞争抗原,IC50=33.771μg／mL；以Ab2为包被原,MAb1为反应抗体,IVM为竞争抗原,IC50=0.4μg／mL,另外还得出线性良好的Ab2与IVM对应关系曲线y=1.9076X-6.4507,以上都表明了Ab2和IVM有很好的内影像关系,验证了Ab2属p独特型抗体。为建立小分子半抗原检测的竞争ELISA以Ab2β取代作为标准品的强毒性半抗原（如黄曲霉毒素、河豚毒素、吗啡等）,以及以抗独特型抗体建立小分子半抗原双位点法（非竞争）免疫检测打下了一定基础。本实验没有获得有效的IVM抗异型抗体。
舒震[9]（2010）在《血清中可溶性B7-H1检测方法的建立及临床意义研究》文中认为目的:B7-H1是B7共刺激分子家族的成员之一,在正常的组织表面几乎不表达,但在肿瘤组织确是高表达的,而且肿瘤组织表面的组成型B7-H1的表达还与肿瘤的发生发展及预后相关。B7-H1通过与其抑制性受体结合,分别在初始T细胞的初级反应阶段和活化阶段,记忆性T细胞的再次反应阶段起到重要的负性调节作用。B7-H1可诱导肿瘤抗原特异性CTL的凋亡,诱导肿瘤细胞的抗凋亡作用,在肿瘤的免疫逃逸、多药耐药、病毒感染、炎症、自身免疫疾病和移植物耐受等多种病理情况下发挥着重要作用,是肿瘤的潜在靶标和治疗靶点。由于目前对B7-H1的研究均限于细胞或组织表面组成型表达的B7-H1分子,而我们的预试验发现肿瘤患者血清中有可溶性B7-H1的表达,本课题拟通过证实血清中B7-H1可溶性片段的存在,探讨其功能和与肿瘤发生发展之间的相关性;由于市售抗B7-H1单抗仅有一种,我们通过制备B7-H1的单克隆抗体,建立较为简便的B7-H1的夹心ELISA血清学临床检测方法。方法:首先,我们通过B细胞杂交瘤技术制备鼠抗人B7-H1单克隆抗体,为检测血清中可溶性B7-H1片段奠定基础。然后,我们将SP2/0细胞皮下注射Babl/c小鼠,构建实体瘤模型,通过以下方法检测荷瘤小鼠的血清中可溶性B7-H1的表达:（1）采用Dot blot方法确定荷瘤小鼠血清中是否含有可溶性B7-H1;（2）采用Western blot方法鉴定可溶性B7-H1的分子量,以及其相对含量和小鼠荷瘤时间、瘤重的相关性,为研究肿瘤患者的可溶性B7-H1与其病程的相关性提供依据。最后,对肺癌患者血清及组织中可溶性和组成型的B7-H1进行了检测,包括:（1）采用Dot blot方法确定肺癌患者血清中是否含有可溶性B7-H1片段;（2）采用Western blot方法确定可溶性B7-H1片段的分子量;（3）建立可溶性B7-H1的夹心ELISA临床检测方法,并对10例肿瘤患者血清的可溶性B7-H1含量进行测定。（4）对肺癌病人的肿瘤组织进行免疫组化染色以确定其有组成型B7-H1的表达。结果:用人源性B7-H1IgV样区混合佐剂免疫Babl/c小鼠,最终获得了一株高亲和力的单克隆抗体。对荷瘤小鼠的血清检测结果:（1）Dot blot结果显示荷瘤小鼠血清中确含有可溶性B7-H1片段,且不同个体的含量不同;（2）Western blot结果显示,可溶性片段的分子量约为37kD,但其相对含量与荷瘤时间和瘤重无明显相关性。对肺癌患者血清和肿瘤组织的检测:（1）Dot blot结果显示肺癌患者血清中确含有可溶性B7-H1片段,且不同个体的含量不同;（2）Western blot结果显示,可溶性片段的分子量约为42kD;（3）建立了夹心ELISA检测血清中可溶性B7-H1含量的检测方法,并分析10例患者血清中可溶性B7-H1的含量,但由于缺少临床病例资料,暂时还无法对此含量和癌症发生发展的关系作出评价;（4）对采血对象的肿瘤组织免疫组化结果显示,肿瘤组织胞浆中有组成型的B7-H1表达。结论:成功地制备了一株单克隆抗体。建立了血清可溶性B7-H1的检测方法,并成功证实了可溶性B7-H1片段的存在,为临床检测奠定了基础。可溶性B7-H1与肿瘤发生发展以及预后的相关性仍需进一步研究。
杨福贵,黄瑞健,强华,张良成[10]（2010）在《小鼠异位心脏移植模型的初步实验观察》文中研究表明目的总结一种改良的小鼠心脏移植模型的初步体会。方法取出生24h之内的小鼠的心脏移植于成年小鼠耳后皮下,观察手术后移植心的存活率情况。结果初期实验取得的结果尚可,同系心脏移植存活率达80%,同种异体移植存活率达63.6%。结论该改进型小鼠耳后心脏移植模型不需显微操作,具有操作简单易行,便于监测的优点,值得推广。
二、抗独特型抗体对小鼠心肌移植耐受的诱导作用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、抗独特型抗体对小鼠心肌移植耐受的诱导作用（论文提纲范文）
（1）丹参提取物对川崎病模型小鼠心肌组织的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 实验结果(附论文图片) |
| 1. 小鼠一般状态 |
| 2. 小鼠心脏组织形态学变化 |
| 3. 各组小鼠血清肌酸激酶(CK)活性结果 |
| 4. 各组小鼠血清血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)活性结果 |
| 5. 各组小鼠血清乳酸脱氢酶(LDH)活性结果 |
| 6. 各组小鼠血清α-羟丁酸脱氢酶(α-HBDH)活性结果 |
| 7. 各组小鼠血清谷草转氨酶(AST)活性结果 |
| 8. 各组小鼠血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平结果 |
| 9. 各组小鼠白细胞介素 6(IL-6)水平结果 |
| 10. 各组小鼠白细胞介素 1β(IL-1β)水平结果 |
| 讨论 |
| 1 造模方法 |
| 2 实验指标与 KD-CAL 心肌组织损伤 |
| 3 实验药物的相关药理作用 |
| 小结 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 川崎病血管损伤的中西医研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
（2）益气补肾中药对自然流产模型小鼠脾脏Treg细胞中foxp3mRNA表达及蜕膜组织STAT5mRNA等表达的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 自然流产小鼠模型的建立及对胚胎吸收率的分析 |
| 一、材料 |
| (一) 实验动物 |
| (二) 实验药品 |
| 1 益气补肾实验方 |
| 2 CSA溶液 |
| 3 0.9%NS |
| (三) 实验仪器 |
| 二、实验方法 |
| (一) 实验动物分组 |
| (二) 实验动物模型建立 |
| (三) 实验动物胚胎吸收率计算 |
| (四) 统计学处理 |
| 三、结果 |
| 第二部分 益气补肾中药对自然流产模型小鼠脾脏Treg细胞中foxp3mRNA表达的实验研究 |
| 一、材料 |
| (一) 实验动物 |
| (二) 实验药品 |
| (三) 实验室 |
| (四) 实验试剂 |
| (五) 实验设备和器材 |
| 二、实验方法及步骤 |
| (一) 自然流产模型小鼠的建立 |
| (二) 实验动物分组 |
| (三) 实验步骤 |
| 1 小鼠脾脏单个核细胞的分离 |
| 2 磁珠分选CD4~+CD25~+T细胞 |
| 3 流式鉴定 |
| 4 RT-PCR法检测Treg细胞内foxp3mRNA的表达 |
| 三、结果 |
| (一) 免疫磁珠分选法分离和纯化小鼠脾脏CD4~+CD25~+T细胞 |
| (二) RT-PCR法检测自然流产模型小鼠脾脏Treg中foxp3mRNA的表达 |
| 第三部分 益气补肾中药对自然流产模型小鼠蜕膜组织foxp3mRNA、STAT5AmRNA、STAT5BmRNA、NF-κBmRNA表达的研究 |
| 一、材料 |
| (一) 实验动物 |
| (二) 实验标本 |
| (三) 实验药品 |
| (四) 实验试剂 |
| (五) 实验仪器 |
| 二、实验方法及步骤 |
| (一) 自然流产模型小鼠的建立 |
| (二) 实验动物分组 |
| (三) 实验步骤 |
| 三、结果 |
| 分析与讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 致谢 |
| 附：文献综述 |
| 参考文献 |
（3）Her-2/neu抗独特型单克隆抗体的制备和初步研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（4）沉默RelB的树突状细胞诱导移植免疫耐受（论文提纲范文）
| 论文的创新点 |
| 目录 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语词汇表 |
| 引言 |
| 第一部分 沉默DC中RelB表达展现耐受性DC特性 |
| 一、前言 |
| 二、实验仪器、材料与方法 |
| 三、实验结果 |
| 附图 |
| 第二部分 RelB沉默的DC诱导同种T细胞低反应性研究 |
| 一、前言 |
| 二、实验材料与方法 |
| 三、实验结果 |
| 附图 |
| 第三部分 移植前输注RelB shRNA-DC诱导移植免疫耐受 |
| 前言 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 博士期间发表的科研成果 |
| 后记 |
（5）人源S100A1和S100B全基因合成、表达、单抗制备及其活性分析（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 1 S100蛋白家族 |
| 2 S100A1蛋白 |
| 3 S100B蛋白 |
| 研究思路 |
| 技术路线 |
| 第一部分 人源 S100A1 和 S100B 全基因合成和优化、表达、 纯化与鉴定 |
| 技术路线 |
| 实验一 人源S100A1 全基因合成和优化、表达、纯化与鉴定 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 质粒与菌株 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.1.4 主要培养基及溶液配制 |
| 1.2 主要实验方法 |
| 1.2.1 感受态细菌的制备方法 |
| 1.2.2 转化方法 |
| 1.2.3 胶回收步骤 |
| 1.2.4 质粒小量提取 |
| 1.2.5 人源S100A1 序列的优化设计与引物合成 |
| 1.2.6 PCR 合成优化后人源S100A1 序列 |
| 1.2.7 克隆载体pMD18-S100A1 构建 |
| 1.2.8 表达载体pBV220-S100A1 构建 |
| 1.2.9 重组蛋白诱导表达 |
| 1.2.10 重组蛋白鉴定 |
| 1.2.10.1 SDS-PAGE 鉴定 |
| 1.2.10.2 Western Blotting 鉴定 |
| 1.2.11 重组S100A1 蛋白纯化 |
| 1.2.12 重组S100A1 蛋白脱盐与冻干 |
| 2. 结果 |
| 2.1 优化后人源S100A1 序列 |
| 2.2 合成序列PCR 结果 |
| 2.3 克隆载体pMD18-S100A1 鉴定 |
| 2.4 人源S100A1 合成序列测序结果 |
| 2.5 表达载体pBV220-S100A1 鉴定 |
| 2.6 人源S100A1 蛋白诱导表达与表达形式分析 |
| 2.7 重组S100A1 蛋白鉴定 |
| 2.8 重组蛋白纯化 |
| 3. 小结 |
| 实验二人源S100B 全基因合成和优化、表达、纯化与鉴定 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 质粒与菌株 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.2 主要实验方法 |
| 1.2.1 感受态细菌的制备方法 |
| 1.2.2 转化方法 |
| 1.2.3 胶回收步骤 |
| 1.2.4 质粒小量提取 |
| 1.2.5 人源S100B 序列优化设计与引物合成 |
| 1.2.6 PCR 合成优化后人源S100B 序列 |
| 1.2.7 克隆载体pMD18-S100B 构建 |
| 1.2.8 表达载体pET32a-S100B 构建 |
| 1.2.9 重组蛋白诱导表达 |
| 1.2.10 重组蛋白鉴定 |
| 1.2.11 重组蛋白纯化 |
| 1.2.12 重组S100B 蛋白脱盐与冻干 |
| 2. 结果 |
| 2.1 优化后人源S100B 序列 |
| 2.2 合成序列PCR 结果 |
| 2.3 克隆载体pMD18-S100B 鉴定 |
| 2.4 人源S100B 合成序列测序结果 |
| 2.5 表达载体pET32a-S100B 鉴定 |
| 2.6 人源S100B 蛋白诱导表达与表达形式分析 |
| 2.7 重组S100B 蛋白鉴定 |
| 2.8 重组蛋白纯化 |
| 3. 小结 |
| 4. 讨论 |
| 第二部分：人源S100A1和S100B 蛋白促Hela 细胞侵袭迁移研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验细胞 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.1.4 细胞培养用试剂 |
| 1.2 主要实验方法 |
| 1.2.1 Transwell 侵袭实验 |
| 1.2.2 Transwell 迁移实验 |
| 1.2.3 细胞冻存和复苏 |
| 2. 结果 |
| 2.1 人源S100A1 蛋白Transwell 侵袭实验 |
| 2.2 人源S100A1 蛋白Transwell 迁移实验 |
| 2.3 人源S100B 蛋白Transwell 侵袭实验 |
| 2.4 人源S100B 蛋白Transwell 迁移实验 |
| 3. 小结 |
| 4. 讨论 |
| 第三部分 单克隆抗体的制备及纯化 |
| 技术路线 |
| 实验一 抗人S100A1 单克隆抗体的制备及纯化 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验动物及细胞 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.2 主要溶液配制 |
| 1.2.1 抗体纯化相关试剂配制 |
| 1.2.2 SDS-PAGE 相关溶液配制 |
| 1.2.3 ELISA 相关溶液配制 |
| 1.2.4 细胞培养用试剂配制 |
| 1.3 主要实验方法 |
| 1.3.1 动物免疫 |
| 1.3.2 实验动物血清效价测定 |
| 1.3.3 骨髓瘤细胞复苏和培养 |
| 1.3.4 饲养层细胞制备 |
| 1.3.5 脾淋巴细胞制备 |
| 1.3.6 细胞融合 |
| 1.3.7 阳性克隆筛选 |
| 1.3.8 阳性克隆克隆化培养 |
| 1.3.9 杂交瘤细胞冻存与复苏 |
| 1.3.10 单克隆抗体特异性检测 |
| 1.3.11 杂交瘤细胞分泌特异性抗体稳定性检测 |
| 1.3.12 腹水制备 |
| 1.3.13 腹水单克隆抗体纯化 |
| 1.3.14 单克隆抗体蛋白浓度测定 |
| 1.3.15 单克隆抗体亲和常数测定 |
| 1.3.16 单克隆抗体保存 |
| 2 结果 |
| 2.1 小鼠免疫结果 |
| 2.2 细胞融合及阳性杂交瘤筛选 |
| 2.3 腹水效价测定 |
| 2.4 杂交瘤细胞分泌抗体稳定性测定结果 |
| 2.5 单克隆抗体纯化结果鉴定及定量 |
| 2.6 单克隆抗体特异性检测 |
| 2.7 单克隆抗体亲和常数测定 |
| 3. 小结 |
| 实验二 抗人S100B 单克隆抗体的制备及纯化 |
| 1. 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 小鼠免疫结果 |
| 2.2 细胞融合及阳性杂交瘤筛选 |
| 2.3 腹水效价测定 |
| 2.4 杂交瘤细胞分泌抗体稳定性测定结果 |
| 2.5 单克隆抗体纯化结果鉴定及定量 |
| 2.6 单克隆抗体特异性鉴定 |
| 2.7 单克隆抗体亲和常数测定 |
| 3. 小结 |
| 4. 讨论 |
| 第四部分 抗人S100A1和S100B蛋白单克隆抗体的活性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 细胞 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.2 主要实验方法 |
| 1.2.1 细胞增殖检测 |
| 1.2.2 细胞凋亡率检测 |
| 1.2.3 细胞中蛋白表达检测 |
| 1.2.4 细胞全蛋白制备 |
| 1.3 统计分析 |
| 2. 结果 |
| 2.1 抗人S100A1 单克隆抗体对A375 细胞增殖的影响 |
| 2.2 抗人S100A1 单克隆抗体对A375 细胞凋亡的影响 |
| 2.3 A375 细胞中S100A1 和P53 蛋白表达 |
| 2.4 抗人S100B 单克隆抗体对A375 细胞增殖的影响 |
| 2.5 抗人S100B 单克隆抗体对A375 细胞凋亡的影响 |
| 2.6 A375 细胞中S100B 和P53 蛋白表达 |
| 3. 小结 |
| 4. 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 在学期间参与课题、发表文章及获奖情况 |
| 质粒图谱 |
（6）西咪替丁对日本血吸虫DNA疫苗免疫保护作用的影响及其机制研究（论文提纲范文）
| 主要缩略词 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 西咪替丁对日本血吸虫感染小鼠免疫应答的影响研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 西咪替丁和日本血吸虫pEGFP-Sj26GST DNA疫苗联合使用的免疫保护作用研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 西咪替丁增强日本血吸虫pEGFP-Sj26GST DNA疫苗的免疫保护作用的机制研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录1 实验材料及仪器 |
| 附录2 攻读学位期间撰写的论文 |
| 致谢 |
（7）CTLA4Ig、ICOSIg联合雷帕霉素对心脏移植排斥的影响（论文提纲范文）
| 英文缩略词 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 小鼠耳后心脏移植模型的建立 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 CTLA4Ig 联合雷帕霉素对小鼠心脏移植排斥的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 CTLA419、ICOSIg 联合雷帕霉素对心脏移植排斥的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（8）伊维菌素抗独特型和抗异型抗体的制备及鉴定（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 目录 |
| 符号说明 |
| 第一部分 前言 |
| 1 伊维菌素及其残留的免疫学检测 |
| 1.1 伊维菌素的理化性质 |
| 1.2 伊维菌素残留免疫学检测 |
| 2 抗独特型抗体和抗异型抗体 |
| 2.1 抗独特型抗体 |
| 2.2 抗异型抗体 |
| 3 本研究的目的、意义及思路、技术路线 |
| 第二部分 伊维菌素抗体的制备及鉴定 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验动物与生物材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 主要溶液系统 |
| 1.5 伊维菌素抗体的制备及鉴定 |
| 1.6 抗体蛋白浓度的测定 |
| 1.7 ELISA检测抗体方法的建立 |
| 1.8 抗体效价及抑制测定 |
| 1.9 抗体特异性鉴定 |
| 1.10 抗体亲和力的测定 |
| 1.11 伊维菌素抗体的纯化及鉴定 |
| 2 结果和分析 |
| 2.1 抗体蛋白质浓度 |
| 2.2 抗体效价及抑制 |
| 2.3 抗体特异性鉴定 |
| 2.4 抗体亲和力的测定 |
| 2.5 伊维菌素抗体的纯化及鉴定 |
| 3 讨论 |
| 第三部分 伊维菌素抗独特型或抗异型抗体的制备 |
| 1 材料方法 |
| 1.1 实验动物与生物材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 仪器和器材 |
| 1.4 主要溶液系统 |
| 1.5 伊维菌素抗异型和抗独特型抗体的制备 |
| 1.6 抗独特型抗体特性的纯化及特性鉴定 |
| 2 结果和分析 |
| 2.1 摸索抗血清与药物反应的最适条件 |
| 2.2 不同浓缩条件对抗原抗体复合物的影响 |
| 2.3 封闭条件的摸索 |
| 2.4 免疫后小鼠效价的测定 |
| 2.5 细胞融合及筛选鉴定 |
| 2.6 抗独特型抗体特性的鉴定 |
| 3 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（9）血清中可溶性B7-H1检测方法的建立及临床意义研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 正文 |
| 第一部分 单克隆抗体的制备和鉴定 |
| 引 言 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 第二部分 荷瘤小鼠血清中可溶性B7-H1的检测 |
| 引言 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 第三部分 肺癌患者血清中可溶性B7-H1的检测及临床检测方法的建立 |
| 引言 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（10）小鼠异位心脏移植模型的初步实验观察（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验动物: |
| 1.1.2 试剂: |
| 1.1.3 主要仪器: |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 实验分组: |
| 1.2.2 模型建立方式: |
| 1.2.3 术后处理与观察: |
| 2 结果 |
| 2.1 同系移植 |
| 2.2 同种异体移植 |
| 2.3 实验结果表明 |
| 3 讨论 |
四、抗独特型抗体对小鼠心肌移植耐受的诱导作用（论文参考文献）
- [1]丹参提取物对川崎病模型小鼠心肌组织的作用及机制研究[D]. 秦璨. 辽宁中医药大学, 2020(02)
- [2]益气补肾中药对自然流产模型小鼠脾脏Treg细胞中foxp3mRNA表达及蜕膜组织STAT5mRNA等表达的实验研究[D]. 鲁颖晔. 浙江中医药大学, 2014(05)
- [3]Her-2/neu抗独特型单克隆抗体的制备和初步研究[D]. 薛洋. 第四军医大学, 2013(02)
- [4]沉默RelB的树突状细胞诱导移植免疫耐受[D]. 邱涛. 武汉大学, 2013(07)
- [5]人源S100A1和S100B全基因合成、表达、单抗制备及其活性分析[D]. 刘子泉. 中国人民解放军军事医学科学院, 2011(07)
- [6]西咪替丁对日本血吸虫DNA疫苗免疫保护作用的影响及其机制研究[D]. 李曼君. 华中科技大学, 2011(09)
- [7]CTLA4Ig、ICOSIg联合雷帕霉素对心脏移植排斥的影响[D]. 杨福贵. 福建医科大学, 2011(10)
- [8]伊维菌素抗独特型和抗异型抗体的制备及鉴定[D]. 薄智勇. 扬州大学, 2010(02)
- [9]血清中可溶性B7-H1检测方法的建立及临床意义研究[D]. 舒震. 第四军医大学, 2010(06)
- [10]小鼠异位心脏移植模型的初步实验观察[J]. 杨福贵,黄瑞健,强华,张良成. 海峡药学, 2010(03)